समर्थित लिपिड बाइलेयर पर मेम्ब्रेन-टेथर्ड मिनिमल एक्टिन कॉर्टिक्स का पुनर्गठन

यहां, हम झिल्ली-टेथर्ड एक्टोमायोसिन नेटवर्क को इकट्ठा करने और उन्नत प्रकाश सूक्ष्म तकनीकों का उपयोग करके गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और सीधी प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं। मुख्य लाभ यह है कि हमारी परख झिल्ली-टेथर्ड नेटवर्क को परेशान किए बिना प्रोटीन और छोटे अणुओं के अनुक्रमिक जोड़ की अनुमति देती है। इस विधि को आसानी से अन्य साइटोस्केलेटल प्रोटीन या समग्र नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा यह सुनिश्चित करना है कि समर्थित लिपिड बाइलेयर सही ढंग से बनता है, इसलिए पहले, हमें साइटोस्केलेटल प्रोटीन जोड़ना शुरू करने से पहले इस चरण को मास्टर करना पड़ा। शुरू करने के लिए, तीन से पांच आयताकार ग्लास कवरलिप लें और उन्हें कोप्लिन जार के अंदर रखें। स्नान सोनिकेटर चालू करें, और तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।

कवरलिप्स को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए कोप्लिन जार को 2% सफाई समाधान के साथ भरें, और इसे पूर्ण पल्स मोड पर 30 मिनट के लिए सोनिकेटर में रखें। कवरलिप्स को एक-एक करके हटाने के लिए कुंद पीटीएफई लेपित बल का उपयोग करें। उन्हें आसुत जल से अच्छी तरह से धो लें, और उन्हें दो सामान्य सोडियम हाइड्रॉक्साइड से भरे एक अन्य कोप्लिन जार में रखें।

पूर्ण पल्स मोड पर 20 मिनट के लिए कवरलिप्स को सोनिकेट करें। कवरलिप्स को हटा दें, आसुत पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें, और आसुत पानी से भरे एक अन्य कोप्लिन जार में रखें। प्रयोग शुरू करने से पहले, जार को नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति के साथ लगे रासायनिक हुड में लें।

नाइट्रोजन स्ट्रीम के नीचे उन्हें सुखाने के लिए कवरलिप्स को हटाने के लिए दस्ताने और फोर्स का उपयोग करें। दोनों किनारों को सुखाएं, और उन्हें कवर के साथ एक साफ प्लास्टिक ग्रिड पर रखें। धूल के कणों के संपर्क से बचने के लिए कवरलिप्स के साथ बॉक्स को एक डेसिकेटर में रखें, फिर ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब लें और एक तेज सर्जिकल ब्लेड के साथ अपने ढक्कन और निचले शंक्वाकार हिस्सों को काट दें।

बेलनाकार आधा कट ट्यूब लें, प्रत्येक कट ट्यूब के चिकनी रिम पर यूवी इलाज योग्य चिपकने वाला लागू करें, और इसे ताजा साफ किए गए कवरस्लिप पर उल्टा रखें ताकि रिम कवरस्लिप पर सपाट बैठे। कवरस्लिप पर स्थित होने के बाद सिलेंडर को पार्श्व रूप से न ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि गोंद कक्ष के केंद्रीय स्थान में न फैले। ऑक्सीजन की आपूर्ति और वैक्यूम के साथ यूवी ओजोन क्लीनर के अंदर चैंबर वाले कवरलिप्स रखें।

यूवी प्रकाश चालू करें और चिपकने वाले को बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए तीन से पांच मिनट तक रोशन करें। कवरलिप्स को बाहर निकालें और रिसाव के लिए कक्षों का परीक्षण करें, और रिसाव कक्षों को छोड़ दें। प्रत्येक कक्ष को एसएलबी गठन बफर के साथ धोएं, अंत में बफर के 100 माइक्रोलीटर छोड़ दें।

एक स्थायी मार्कर के साथ 100 माइक्रोलीटर पर बफर के स्तर को चिह्नित करें, फिर कक्ष में 0.1 मोलर कैल्शियम क्लोराइड के दो माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद प्रत्येक कक्ष में एसयूवी समाधान के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एसएलबी गठन बफर के 50 माइक्रोलीटर निकालें, नमूना कक्ष में केवल 50 माइक्रोलीटर छोड़ दें, फिर कक्ष में एक एक्सकेएमईएच के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से मिलाएं। नीचे को छूने के बिना बफर के 100 माइक्रोलीटर निकालें।

एक XKMEH के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर और 100 माइक्रोलीटर हटाकर वॉश को आठ से 10 बार दोहराएं। बाइलेयर में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बीटा-कैसिइन के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर पांच से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बीटा-कैसिइन को एक एक्सकेएमईएच के साथ तीन बार धो लें, और बफर स्तर को 100 माइक्रोलीटर मार्क पर वापस लाएं।

बीटा-कैसिइन इनक्यूबेशन के दौरान, माइनस 80 डिग्री सेल्सियस के लिए मेम्ब्रेन-एक्टिन लिंकर प्रोटीन का एक एलिकोट निकालें, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से पिघल जाए, और फिर इसे बर्फ पर रखें। प्रोटीन कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ एलिकोट को एक माइक्रोमोलर की एकाग्रता में पतला करें। एक परिभाषित अंतिम एकाग्रता पर समाधान में लिंकर प्रोटीन जोड़ें और धीरे से मिलाएं।

कमरे के तापमान पर 30 से 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और अनबाउंड एचएसई प्रोटीन को हटाने के लिए एक एक्सकेएमईएच बफर के साथ तीन से पांच बार धोएं। प्रत्येक कक्ष में बफर स्तर को 100 माइक्रोलीटर के निशान पर वापस लाएं। नमूना अब इमेजिंग के लिए तैयार है।

माइक्रोस्कोप, उत्तेजना लेजर और डिटेक्शन कैमरों को चालू करें। सुनिश्चित करें कि लेजर संरेखित है, उद्देश्य साफ किया गया है, और सॉफ्टवेयर छवियों को प्राप्त करने के लिए तैयार है। 100 गुना उद्देश्य पर तेल डालें, माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना माउंट करें, और बाईलेयर पर उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करें।

सुनिश्चित करें कि लेजर की स्थिति ऐसी है कि यह नमूने पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब से गुजरता है। 488 नैनोमीटर उत्तेजना का उपयोग करें। बाईलेयर की अखंडता निर्धारित करने के लिए, बाईलेयर पर रुचि के क्षेत्र का चयन करके और इमेजिंग स्थितियों का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र की कुछ छवियों को रिकॉर्ड करके एक त्वरित एफआरएपी परख करें जो पांच से एक या उससे अधिक के शोर अनुपात को संकेत प्रदान करते हैं।

रिकॉर्डिंग को रोकें, और स्थानीय रूप से फ्लोरोफोरेस को ब्लीच करने के लिए बाईलेयर के एक छोटे से गोलाकार क्षेत्र पर एक केंद्रित लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के क्षेत्र डायाफ्राम को बंद करें। तीन से 10 सेकंड के लिए छोटे क्षेत्र को फोटोब्लीच करने के लिए लेजर को अपने अधिकतम आउटपुट पर चालू करें, और फिर लेजर को बंद करें। क्षेत्र डायाफ्राम को उसके मूल त्रिज्या में फिर से खोलें, इमेजिंग स्थिति को पूर्व-ब्लीच सेटिंग्स में वापस लाएं, और तुरंत दृश्य के क्षेत्र में फ्लोरोसेंट सिग्नल की वसूली को रिकॉर्ड करना फिर से शुरू करें।

जांचें कि क्या बाइलेयर तरल पदार्थ है, और छवियों को 16 बिट डॉट टीआईएफ फ़ाइलों के रूप में सहेजें। 10 से एक मोलर अनुपात में अनलेबल और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जी-एक्टिन को मिलाएं, और इसे जी-बफर के साथ ऊपर उठाएं ताकि जी-एक्टिन की एकाग्रता 20 माइक्रोमोलर हो। एक बार के समाधान के लिए मिश्रण में 10 गुना एमई बफर का दसवां हिस्सा जोड़ें, और कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से कैपिंग प्रोटीन स्टॉक की शीशी को पिघलाएं, और फिर इसे बर्फ पर रखें। जी-बफर के साथ पतला करें जैसे कि कैपिंग प्रोटीन की एकाग्रता अब इसकी वांछित अंतिम एकाग्रता से दोगुनी है, फिर एक्टिन मिश्रण में पतला कैपिंग प्रोटीन समाधान की समान मात्रा जोड़ें। अंत में, प्रतिक्रिया मिश्रण में ताजा दो गुना लक्ष्य बफर की समान मात्रा जोड़ें।

समाधान की अंतिम मात्रा एक्टिन मिश्रण की मात्रा का चार गुना होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि घटकों की अंतिम एकाग्रता पाठ पांडुलिपि में वर्णित है। पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 45 से 60 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूने को इनक्यूबेट करें।

धीरे से एक कुंद अंत पिपेट टिप के साथ पांच माइक्रोमोलर पॉलीमराइज्ड एक्टिन को बाहर निकालें, और इसे एक साफ ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। अंतिम मात्रा को 20 माइक्रोलीटर से अधिक बनाने के लिए ट्यूब में एक एक्सकेएमईएच जोड़ें, और एफ-एक्टिन को कतरने से बचने के लिए धीरे से मिलाएं। माउंटेड नमूना कक्ष से, बफर की एक समान मात्रा को हटा दें।

कक्ष में बहुलककृत एक्टिन समाधान जोड़ें, और नीचे बाईलेयर को छूने के बिना धीरे-धीरे ऊपर और नीचे तीन बार पिपेट करें। टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप पर नमूने को माउंट करें, और इसे 20 से 30 मिनट तक आराम करने दें। एफ-एक्टिन अतिरिक्त स्थिर स्थिति में पहुंचने के बाद दृश्य के विभिन्न क्षेत्रों से कुछ छवियों को रिकॉर्ड करें।

एक्टिन इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, नमूने को माइक्रोस्कोप पर वापस माउंट करें। लिंकर प्रोटीन और एफ-एक्टिन चैनलों पर सिग्नल की जांच करें। यदि आवश्यक हो तो इमेजिंग स्थितियों को समायोजित करें।

लंबे समय-अंतराल रिकॉर्डिंग के लिए एक अच्छे क्षेत्र का चयन करें। मायोसिन जोड़ने से पहले 0.1 से 0.2 हर्ट्ज पर 10 से 15 फ्रेम रिकॉर्ड करें, और रिकॉर्डिंग को रोकें। पिपेट ने स्टॉक शीशी से पुनर्नवीनीकरण मांसपेशी मायोसिन दो की आवश्यक मात्रा को एक कुंद अंत पिपेट टिप के साथ बाहर निकाला, और एक साफ ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब में जोड़ा।

वॉल्यूम को 20 माइक्रोलीटर से अधिक बनाने के लिए तुरंत ट्यूब में एक एक्सकेएमईएच जोड़ें, और धीरे से मिलाएं। इसे परेशान किए बिना माउंटेड नमूना कक्ष से केएमईएच बफर की एक समान मात्रा को सावधानीपूर्वक हटा दें, और धीरे से नमूना कक्ष में मायोसिन समाधान जोड़ें। ऊपर और नीचे पिपेट न करें, क्योंकि यह सतह से बंधे फिलामेंट्स को परेशान करेगा।

तुरंत टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग को फिर से शुरू करें, और सभी छवियों को सहेजें, फिर बफर केवल नमूने का उपयोग करके सभी चैनलों के लिए पृष्ठभूमि छवियां लें। सभी छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में सहेजें। प्रसार गुणांक का फिट किया गया मूल्य 1.34 वर्ग माइक्रोमीटर प्रति सेकंड था, जो 1.39 वर्ग माइक्रोमीटर प्रति सेकंड के सूत्र-आधारित गणना मूल्य के साथ निकटता से सहमत था।

फोटोब्लीचिंग के बाद लाइन प्रोफाइल और प्रक्षालित क्षेत्र की रिकवरी प्रोफाइल क्रमशः समीकरण चार और पांच फिट करती है। ब्लीच की गई आबादी के अंश का प्रतिनिधित्व करने वाले लिपिड बाइलेयर का मोबाइल अंश जो वापस ठीक हो जाता है, 0.9 से अधिक था, जो एक अच्छा लिपिड बाइलेयर दर्शाता है। मायोसिन गतिविधि ने सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन प्रवाह को प्रेरित किया जो स्थिर अवस्था में एस्ट्रो जैसी संरचनाओं में उभरा, जिससे युग्मित झिल्ली घटक के स्थानीय क्लस्टरिंग का पता चला।

कोई भी किसी भी फोटो क्षति को प्रेरित किए बिना अनलेबल एक्टोमायोसिन नेटवर्क की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी जैसी विभिन्न प्रकार की माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग कर सकता है, या सुपर रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकता है। यह तकनीक शोधकर्ताओं के लिए यह समझने का मार्ग प्रशस्त करती है कि झिल्ली प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अपनी वास्तुकला और संरचना को संशोधित करने के लिए एक गतिशील एक्टोमायोसिन नेटवर्क के साथ कैसे बातचीत करते हैं।