La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

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Biology

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Summary

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

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Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

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Abstract

Studiare l'interazione proteina-lipide in modo riduttivo, è necessario incorporare le proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben definita. Stiamo studiando gli effetti di gating lipidi-dipendenti in un potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canale di prototipo, e abbiamo lavorato procedure dettagliate per ricostituire i canali in diversi sistemi a membrana. Nostre procedure ricostituzione tengono conto sia della fusione detergente indotta di vescicole e la fusione di proteina / detergente micelle con i lipidi / detergente micelle miste nonché l'importanza di raggiungere una distribuzione di equilibrio di lipidi tra le proteine ​​/ detergente / lipidi e il detersivo / lipidi micelle miste. I nostri dati suggeriscono che l'inserimento di canali nei vescicole lipidiche è relativamente casuale in orientamenti, e l'efficienza di ricostituzione è così alto che non rilevabili aggregati proteici sono stati osservati in esperimenti di frazionamento. Abbiamo utilizzato il ricostituired canali per determinare gli stati conformazionali dei canali in differenti lipidi, registrare attività elettrica di un piccolo numero di canali incorporate in bistrati lipidici planari, schermo per ligandi conformazione-specifici da una libreria peptidica fago visualizzato, e sostenere la crescita dei cristalli 2D dei canali in membrane. Le procedure descritte qui di ricostituzione possono essere adeguati per lo studio di altre proteine ​​di membrana in doppi strati lipidici, in particolare per l'indagine degli effetti dei lipidi sui canali ionici voltaggio-dipendenti eucariotiche.

Introduction

Celle scambiare materiali e informazioni con l'ambiente attraverso le funzioni delle proteine ​​di membrana specifici 1. Le proteine ​​di membrana nelle membrane cellulari funzionano come pompe, canali, recettori, enzimi intramembrane, linker e sostenitori strutturali attraverso le membrane. Le mutazioni che influenzano le proteine ​​di membrana sono stati legati a molte malattie umane. Infatti, molte proteine ​​di membrana sono stati gli obiettivi farmacologici primari perché sono importanti e facilmente accessibili nelle membrane cellulari. È quindi molto importante per comprendere la struttura e funzione di varie proteine ​​di membrana nelle membrane, e consentire di escogitare nuovi metodi per alleviare gli effetti negativi delle proteine ​​mutanti in malattie umane.

Lipidi circondano tutte le proteine ​​di membrana integrati in doppi strati 2, 3. In membrane eucariotiche, i vari tipi di lipidi sono noti come organizzato in microdomini 4, 5.Molte proteine ​​di membrana sono stati mostrati essere distribuite tra questi microdomini nonché la fase fluida ingombrante di membrane 3, 6. Il meccanismo alla base l'organizzazione dei microdomini e la consegna di proteine ​​di membrana in loro e il significato fisiologico di tali distribuzioni sono chiaramente importanti, ma rimangono poco conosciute. Una delle principali difficoltà tecnica a studiare gli effetti dei lipidi sulle proteine ​​di membrana è la ricostituzione affidabile di biochimicamente purificata proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben controllati in modo che quasi tutte le proteine ​​ricostituite sono funzionali 7. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per ricostituire il prototipo di canale del potassio voltaggio-dipendente da A. Pernix (KvAP) nei vari sistemi a membrana per gli studi 8-10 strutturali e funzionali. I dati da altri e noi insieme hanno mostrato che i lipidi sono probabili un determinante nei cambiamenti conformazionali del rilevamento della tensionedomini di un canale e ionici voltaggio-dipendenti possono modellare le strutture di alcuni di questi canali 11. Nel prossimo, ci fornirà una descrizione dettagliata dei nostri metodi e offrirà suggerimenti tecnici critici che probabilmente garantire il successo riproduttivo dei nostri risultati, nonché l'estensione dei nostri metodi per gli studi di altre proteine ​​di membrana.

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Protocol

1. Espressione e purificazione di KvAP Canale (Figura 1)

  1. Preparazione lavoro - Giorno 0
    1. Sciacquare i flaconi di vetro per la coltura batterica con acqua deionizzata (diH 2 O) e MilliQ H 2 O (MQH 2 O) per rimuovere tracce di detersivo da lavastoviglie generale.
    2. Autoclave 1000 ml di mezzo LB in 2.8 L Erlenmeyer (totale due litri cultura come un esempio qui). Bassa durezza dell'acqua è risultato essere importante per la coltura positiva dei batteri trasformati.
    3. Autoclave 100 ml di terreno LB in flaconi da 500 ml
    4. Trasforma 60 microlitri di cellule competenti XL1-Blue con 200 ng del pQE60 plasmide contenente il gene per KvAP con un sito di taglio della trombina e una sua etichetta 6 al suo C-terminale, piastra i batteri su due piastre di LB-agar contenenti 100 mg / ml di ampicillina, e incubare per 14-16 ore a 37 ° C incubatore.
  2. Espressione di KvAP - Giorno 1
    1. Controllare l'applicazioneearance delle colonie batteriche sulle piastre dopo incubazione overnight. Le colonie erano di solito solo circa 0,2-0,5 mm di diametro, e c'erano un sacco di loro. Non vogliamo che i piatti che ospitano grandi colonie circondate da un sacco di colonie satelliti.
    2. Aggiungere 5,0 ml di terreno LB per ogni piastra LB-agar incubate durante la notte e rottami fuori le colonie. Trasferire la sospensione batterica in 100 ml di terreno LB autoclave in un pallone da 500 ml. Aggiungi ampicillina ad una concentrazione finale di 100 pg / ml, incubare la coltura piccola per ~ 1 ora a 37 ° C o fino a OD600 raggiunge 0,60.
    3. Nel frattempo, posto due palloni con 1,0 L media in un 37 ° C agitando incubatore per scaldare il mezzo, e preparare 20 ml di BaCl 2 (1,0 M; concentrazione finale 10 mm in ogni cultura L 1.0), 2,0 ml di 0,4 M IPTG (isopropil-tio-β-galattoside) e 2,0 ml di 100 mg / ml di ampicillina magazzino in acqua.
    4. Una volta che la piccola cultura è pronto, aggiungere 10 ml di BaCl 2, 1,0 ml di ampicillin magazzino, e 50 ml di piccola cultura dal punto 1.2.2 ai media LB preriscaldate. OD600 dovrebbe essere intorno a 0,05. Guardare per possibili precipitazioni a causa dell'elevata durezza dell'acqua e le contro ioni nei media LB. Ba 2 + è noto per legarsi al dominio poro del canale del potassio e blocca la corrente ionica, e quindi diminuisce la tossicità dell'espressione elevato livello di canali agli batteri.
    5. Prendere OD600 ogni ora fino a raggiungere 0,70, e ogni quindici minuti fino a raggiungere 0,8-0,9. Nel nostro set-up, di solito ci vogliono ~ 5 ore per raggiungere 0,8.
    6. Aggiungere 0,40 mM IPTG per avviare l'espressione indotta di proteina di canale, e incubare la coltura per un'altra 4.0 ore a 37 ° C con 225 giri agitazione.
    7. Batteri raccolto in bottiglie da centrifuga 1,0 litri di filatura a 4.000 xg, 4,0 ° C per 15 min. Decantare il surnatante, per quanto possibile in un bicchiere di rifiuti, aggiungere 10 ml di 1,0 M tampone Na-fosfato per far precipitare tutto Ba 2 +, e quindi aggiungere unpiccolo volume di candeggina per uccidere i batteri. Mantenere i batteri raccolti nelle bottiglie centrifuga sepolte nel ghiaccio in un 4.0 ° C in camera fredda per una notte.
  3. Purificazione della proteina KvAP (giorno 2 e 3; Figura 1B)
    1. Risospendere il pellet di batteri in 15 ml di tampone di lisi per IMAC cultura L 1,0. Aggiungi ~ 1,0 U DNasi I, e tre inibitori della proteasi di leupeptina, aprotinin e pepstatina A a 1,0 mcg / ml. Il volume totale per la cultura di due litri era ~ 35 ml.
    2. Sonicare i batteri risospeso in un bicchiere di metallo sepolto nel ghiaccio per un totale di 10 min ON-tempo. Il Sonicatore microsonda è stato fissato in un 5 sec ON / OFF 10 sec ciclo con una potenza di uscita del 40% in una stanza fredda ° C 4.0. L'impostazione della potenza di uscita è stata determinata empiricamente in modo che la maggior parte dei batteri sono stati lisati senza molto riscaldamento nella soluzione.
    3. Aggiungere 0,50 g di n-decile-β-D-maltoside (DM; Sol-Grade da Anatrace) in polvere secca per il lisato cellulare sonicato e incubare la miscela per 30,5 hr a temperatura ambiente (RT) con agitazione orizzontale costante (~ 100 rpm) per estrarre proteine ​​del canale il più possibile. È importante fare in modo che la polvere si è completamente sciolto detersivo per un periodo di 30-50 min.
    4. Dopo estrazione detergente, rimuovere i detriti cellulari dal lisato tramite centrifugazione a 20,000 xg per 30 min a RT. In attesa che la centrifugazione per finire, preparare una colonna LC (cromatografia liquida a bassa pressione) His-tag-based, come indicato nel riquadro 1.
    5. Caricare il supernatante dal passo 1.3.4 sul IMAC preconfezionati (i mmobilized m etallo ioni uno ffinity hromatography c) la colonna ad una portata di 1-2 ml / min che è guidato da una pompa peristaltica. Alternativamente la proteina estratta His-tag può essere incubato con la resina per IMAC discontinuo vincolante.
    6. Lavare la resina IMAC eseguendo 5 volume del letto di tampone di lavaggio IMAC, e 10 volumi del letto di IMAC appassionato di lavaggioer più 20 mM imidazolo. Un monitor UV in linea viene usata per assicurarsi che il lavaggio è pulito.
    7. Eluire la proteina KvAP applicando tampone di eluizione IMAC contenente 300 mM imidazolo. La maggior parte del KvAP legato viene eluito entro 6 ml di tampone di eluizione attraverso la colonna. Aggiungi trombina (1,0 U per 2-3 mg di proteina) nelle frazioni di eluizione in pool e incubare la proteina durante la notte sulla panchina di fendere il suo cartellino 6.
    8. Il giorno successivo, concentrare la soluzione proteica trombina-digerito in un Centricon (MWCO = 30K) fino a 600 microlitri per esclusione dimensionale FPLC (cromatografia liquida proteina veloce). Durante la centrifugazione, mescolare il campione ogni cinque minuti per minimizzare aggregazione proteica. Poiché la proteina è concentrata, la concentrazione locale del filtro a membrana diventa più alta, ea volte ci sono chiari bianco precipita che altrimenti potrebbero intasare la membrana del filtro. Anche l'alta concentrazione di proteine ​​(~ 5-10 mg / ml) nella parte inferiore del concentratore porta ad una frontecolore Nish e miscelazione aiuta veramente a ridurre al minimo la perdita di campione.
    9. Esegui il KvAP concentrata attraverso una Superdex 200 colonna che è pre-equilibrata con tampone di equilibrazione FPLC. Tipicamente il picco del canale KvAP tetrameric in DM eluisce con un volume di ritenzione di 12,3 ml. Vi è una piccola coda di trascinamento a circa 13,6 ml, che ha una piccola quantità di KvAP monomerico. Il vuoto della colonna abbiamo usato è a 7.0 ml, e di solito il campione dà luogo ad un piccolo picco al vuoto, che contiene poca proteina KvAP. L'imidazolo arriva alla fine della eluizione (~ 24 ml). Piscina le frazioni contenenti tetrameri KvAP insieme e concentrare la soluzione proteica fino a 0,5 ml. Determinare la concentrazione del campione utilizzando un coefficiente di estinzione stimato (~ 1,2 E-5,0 M -1 cm -1, che è stato calcolato in base al numero di residui aromatici) di KvAP a 280 nm [rif 12; URL: http:// web.expasyorg / ProtParam /].
      A temperatura ambiente, la KvAP purificato in DM è stabile per almeno una settimana senza perdita sostanziale di proteina. A 4 ° C, che potrebbe durare anche più a lungo. Mai congelare la proteina nei detergenti. Si consiglia di conservare la proteina in DM a 4 ° C, e la proteina in β-OG a temperatura ambiente. Ma noi di solito non aspettiamo, e procedere alla fase di ricostituzione subito dopo le proteine ​​sono pronti.
    10. Testare i campioni in un 12% riducenti gel SDS-PAGE.
      I campioni di ciascun passo descritto sopra sono stati preparati miscelando i 20 microlitri di campione con il tampone campione SDS-5x (Tabella 3 per i buffer) supplementato con 1,0% β-ME. I campioni non sono stati bolliti. Dopo gel erano pronti, i campioni di solito avevano l'SDS-buffer per più di 10 min a temperatura ambiente. Dopo che il gel è stato eseguito e colorate con blu di Coomassie, il KvAP tipo selvaggio mostrato come una singola banda di circa 26 kDa (Figura 1B

2. Canale Ricostituzione Ion

2.1. Preparazione liposomica e detergente indotta fusione delle vescicole

Prima della preparazione lipidica, lavare un bicchiere 14 ml monouso provetta, un tubo di vetro con tappo a vite, ed una siringa di vetro da 250 ml con cloroformio. Riversa ~ 10 ml di cloroformio nel testtube.

  1. Preparazione di Palmitoyl-oleoil-fosfatidil-etanolammina (PAPA) e palmitoil-oleoil-fosfatidil-glicerolo (POPG) liposomi.
    1. Trasferire 3,75 mg di Papa e 1,25 mg di POPG (PAPA: POPG = rapporto peso 3,1) in cloroformio nel tubo di vetro con tappo a vite pre-pulita e asciugare i lipidi in un flusso continuo di gas argon. Quando nessun cloroformio visibile viene lasciato, essiccare il lipide ulteriormente sotto vuoto ambiente per un'ora.
    2. Aggiungere 440 ml di sale basso-buffer (10 mM HEPES, pH 7.4) O acqua nel lipide essiccato e vortex la provetta per idratare i lipidi. La sospensione lipidica appare biancastro e torbido.
    3. Sonicare la sospensione lipidica in un bagno di sonicazione ghiacciata fino a quando la soluzione diventa vescicola traslucido (OD410 <0,2).
      Tipicamente per la soluzione 10 mg / ml PAPA / POPG in acqua o tampone sale basso, abbiamo operato la sonicatore con 30 sec 30 sec ON e OFF (su ghiaccio) per un totale di 15-20 min. A causa del calore generato durante la sonicazione, è consigliabile aggiungere 1,0 mM DTT nella soluzione lipidica per minimizzare l'ossidazione dei lipidi, e per raffreddare l'acqua del bagno sonicatore a 10 ° C o inferiore. Il OD410 finale è lipide-dipendente. Per alcuni lipidi, può essere molto difficile da raggiungere così basso OD. Se ciò accade, di solito usiamo detergenti per solubilizzare completamente i lipidi e consentire di lunga incubazione di raggiungere una buona distribuzione dei lipidi intorno alle micelle contenenti proteine ​​(vedi successivo).
      Una grande capacità sonicatore è importante in order raggiungere OD410 <0,2. Abbiamo utilizzato un sistema realizzato da Laboratorio Materiali Co., Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). La chiave per la corretta sonicazione delle vescicole è assicurarsi che il centro risonante nel mezzo del tubo ha forte vibrazione. La vibrazione varia con il volume dell'acqua e quindi può essere regolata. Inoltre si è constatato che empiricamente maggiore viscosità dell'acqua aggiungendo una piccola quantità di glicerolo può migliorare l'efficacia della sonicazione.
      Alternativamente abbiamo trovato che usando un sonicatore microsonda a contatto con la sospensione lipidica in un tubo di plastica o metallo può produrre gli stessi risultati. La microsonda deve essere pulito e solo la punta è immerso nella soluzione lipidica. Perché le particelle lipidiche vengono rotte in pezzi sulla superficie della microsonda, è molto importante per mantenere il campione raffreddato, e hanno alcuni agenti riducenti intorno per impedire l'ossidazione dei lipidi insaturi.
      Sotto crioelettronica microscopy, la maggior parte delle vescicole unilamellari sonicati sono 30-50 nm di diametro (dati non mostrati). La curvatura dei piccoli SUV è talmente alto che una piccola perturbazione è sufficiente per indurre la vibrante fusione di queste vescicole in quelli più grandi che sono 80-200 nm di diametro (vedi successivo).
    4. Aggiungere 50 ml di 3,0 M KCl e 10 ml di 0,50 M DM alla miscela in modo che la sospensione lipidica finale ha 300 mM KCl 10 mM e DM. Incubare la soluzione con rotazione orizzontale per 2 ore a temperatura ambiente per formare lipidi / detergente micelle miste. Dopo l'incubazione, la sospensione deve diventare un po 'torbida (Figura 2A), che è dovuto alla fusione detergente indotta delle piccole vescicole unilamellari.
    5. Quando la proteina viene concentrato a più di 2,0 mg / ml, aggiungere 0,50 mg proteina KvAP, 50 ml di 3,0 M KCl, 16 ml di 0,50 M DM magazzino in acqua, e HEPES 10 mM, pH 7,4 alla miscela lipidica / detergente fare 1 ml di volume finale. La lipidi finale: rapporto peso proteine ​​è 10:01e la concentrazione finale di DM è 18 mM (Figura 2A). Incubare la miscela di proteina / lipide / detergente nel tubo di vetro con rotazione orizzontale per altre 2 ore.
      La selezione della concentrazione di detersivo è guidato dalla fusione vescicola detersivo indotta e vescicola solubilizzazione 13. Quando le vescicole sono formate da una forte sonicazione, il loro diametro medio è compreso nell'intervallo di 30-50 nm sotto EM. Queste vescicole sono molto bassa dispersione a 410 nm. A basse concentrazioni, detergenti vengono prima inseriti nelle vescicole, destabilizzare le vescicole, e indurre la fusione delle vescicole detergenti-saturi (OD410 gira su; vedere la Figura 2A). Fusione delle vescicole porta alla crescita delle OD410 nm. Per 10 mg / ml Papa / POPG vescicole, i OD410 picchi a 15 mm circa DM. Quando vengono introdotti altri detergenti, le vescicole cominciano a rompersi in pezzi ed i lipidi diventano partizionato in detergente / lipidi micelle miste. Quest'ultimo processo è accompagnato dalladiminuire di OD410 ad un livello basso finale (<0,1).
      Causa degli eventi di fusione attivi della fase di salita della densità ottica dovuta alla fusione detergente indotto di piccole vescicole, è altamente probabile che la proteina / detergente micelle sarà fuso attivamente con le vescicole lipidiche detergente-saturi. Questo è il motivo dietro la scelta di 18 mm DM al momento della preparazione della proteine ​​/ lipidi / miscela detergente. Se il detersivo diventa concentrata di oltre 4 pieghe, l'importo delle esigenze DM di essere regolato in modo che la concentrazione finale è sempre di circa 18-20 mM. Quando la resa di proteine ​​è molto bassa, è difficile valutare quanto detersivi concentrati sono nel campione, avremmo invece mescoliamo la proteina con lipidi completamente solubilizzati, e utilizziamo la miscela completamente equilibrata per la ricostituzione. Nelle nostre mani, se non abbastanza tempo è stato permesso di raggiungere una buona distribuzione di equilibrio dei lipidi tra proteici e micelle proteina-liberi, la reconstitutione efficienza sceso in modo significativo. Proviamo solitamente l'efficienza ricostituzione da due esperimenti: 1) esaminare la co-migrazione della proteina con la frazione vescicola in un gradiente di densità di saccarosio ultracentrifugazione; 2) estrarre le proteine ​​dalle vescicole ricostituite, e frazionare loro in un gel- colonna di filtrazione per trovare la quantità di proteine ​​(KvAP nel nostro caso) resta da tetramerica. Tempo minimo di incubazione delle proteine ​​/ lipidi / detersivi è un paio d'ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi.
      Per una nuova proteina di membrana che è stabile in un detersivo diverso, il primo passo è scoprire la proprietà solubilizzazione dei lipidi da tale detersivo, simile a quanto mostrato nella Figura 2A. Successiva, si consiglia di iniziare con gli estratti PC, come la E. coli polare estratto PC, l'estratto di soia PC ecc, in modo che se la proteina specifico bisogno di determinate fosfolipidi per la sua funzione, può essere già incluso nella estrazioneTED miscela lipidica.
  2. Preparazione della KvAP in miscela con detergente-solubilizzato 1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano (DOTAP) o 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-succinato (CANI) --- un esempio di solubilizzazione lipidico completo per la ricostituzione
    1. La preparazione lipidica è la stessa che per Papa / POPG vescicole. La sonicazione dei lipidi idratati in piccole vescicole unilamellari ha bisogno di tempo più lungo (di solito 45-60 minuti) che per Papa / POPG lipidi (di solito 5-10 min). I CANI vescicole possono fondersi lentamente tra loro e formare delle piccole gocce oleose.
      A causa della difficoltà nel fare i SUV di alta qualità fuori DOTAP e cani riproducibile, di solito solubilizzare queste due lipidi completamente prima della miscelazione con le proteine.
    2. Per solubilizzare il DOTAP o cani completamente, le vescicole sonicati sono mescolati con 10 mM e 40 mM DM n-ottil-β-D-glucoside (β-OG). La miscela lipidica / detergente viene incubato per una notte (> 15 ore)a temperatura ambiente, e la miscela non dovrebbe avere piccole particelle o goccioline. Ma invece è abbastanza chiaro. Mancato raggiungimento completo equilibrio in questo passaggio porterà alla formazione di una frazione significativa di vescicole multilamellari.
    3. Mescolare la proteina KvAP con il DOTAP detergente-solubilizzato o cani in una proteina: rapporto di lipidi che è inferiore o pari a 1:10. La miscela di proteine ​​/ detergente / lipide viene fatta incubare a temperatura ambiente per 2-3 ore con rotazione end-over-end.

2.2. Rimozione dei detergenti per formare proteoliposomi

  1. Dialisi --- lenta rimozione dei detergenti, come DM e β-OG, che hanno relativamente alte concentrazioni micellari critiche (CMC ≥ 1.0 mM)
    Preparare buffer di dialisi da 2 litri (Tabella 3) per ciascuna miscela di 1,0 ml.
    Tagliare a misura un tubo di dialisi (MWCO = 10K; largo 0,70 centimetri), e lavarlo con acqua deionizzata. È importante controllare e fareAssicurarsi che non vi è alcuna perdita nel tubo. Per campioni sensibili, il tubo potrebbe essere trattato prima con un tampone di 10 mM Tris-HCl pH8.0 e 2.0 mM EDTA, e poi essere pulito in acqua bollente per 3-5 min. Il tubo viene poi fissate ad una estremità e risciacquata con il tampone di dialisi.
    Caricare la miscela di proteine-lipidi-detergente in un tubo di dialisi. Bloccare entrambe le estremità del tubo con minimo spazio lasciato sopra la soluzione. Mettere il tubo caricato nel buffer di dialisi, e utilizzare una piastra di agitazione in modo che il tubo ruota lentamente in soluzione. Modificare il buffer di dialisi, una volta ogni 8 ore. Dopo il primo cambio di buffer, la soluzione deve diventare torbida se la miscela di proteine-lipidi-detergente era completamente chiaro. Se la dialisi è troppo veloce, ci può essere solido bianco precipita sul fondo del tubo di dialisi. Si raccomanda che al momento del cambiamento di buffer, il tubo deve essere strofinato, ed invertita più volte. Dopo cinque cambiamenti di tampone di dialisi, le vescicole di solito sono pronti.
    Controlliamo l'importo residuo di detergenti sparando le vescicole sul doppio strato lipidico. Quando non vi è ancora notevole quantità di detergenti a sinistra, il doppio strato si rompono quasi istantaneamente. È anche possibile misurare il detergente residuo utilizzando il metodo colorimetrico o misurazione della tensione superficiale della sospensione vescicola.
  2. L'uso di sfere di polistirolo per aiutare a rimuovere detersivi che hanno bassa CMC
    In molti casi, dobbiamo utilizzare basse detergenti CMC, come DDM (CMC ~ 0,17 mM in acqua). Perline con minuscoli pori idrofobi sono usati per rimuovere questi detergenti 14.
    1. Preparazione delle perline. Peso fuori 0,5 g di perline secchi e metterli in una provetta da 50 Corning, aggiungere 20 ml di metanolo, sonicare la soluzione in un bagno di sonicazione per 5 minuti per rimuovere le bolle intrappolate, centrifugare le perline a 5.000 rpm per 5 minuti, e poi decantare più metanolo. Ripetere il lavaggio con etanolo e acqua MilliQ. Le perle lavati vengono memorizzati in etanolo al 20% a 4 ° C, ebisogno di essere cambiato in un buffer di detersivo senza prima dell'uso.
    2. Stimare la quantità di detersivi nella miscela di proteine ​​/ lipidi / detergente da trattare, e calcolare la quantità di perline necessari per rimuovere i detergenti. Per DDM e DM, la capacità di legame è di circa 100 mg per 10 perle detergenti mg. Le perline bagnate senza acqua in eccesso vengono pesati, e ha aggiunto direttamente alla miscela di proteine. È richiesto almeno 15-20 minuti per le perline per essere pienamente efficace e la diminuzione della concentrazione di detergente raggiunge un livello costante 14-16. Per rimuovere 8,7 mg di DDM (dodecil-maltoside) in 1,0 ml di soluzione, equivalente a ~ 18 mm, per un totale di 87 mg di perle di polistirene, come Bio-Beads SM2, è usato in cinque frazioni uguali. Mescolare la miscela di proteina / lipide / detergente con ogni frazione per 20-30 min con rotazione end-over-end costante a temperatura ambiente, centrifugare le perline, trasferire il supernatante alla successiva frazione di perline, e ripetere fino alla fine.
      Quando la Concentrazione detergentezione raggiunge il CMC, abbiamo volutamente estendere il periodo di tempo per questo a un'ora in modo che la piccola quantità di detergenti nella soluzione faciliterà la fusione di piccole vescicole in quelle più grandi.
    3. Per rimuovere la traccia quantità di detergenti dopo l'ultimo passaggio, aggiungere 35 mg Bio-Rad SM2 perline e incubare con le vescicole per 4 ore.
      Quando le procedure per la rimozione detersivo descritte sopra sono da applicare ad una nuova proteina, è generalmente consigliabile iniziare con il rapporto proteina / lipide (peso / peso) di ~ 1:10. La miscela lipidica / detergente deve essere attentamente preparato in modo che un numero sufficiente detergenti vengono aggiunti per solubilizzare completamente i lipidi (Figura 2A). È importante incubare la miscela lipidica-detergente per più di 2 ore a temperatura ambiente (con 1-2 mM DTT) con costante agitazione (400 rpm) o di rotazione end-over-end. Quando la proteina è mescolato con lipidi, la miscela di proteina / lipide / detergente dovrebbe essere incubato sufficientemente lungo (una notte se la proteina è Stable) sia a temperatura ambiente o in una camera fredda in modo che la distribuzione dei detergenti e lipidi tra le micelle contenenti proteine ​​e micelle proteina-liberi è relativamente uniforme. Inoltre, se è impiegato in rapida rimozione dei detergenti utilizzando BioBeads, è importante conoscere la capacità detergente vincolante delle perline. La lenta rimozione di detergenti probabile assicura che le proteine ​​avranno abbastanza lipidi per mantenere la loro integrità e diventare inseriti in vescicole relativamente consistenti.

2.3. Conservazione del proteoliposome e il controllo di qualità

  1. Una volta che le vescicole sono pronti, li preparerà in aliquote di 50 microlitri e flash-congelare le aliquote immergendo direttamente in azoto liquido. Le vescicole congelati sono poi memorizzati in una -80 ° C freezer. Per i saggi biochimici, non usiamo vescicole congelati perché il ciclo di congelamento-scongelamento a volte è stato trovato per introdurre artefatti nella nostra reazione di cis-specifica. Per la registrazione elettricas, usiamo solo vescicole che vengono memorizzati nel -80 ° C per meno di 6 mesi.
  2. Galleggiamento delle vescicole in un gradiente di densità (Figura 2B)
    1. Carico 50 microlitri della sospensione vescicola sopra degli strati di gradiente di saccarosio contenenti 0,3 ml ciascuna di 10, 35 e 55% di saccarosio fatta in 10 mM HEPES e centrifuga a 200.000 g per 4 ore a 4 ° C. Accelerare e decelerare lentamente per evitare la rottura della interfaccia tra gli strati.
    2. Raccogliere 100 microlitri frazioni dalla cima a fondo ed eseguirli su un non riducente SDS-PAGE (Figura 2B). Il KvAP è macchiato con il blu Coomassie tale che una banda di proteina 0.5-1.0 microgrammi è chiaramente visibile. La proteina KvAP dovrebbe essere trovato all'interfaccia tra 10 e 35% di saccarosio. Nessun pesanti aggregati di proteine ​​sono visti a la gamma ad alta densità, che indica che quasi tutte le proteine ​​sono nelle membrane.
  3. Verificare la corretta conformazione del canale KvAP in vescicole. <br /> I nostri dati precedenti hanno stabilito che una cisteina singolo mutante (L125C/C247S) KvAP, se correttamente integrato in doppi strati, è completamente sepolto nelle membrane, e non è accessibile da reagenti cisteina-specifici 8. Le procedure di ricostituzione sono stati testati con questo canale mutante, e controllati da un reagente Cys-specifico, MTS-PEG5000. La modifica a L125C con 1,0 mM reagente MTS a temperatura ambiente introduce uno spostamento 5kDa alla banda KvAP in un gel SDS-PAGE non riducente. L'efficace applicazione delle nostre procedure di ricostituzione dovrebbe portare ad alcuna reazione rilevabile per i canali mutanti L125C in membrane fosfolipidiche, che suggerisce l'inserimento quasi completa di tutti i canali doppi strati. Come controllo positivo della reazione, 5.0 mM DM è introdotto da rendere quasi tutti i residui L125C nei canali mutanti accessibili al reagente MTS.
    Alternativamente, una tossina poro-vincolante, come chrybdotoxin, può essere utilizzato per contare i canali tetramerici. Un anticorpo-based vincolantedire (cfr. riquadro 2, dove Fv è preparato come un ligando conformazione specifica per KvAP) potrebbero essere utilizzati per quantificare i siti di legame disponibili nelle vescicole ricostituite. Queste analisi di legame possono poi essere confrontati con un metodo quantitativo di misurazione della proteina totale, al fine di capire quale frazione dei canali ricostituite sono tetrameri e quale frazione della proteina ha la paletta tensione-sensore (S3/S4 del sensore di tensione) correttamente piegato.
    Per altre proteine ​​per essere ricostituito, è opportuno introdurre un metodo quantitativo per valutare quale frazione delle proteine ​​ricostituite è correttamente ripiegata. Esame funzionale attento è quindi un prerequisito per lo sviluppo di buon controllo di qualità per la ricostituzione di successo.

3. Applicazioni delle vescicole ricostituite Canale contenenti

3.1. Studio funzionale dell'attività di canali ionici in membrane lipidiche neri.

Preparazione di Nmateriali eeded.

  1. Preparazione Lipid
    1. Pulire un vetro provetta, una fiala color ambra con tappo a vite in teflon a superficie, e una serie di siringhe di vetro con cloroformio. Asciugare il flacone color ambra sotto un flusso di gas argon.
    2. Trasferimento 0,75 mg e 0,25 mg PAPA POPG in cloroformio nel flaconcino ambrato e si evapora il cloroformio con gas argon.
    3. Lavare i lipidi secchi con 0.20 ml di pentano, e asciugare completamente per rimuovere residui di cloroformio. Infine dissolvere i lipidi in 50 microlitri decano. Lipidi nella decano (20 mg / ml) saranno utilizzate per la verniciatura di un bistrato lipidico attraverso un foro 150-250 micron (Figura 3B) praticato nella porzione assottigliata ad un lato di una tazza bistrato sperimentale (Figura 3A).
  2. Preparazione della soluzione
    1. Soluzione intracellulare (trans): 10 mm HEPES / KOH, pH 7.4, 15 mM KCl
    2. Soluzione extracellulare (cis): 10 mm HEPES / KOH, pH 7.4, 150 mM KCl
    3. Ponte salino: Bend vetro capillarinei ponti a forma di U, e riempirli con il 1,0% di agar fuso sciolto in soluzione extracellulare.
      Il gradiente osmotico stabilito tra le soluzioni di trans e cis è risultata essere la principale forza propulsiva per la fusione delle vescicole sul doppio strato lipidico 17. Per i lipidi carichi negativamente, 15 mM CaCl 2 o cariche positivamente peptidi poli-Arginina sono risultati in grado di indurre eventi di fusione. Lipidi fusogeniche, come DOTAP e cani, ecc, potrebbero essere introdotte nel lipidi vescicole in modo che la probabilità di eventi di fusione è più alto.

Registrazioni elettriche dai canali KvAP in doppi strati lipidici

  1. Pre-dipingere il foro rotondo (diametro ~ 0.25 mm) è praticato sulla superficie cilindrica della coppa bistrato (Figura 3B). I lipidi vengono trasferiti con un pestello capillare che viene fatta in laboratorio. La testa rotonda del pestello capillare è lucido e non graffia la superficie della tazza. The piccole quantità di lipidi trasportati dal pestello capillare si sviluppa attorno al foro della coppa bistrato, ed essiccato all'aria.
  2. Attendere 1-2 minuti in modo che il decano evapora completamente. Si deve prestare attenzione per evitare la soluzione lipidica di entrare nel buco.
  3. Inserire la coppa in camera di registrazione, e mettere nelle ponti salini e collegare gli elettrodi ai due lati della tazza di registrazione (Figura 4A). Aggiungere il cis e trans soluzione ai due lati del foro. Un gradiente osmotico è stabilito per facilitare la fusione delle vescicole nel doppio strato lipidico.
  4. Regolare l'offset tra i due lati della tazza a ~ 0 (solitamente <2 millivolt) potenziale. Utilizzare il pestello capillare per trasferire una piccola quantità di miscela lipidica in decano, e dipingere il lipide attraverso il foro fino a formare membrana a doppio strato. La formazione del doppio strato è rilevata registrando la corrente di capacità durante l'erogazione di un impulso rampa.
  5. Aspetta che la membranasi dirada e diventa relativamente stabile. Aspettiamo finché non c'è più cambiamento nella capacità di membrana per 3-5 min.
    Il pensiero generale circa il doppio strato planare formata attraverso un grande foro è che la porzione molto centrale della membrana è vicino ad essere ~ 4,0 nm di spessore come un doppio strato regolare, e la membrana diventa più spessa quando si avvicina al bordo del foro, dove c'è un anello intorno e la maggior parte del solvente è decano 18, 19. È inevitabile che ci sia decan residua nella porzione centrale doppio strato della membrana. Passato stima del rapporto tra volume di n-decano contro PC era 0,35-0,45 dopo l'assottigliamento del doppio strato 18, 20-22. EM esame del doppio strato assottigliato ha dimostrato che ci sono stati lenti di decano inserita tra le due foglioline di un doppio strato 22. Questi dati suggeriscono che le proteine ​​di membrana inseriti nelle membrane doppio strato lipidico convivono con piccole isole (fino a 50 nm di diametro) di decano. Il decano residuo in il doppio strato diminuisce anche la costante di 0,4-0,5 mF / cm 2, che può essere utilizzato per ottenere una stima approssimativa della dimensione del doppio strato assottigliato sulla base della capacità misurata capacità elettrica. Un doppio strato di 100 pF capacitanza viene da una membrana a doppio strato circolare di ~ 180 micron di diametro.
    Per KvAP, il decano residuo non ha compromesso sua gating voltaggio-dipendenti, anche se la funzione di canale non è stato attentamente esaminato in un doppio strato di solventi. Lo stesso sembrava essere vero per i canali NaChBac ei Kv1.2 canali inseriti nel BLM 23. Non è ancora chiaro se il significativo shift sinistro della curva GV misurato dai Kv1.2 canali nel doppio strato relativo decano-lipidico per canali in oociti ha nulla a che fare con il residuo decano 23. A seconda dei lipidi utilizzati nel formare i bistrati, l'importo del decano residua nel doppio strato può variare. Per esempio è stato riferito che la formazione di planare membr lipidianes di MGDG (mono-galattosil-diacilglicerolo) richiede il decano, forse a causa delle fessure tra il MGDG conica essere riempito con le molecole decano. Se la decan residuo ha effetti sulle proteine ​​da studiare è puramente empirico, e la prova sperimentale è necessaria per dire se l'effetto è significativo oppure no.
  6. Non appena la membrana diventa stabile, sparare 0,5-1,0 microlitri canale contenente vescicole posizionando l'estremità di una punta sottile P2-pipetta proprio sopra il foro. Le vescicole cadono attraverso il foro sul fondo della tazza.
    Durante questo processo, più vescicole si attaccano alla membrana attraverso il foro. Dato abbastanza tempo, alcuni sono fuse nella porzione bistrato modo che un piccolo numero di canali KvAP siano correttamente inserito nel bistrato planare nella parte centrale della membrana. Sia gradiente osmotico e interazione elettrostatica sono importanti nella fusione delle vescicole in bistrati lipidici 17, 24.
  7. Per testarei canali KvAP nel doppio strato, un breve impulso di 80 mV viene consegnato dal potenziale di -80 mV tenuta. A causa della inattivazione veloce e lento recupero da inattivazione, un lungo intervallo (~ 120 sec per i canali nelle membrane in PE / PG) è dato tra due impulsi. Un tipico registrazione corrente dai canali in una membrana PAPA / POPG è mostrato in Figura 3C. Se la corrente è piccola, spara più vescicole. Una volta che guarda la corrente di buone dimensioni, equilibrare le concentrazioni di ioni nelle soluzioni su entrambi i lati della membrana. I canali sono pronti per esperimenti elettrofisiologici.

3.2. Screening per ligandi conformazione-specifici contro i canali in vescicole

  1. Introduzione della libreria fagica-visualizzato.
    Il fago-visualizzata libreria 20-mer peptide è presente al N-terminale di cinque copie di proteine ​​PIII ad una estremità del batteriofago filamentoso fd-tet 25. La biblioteca presenta ca. 1 x 10 8 differisconorenti tipi di sequenze casuali 20-mer peptidi, ed è stato gentilmente fornito a noi dal laboratorio del Dr. Kathlynn Brown a UT Southwestern Medical Center 26. L'infezione fago in E. coli K91 rende i batteri resistenti a 12 mcg / ml di tetraciclina.
    Una procedura dettagliata per la coltura batterica, l'amplificazione e la titolazione dei fagi e il sequenziamento delle colonie fago è stato descritto da McGuire et al. 26 Daremo una breve descrizione delle operazioni di base nella sezione successiva. I lettori possono trovare maggiori dettagli nel documento McGuire. Noi invece concentrarsi su l'isolamento di cloni specifici che si legano strettamente ai canali ionici ricostituito in vescicole (Figura 4A).
    L'idea di base dietro il nostro schermo è che i fagi legati ai canali ricostituite specificamente possono essere tirati giù con le vescicole. Il fago bound può essere amplificato e testata contro i canali in membrane lipidiche. Il nostro studio dii cambiamenti conformazionali di sensori di tensione KvAP in diverse membrane lipidiche 8 hanno dimostrato che è possibile mantenere i sensori di tensione in entrambi stati "riposo" "attivato" oppure commutando i lipidi da fosfolipidi regolari per coloro che non contengono fosfati nelle regioni headgroup (DOTAP e cani in nostri esperimenti). Questi due conformazioni lipidi-determinati sono utilizzati nella nostra proiezione di ligandi conformazione-specifici. La libreria di fagi sarà prima saturato dai canali in vescicole fosfolipidiche (selezione negativa) prima di essere selezionato per leganti stretto per i canali in DOTAP e CANI membrane (selezione positiva).
  2. Procedure di base dietro la selezione dei fagi
    Crescita di batteri K91 in mezzo LB: Il tempo di raddoppio dei batteri è di circa 20 min a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
    Amplificazione della biblioteca: Mescolare la soluzione con il fago batteri K91 a OD0.4. Dopo 15 min di incubazione a 37° C, le miscele sono distribuite in modo uniforme sul -9,5 x 9,5 pollici 2 piastre di agar contenenti 12 mg / ml di tetraciclina, l'uso di lastre di grandi dimensioni impedisce il predominio della cultura da parte di batteri che hanno una maggiore crescita dei tassi. Una volta che la diversità della biblioteca è più piccolo, 10 cm piastre Petri sono utilizzati per la selezione e l'amplificazione piccola scala.
    Amplificazione su larga scala del singolo clone: ​​Seminare una piccola aliquota di fagi (circa 100 milioni) in 250 ml di LB + 5 mm MgSO 4 e 12 mg / ml di tetraciclina, cresce durante la notte a 37 ° C. Raccogliere le cellule di rotazione 6.000 rpm per 10 min. Raccogliere il surnatante e aggiungere in esso 0,2 vol / vol il buffer di precipitazioni (2,5 M di NaCl, 20% PEG8000). Dopo incubazione in ghiaccio per 1,0 ore, centrifugare la soluzione a 17.000 xg per 30 min a pellet tutti fagi. Rimuovere tutti surnatante, aggiungere 1,0 ml di PBS, incubare in ghiaccio per 30 minuti, risospendere delicatamente il pellet (non vortex). Trasferire la sospensione in una nuova provetta e centrifugare a 14,000 rpm per 2 min. Trasferire il surnatante in un altro tubo, e incubare a 65 ° C bagnomaria per 15 minuti per uccidere tutti i batteri. Centrifugare la provetta per 2 minuti a 13.000 rpm. Scartare il pellet, aliquota e conservare la soluzione fago a -80 ° C.
  3. Panoramica dei fagi contro i canali KvAP in vescicole lipidiche.
    1. I fagi peptide-Inclusi devono essere amplificato e titolato prima nostri esperimenti modo che il numero di fagi per unità di volume è noto. KvAP fu ricostituito in PAPA / POPG (3:1) più 0,50% vescicole biotina-DOPE come controllo negativo, e in CANI: biotina-DOPE (199:1; stesso è stato fatto per DOTAP vescicole) viene utilizzato come destinazione scelta. La concentrazione finale di KvAP in vescicole è di 0,50 mg / ml, ed i lipidi sono 5,0 mg / ml. Il buffer di panning conteneva 500 mM KCl 100 mM HEPES / KOH pH 7,4, e 0,10 mg / ml di BSA.
      Per il primo periodo, 10 ~ 10 fagi (100 copie per ogni tipo) sono stati diluiti a 0,050 ml di terreno LB. Per i successivi passaggi panning, la starting fago è stato regolato a essere entro 10 giugno-10 agosto.
    2. Selezione negativa:
      Incubare i fagi diluito in 50 ml di LB 100 l neutravidina agarosio (in grado di legare 1-2 mg biotinilato BSA per ml di resina; Pierce) in 1,0 ml di tampone di panning. Dopo 10 min di incubazione, separare le perline da loro girare a 100 xg per 1,0 min. Ripetere questa operazione due volte per rimuovere eventuali fagi che si legano direttamente ai talloni.
      Mescolare i fagi sinistra-over dal passaggio precedente con 50 vescicole vuote microlitri (PAPA / POPG più 0,5% biotina-DOPE), che non contengono proteine. Aggiungere 100 microlitri Beads neutravidina che sono stati lavati con il tampone panning alla miscela fago-vescicola. Dopo aver ruotato la miscela a temperatura ambiente per 5 min, rimuovere i beads di centrifuga 100 xg per 30 sec. Questo passaggio viene ripetuto per vescicole vuote di cani: biotina-DOPE (199:1), così come per i canali in KvAP Papa / POPG vescicole (con 0,5% biotina-DOPE). Il supernatante dopo questi trattamenti conteil ns fagi completamente cancellata. Dopo i primi due cicli di schermo, il preclearing poteva essere eseguita solo contro KvAP a Papa / POPG vescicole.
    3. Selezione positiva
      Incubare i fagi completamente cancellato con canali KvAP in cani: biotina-DOPE (199:1) vescicole (lo stesso per le vescicole DOTAP) in presenza di 100 microlitri perline neutravidin a temperatura ambiente per 10 min. Portare il volume della miscela di 15 ml utilizzando il buffer panning prima della centrifugazione a 100 xg per 10 min. Raccogliere le perline, e lavarli tre volte con 45 ml di tampone di panning.
    4. Risospendere le sfere in 500 microlitri terreno LB contenente 5,0 mg / ml biotina, e incubare la miscela a temperatura ambiente per due ore per liberare alcuni dei fagi legati da neutravidin, che ha affinità inferiore alla biotina nativo. Separare i beads di 100 x g di spin per un minuto. Raccogliere il surnatante e le perline in due provette diverse per titolazione.
    5. Per amplificare i fagi selezionati, mix 200 pl del supernatante o le microsfere in sospensione nell'ultimo passo con 500 microlitri K91 coltura batterica (OD600 ~ 0,4-0,6, colta ~ 4 ore prima di essere utilizzato). Dopo incubazione a 37 ° C per 15 min, piastra 50 ml di ogni tetraciclina su piastre per coltura durante la notte.
      Durante i primi due cicli schermo (Figura 4A), raccoglieranno 500 microlitri supernatante e le perline dall'ultimo passaggio, mescolarli con il 5 ml di coltura batterica, e li piastra in 9,5 piastre pollice quadrato al fine di recuperare e amplificare tutte le colonie fagiche . Questo passaggio è importante per recuperare quei fagi che rendono i batteri crescono più lentamente di altri.
    6. Le colonie dalle piastre vengono amplificati e titolati prima del successivo ciclo di panning e di selezione (v. McGuire et al., 26).
    7. Esaminare le attività dei fagi selezionati positivamente sui canali.
      Dopo 10-12 cicli di selezione, testare il totale fagi amplificati sui canali KvAP in lipidi bilayers fatti di PAPA / POPG. Se ci sono una frazione significativa di cloni positivi, i fagi selezionati a 100-500 nM deve essere ostruita da una frazione significativa di canali nel doppio strato (Figura 4B) come siamo stati contro selezioniamo canali stabilizzati in stato di riposo. I dati positivi suggeriscono che ci sono cloni che vi mostrerà forte legame con i canali in stato di riposo. Dopo 16 cicli di selezione, selezionare 50 colonie positive per singola colonia di sequenziamento. Le dominanti cloni fago individuate sono selezionati tra confrontando le sequenze, e vengono amplificati e testati contro i canali in doppi strati. Una volta che i cloni positivi sono confermati, sintetizzare i peptidi trasportati dai forti cloni positivi e testarle sui canali nonché di confermare le loro attività conformazione-specifici.

3.3. Cristallizzazione di canali KvAP a membrane per la determinazione della struttura 27-29

  1. Per stabilizzare la conformazioneil canale, una conformazione specifica legante del canale, 33H1 proteina Fv, è utilizzato per formare il complesso KvAP / Fv. La preparazione della proteina Fv è dettagliata nella casella 2. Purificare il complesso in una colonna Superdex 200. Le eluisce complesso a circa 11,4 ml nel nostro sistema.
  2. Per la schermata iniziale, mescolare la proteina con DMPC o POPC che è completamente solubilizzato in DM o β-OG. La miscela di proteina / lipide / detergente è mescolata per più di 15 ore, al fine di raggiungere un equilibrio termodinamico nella distribuzione dei tre componenti tra le micelle miste. Di solito noi prima prova tre rapporti di lipidi / proteine ​​diverse (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) e tre diversi livelli di pH (6.0, 7.0 e 8.0). Il buffer di dialisi contiene 20 mM tampone K-fosfato, 100 mM KCl, e 3,0 mm NaN3. Il buffer di dialisi viene cambiata ogni 2-3 giorni. Una piccola aliquota dei cristalli e usciti ogni 2-3 giorni per esaminare la formazione di vescicole e la possibile comparsa di reticolo cristallino.
    Un elenco tabloiddi LPR vs pH viene utilizzato per determinare il comportamento della proteina nei due diversi tipi di lipidi. Vogliamo ottenere vescicole relativamente di grandi dimensioni (oltre 150 nm) o fogli di membrana quando i campioni sottoposti a dialisi sono esaminati da negativo-macchia EM. Un piccolo schema regolare in membrane suggerisce un colpo e verrà utilizzato per guidare ulteriore ottimizzazione.
    EM colorazione negativa: le griglie di rame rivestito con film di carbonio (~ 3-5 nm di spessore) sono glow-scarica in aria per rendere la superficie di carbonio idrofila. Un piccolo volume (2-3 microlitri) della sospensione cristalli viene caricata sulla superficie di carbonio, e incubato per 0,5-1,0 min. Asciugare le griglie dal lato con il bordo violento di un pezzo di Whatman # 4 carta da filtro. Capovolgere la griglia ed incubare per 15 sec ~ sulla sommità di una goccia di soluzione colorante 150 microlitri (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 in acqua più 0,5% trealosio, o 6,0% di ammonio molibdato / KOH, pH6.3-6.5 , in acqua più 0,5-1,0% trealosio). Macchiare il più possibile la soluzione da tegli superficie della griglia, e consentire la griglia si asciughi prima di inserirlo in un TEM per l'esame. Immagini di vescicole sono prese in condizioni di basse dosi per evitare il danno di qualsiasi imballaggio cristallino dagli elettroni.
  3. Lo schermo viene quindi espansa per esaminare piccoli passi di LPR per raggiungere un corretto LPR. Se le proteine ​​sono adatti per la cristallizzazione, un reticolo di piccole proteine ​​in membrane può diventare visibile. Intorno a queste condizioni iniziali, ottimizzare ulteriormente la cristallizzazione variando i tipi e le concentrazioni di sale, la temperatura, la velocità e metodi di rimozione detersivo, cationi bivalenti, detergenti utilizzati per preparare le proteine, precipitanti, lipidi composizione ecc
    Le ottimizzate cristalli 2D di complessi KvAPΔ36/Fv crescere in grandi fogli che vanno da pochi micron a 20-30 micron (Figura 5A). In condizioni cryoEM, i cristalli mostrano chiaro reticolo quadrato con evidente simmetria quattro volte come previsto dalla quadruplice simmetrica channels (Figura 5B e C).

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Representative Results

Il flusso generale degli esperimenti per purificare il canale KvAP in omogeneità biochimica è descritto nella Figura 1A. Esempi tipici durante l'espressione e la purificazione della proteina è mostrato nel gel SDS-PAGE in Figura 1B. La proteina dopo la purificazione IMAC è relativamente pura. La resa del canale KvAP è di circa 1,0 mg / Litro cultura.

Solubilizzazione delle vescicole lipidiche con detergenti deve essere elaborato per ciascuna coppia di lipidi vs detersivo. La solubilizzazione di piccole vescicole unilamellari di Papa / PAPA dal DM è presentato in Figura 2A, i risultati del galleggiamento vescicole sono di solito abbastanza semplice. Risultati tipici nel saggio SDS-PAGE delle frazioni dei gradienti sono illustrati nella Figura 2B. Nel gradiente di densità di saccarosio, i canali contenenti Papa / POPG vescicole solito sono concentrati all'interfaccia tra lo strato 10% und lo strato 35%. Le KvAP contenenti DOTAP o cani vescicole sono più leggeri e di solito in corrispondenza dell'interfaccia tween 5% e il 10% (leggermente penetrato nello strato 10%). Se ci sono una frazione significativa di vescicole multilamellari, solitamente sono biancastro e concentrati sotto dell'interfaccia 10-35%. Abbiamo trovato che questo avviene di solito quando la miscela di proteina-lipide-detergente non è stato incubato sufficientemente lungo per raggiungere buona distribuzione dei lipidi.

Registrazioni elettriche dai canali KvAP incorporate in bistrati lipidici planari sono mostrati in Figura 3. La tipica traccia attuale dimostra che a -80 mV, i canali sono tranquille. Passaggio a +80 mV porta ad un picco capacitanza rapida (nel vivo al momento della commutazione di tensione). Un lento fase di salita della corrente suggerisce che i canali diventano attivi e sono in grado di condurre corrente potassio verso l'esterno. Dopo il picco della fase di salita, la corrente inizia a diminuire, un passo chiamato inattivazione. Il inactivatiil prende a poche centinaia di millisecondi per completare. Una volta che la tensione viene commutata al -80 mV, vi è una fase ritorno dopo il picco capacitanza discendente, che riflette la chiusura dei canali aperti e si chiama la disattivazione (Figura 3C).

Al centro dello schermo fago, abbiamo testato l'attività dei fagi amplificati sui canali KvAP nei doppi strati di Papa / POPG. Dopo 12 cicli di selezione, i fagi amplificati inibite le attività di canale (Figura 4B, fago selezionato). Ma il fago visualizzato biblioteca partenza non ha mostrato alcun effetto sui canali (Figura 4B, controllo fago). Anche se le attività dei fagi selezionati non erano molto alte, perché solo una bassa concentrazione di fagi positivi erano intorno, gli effetti, riproducibili chiare suggerito che ci sono, cloni positivi attivi che presentano affinità alta vincolante, dovrebbe essere arricchito selettivamente durante la rimanente di screening cyCles e una volta arricchito, sono suscettibili di avere una forte attività inibitoria sui canali nelle membrane.

Nella fase iniziale di screening dei cristalli 2D, abbiamo visto piccoli reticoli in molte piccole vescicole. Con l'ottimizzazione, alcuni grandi fogli presentati con un sacco di piccole vescicole intorno (Figura 5A). Le immagini cryoEM di questi cristalli sempre mostrato un sacco di difetti locali (Figura 5B), suggerendo che un'ulteriore ottimizzazione è necessaria per ottenere migliori cristalli. Una volta che i cristalli sono stati ben ottimizzati, hanno esibito spigoli vivi, e apparivano come fogli singoli. Ad alto ingrandimento, le singole unità sono chiaramente molto meglio ordinate (Figura 5C).

Nome del reagente / materiale Azienda Numero di catalogo Commenti
Tryptone RPI Corp. T60060
Estratto di lievito RPI Corp. Y20020
NaCl Pescatore S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Cloruro di potassio Pescatore BP366-500
n-Dodecyl-β-D-maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-ottile-β-D-glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptina RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF P7626
DNasi I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
PAPA Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
CANI Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotina-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
Neutravidina agaperline rosa Piercenet 29200
Dialisi Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentano Pescatore R399-1
Decano TCI l'America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabella 1. Elenco dei reagenti e materiali.

  • Coltura batterica agitazione incubatore
  • Spettrofotometro
  • Micro-sonda sonicator
  • Rocker
  • Centrifuga pavimento-modello per la raccolta di coltura batterica e per i campioni a concentrazione
  • Colonne vuote
  • Superdex 200 colonna collegata ad un sistema FPLC

Tabella 2. Attrezzatura necessaria.

Il nome del buffer Contenuti
Tampone di lisi IMAC 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl
Tampone di lavaggio IMAC 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, e 5.0 mm di DM
Tampone di eluizione IMAC 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 5.0 mM di DM, e 300 mM imidazolo
Tampone SDS-campione (5X) (non riducente) 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glicerolo, 2,0% SDS, 0,10% blu di bromofenolo. (1,0% 2-mercaptoetanolo aggiunta per fare un tampone riducente).
Impilabile tampone in gel per SDS-PAGE (4X) 0,50 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% SDS
Risoluzione tampone in gel per SDS-PAGE (4X) 1.5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC equilibrazione 20 mM Tris pH 8.0, 100 mM KCl, e 5.0 mm di DM
Dialisi Liposome HEPES 10 mm, 100 mM KCl

Tabella 3. Il nome del buffer e contenuto.

Figura 1
Figura 1. Preparazione di KvAP per la ricostituzione. Un. Flusso di lavoro generale di proteina espressione, purificazione e ricostituzione. B. purificazione biochimica della proteina. Cultura indotta E. coli XL1-blue KvAP esprimere è stato elaborato e KvAP purificato. Venti microlitri di colture cellulari prima (corsia 1) o dopo (corsia 2) induzione, l'estratto di detersivo (corsia 3), a flusso continuo da cromatografia IMAC (corsia 4), due fasi di lavaggio (corsie 5.6) e 5.0 mg di totale proteica dopo l'300 mM imidazolo eluizione (corsia 7) e 5.0 mg della KvAP tetramero fuori dalla dimensione esclusione FPLC (corsia 8) sono stati sottoposti a non riducente 12% SDS-PAGE e colorazione Coomassie blue.

Figura 2
Figura 2. Ricostituzione di KvAP a Papa / POPG vescicole. Un. Fusione delle vescicole e la solubilizzazione in funzione della concentrazione di detersivo. Assorbanza a 410 nm è stata utilizzata per monitorare la dispersione della luce di vescicole (basale sottratto alla frazione non detergente). Lipidi (PAPA / POPG 03:01) erano 10 mg / ml. Le piccole vescicole unilamellari forte dopo sonicazione, si monodispersa e ha dispersione debole a causa delle loro dimensioni di 30-50 nm di diametro. Quando sono stati introdotti i detergenti, hanno distribuito tra fase soluzione e la fase membrana lipidica. Per la forte curvatura nel piccolo vescicole unilamellari, la detergenti introdotto grilletto fusione della vescicola e il rilascio della curvatura (quindi il potenziale di energia di superficie bassa). Le vescicole fusi sono di dimensioni maggiori e mostrano più forte di scattering a 410 nm. La fase di salita del picco (area grigia) riflette quindi la fusione detergente indotta, un buon regime per la proteina di fusione micelle alle vescicole. La concentrazione del detergente (DM come un esempio qui) proprio al picco di assorbimento è stato infatti scelto per il nostro processo di ricostituzione. B. Cinquanta microlitri di vescicole KvAP ricostituite (KvAP 0,5 mg / ml) è stato separato dal saccarosio gradiente di densità. I campioni di 100 microlitri frazioni da cima a fondo (1 ~ 9) del gradiente di saccarosio sono stati analizzati in un 12% di riduzione SDS-PAGE. Il gel è stato colorato con Coomassie blue. Corsia 3 conteneva ~ 2 mg KvAP.

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Figura 3. Attività elettrica del canale KvAP in bistrati ricostituiti. A. Recording set-up all'interno di una gabbia di Faraday, 1; due elettrodi laterali, 2; trans, 3; laterali cis, 4; ponte salino. B. sezione ingrandita della porzione assottigliata ad un lato della tazza bistrato che mostra un foro 5 , che viene utilizzato per la fabbricazione delle membrane. C. Attività elettrica di canali KvAP che sono fuse nella membrana lipidica nero è stato registrato. Mentre che si terrà a -80 mV, il potenziale di membrana è stata pulsata a 80 mV per 150 msec, e poi cambiato di nuovo al potenziale di mantenimento. La corrente ionica è stato registrato in modalità voltage-clamp utilizzando un amplificatore Axopatch 200B.

Figura 4
Figura 4. Screening per conformatiligandi on-specifici da una libreria di fagi visualizzato. Un. Schema dietro lo screening contro i canali ionici ricostituito in vescicole. Le vescicole sono drogati con biotina-DOPE, e possono essere tirati fuori soluzione perline neutravidina. La conformazione del canale KvAP è controllato da specifici lipidi. Selezioni negative contro perline, vescicole vuote e vescicole con canali in una conformazione diversa sono fatte prima che i fagi sono incubati con i canali in stato conformazionale di destinazione (in DOTAP o cani come esempio qui). I fagi selezionati possono essere amplificati e testati contro canali in bistrati. B. Prove dei fagi selezionati nel centro dello schermo. Attività elettrica del KvAP nel doppio strato in diversi momenti dopo l'aggiunta dei fagi selezionati: traccia nera - prima dell'aggiunta; traccia gialla - 2 min dopo; traccia rossa - 10 min dopo l'aggiunta Top: La libreria di fagi di partenza (totale. ~ 10 10 fagi aggiuntiper il doppio strato) è stato testato su canali in doppio strato, ed è stato trovato per avere nessuna attività rilevabile perché ogni clone fago ha solo circa 100 copie inferiore:. Dopo 12 cicli di selezione, i fagi sono ancora un misto di diversi cloni. L'aggiunta di circa 10 10 fagi ai canali nel doppio strato di piombo per la chiara inibizione dell'attività del canale, il che suggerisce che ci sono cloni positivi che dovrebbero avere alta affinità. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5
Figura 5. Cristallizzazione bidimensionale di KvAP in membrane. A. Immagine di colorazione negativa solo strato di cristalli 2D nel mezzo di ottimizzazione cristallo. I cristalli sono stati colorati con il 6,0% di ammoniomolibdato, pH 6,4 più 0,50% trealosio. Dovuta al zucchero, a volte accatastati con l'altro. La scatola nera quadrata designa una zona che dà luogo al pattern di diffrazione illustrato sul lato destro con macchie di diffrazione andando a ~ 20 Â. B. CryoEM immagine di un cristallo 2D da un campione simile a quello utilizzato in (A). Il campione è stato miscelato con il 3% di trealosio e congelato immergendo diretta, e ripreso sotto un cryoEM. L'immagine è stata ottenuta a 50.000 x. Era chiaro che ci sono stati difetti locali nel imballaggio di cristallo. C. CryoEM immagine di un cristallo ulteriormente ottimizzato. Il campione è stato incorporato in 0,75% di tannino e 10% trealosio e l'immagine è stata presa a 50.000 X. Le linee rette e imballaggio stretto suggerito che i canali erano ben ordinati in questo tipo di cristalli. Le due frecce nere indicano il reticolo quadrato.

Scatole:

Box 1. Preparazione di colonna IMAC

  1. Risospendere accuratamente la resina IMAC.
  2. Trasferire immediatamente la quantità necessaria di resina in sospensione ad un tubo da 50 ml. Usiamo 2 ml volume del letto di resina per la purificazione di KvAP da 2 L cultura.
  3. Centrifugare la provetta a 700 xg per due minuti per far sedimentare giù la resina.
  4. Rimuovere e scartare il surnatante.
  5. Aggiungere 10 il volume del letto MQH 2 O e mescolare brevemente per sciacquare la resina.
  6. Recentrifuge a 700 xg per 2 minuti a pellet giù la resina. Scartare il surnatante.
  7. Aggiungere 10 il volume del letto MQH 2 O e versare nella colonna vuota.
  8. Attendere fino a resina si assesta, e chiudere la colonna con un adattatore di flusso per la cromatografia liquida a bassa pressione.
  9. Esegui 5 volume del letto di MQH 2 O e 5 volume del letto di tampone di equilibrazione attraverso la colonna.

Box 2. Purificazione di Fv

Trasformazione Fv - Giorno 1

  1. Trasforma100 ng del plasmide contenente Fv-His 6 a 60 microlitri di cellule competenti JM83, i batteri sulla piastra quattro piastre LB-agar contenenti 100 pg / ml di ampicillina, e incubare una notte a 37 ° C incubatore.
  2. Preparare 6 X 1 L LB per la coltura batterica.

Espressione di Fv - Giorno 2

  1. Rottami di tutte le colonie dalle piastre in terreno LB. Aggiungere questa sospensione di batteri per 6 X 1 L LB in presenza di ampicillina (100 mg / L) e incubare fino OD600 raggiunge 0,5.
  2. Quando raggiunge 0,5 OD, diminuire la temperatura a 20 ° C ed a 115 RPM. Quando il calo della temperatura a ~ 20 ° C, aggiungere anhydrotetracycline (100 pl di 1mg/ml in DMF a 1 L) per avviare l'induzione dell'espressione della proteina e incubare un'altra 5 ore a 20 ° C con agitazione normale.
  3. Batteri Harvest in 1 L bottiglia centrifugare a 4000 xg per 15 min. Versare il surnatante più possibile. Mantenere i batteri raccolti sul ghiaccio ina 4 ° C in camera fredda per una notte.

Rilasciando le molecole Fv dai batteri - Day 3

  1. Risospendere batteri in 150 ml di Fv rilasciante tampone (50 mM Tris pH 8,0, 20% di saccarosio, 1,0 mM EDTA).
  2. In agitazione con un agitatore magnetico, lisozima aggiungere a 0,1 mg / ml e mantenere i batteri in ghiaccio per 30 min. In seguito, aggiungere MgCl2 a 2.0 mm e tenere in ghiaccio per altri 10-15 min.
  3. Centrifugare i batteri trattati a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. I spheroblasts batteriche dovrebbero scendere al pellet, e la maggior parte delle molecole Fv sono rilasciati nel surnatante.
  4. Dializzare il surnatante contro 4,0 L di tampone di lavaggio (20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl) in camera fredda per almeno 4 ore. Alla fine della giornata, cambiare a tampone di dialisi fresco e Dializzare overnight. A causa del saccarosio nella soluzione, il volume del dializzato aumenterà di circa il 50%. Eccesso di tubo di dialisi dovrebbe essere usato.

Purificazione IMAC e FPLC - Giorno 4

  1. Equilibrare 10 ml volume del letto di resina IMAC purificazione (cfr. riquadro 1) con il buffer di dialisi in tubo da 50 ml.
  2. Trasferire il dializzato dal tubo, aggiungere MgCl 2 a 10 mM e aumentare il volume a 200 ml. Mescolare con la resina pre-equilibrata e incubare per 30 min a 4 ° C.
  3. Riempire la colonna vuota con la resina incubato, e lavare la resina con 5 volumi del letto di tampone di lavaggio, seguito da 5 volume del letto di lavaggio tampone con 10 mM imidazolo e 30 mM imidazolo ciascuno.
  4. Eluire le proteine ​​con 20 ml di tampone di lavaggio più 300 mM imidazolo.
  5. Esegui il Fv concentrato attraverso Superdex 200 colonna pre-equilibrata con tampone di lavaggio. Pool le frazioni contenenti Fv (picchi tipici presenta a 17,6 ml di volume di ritenzione) insieme e si concentrano. Determinare la concentrazione del campione utilizzando il coefficiente di estinzione di Fv a 280 nm.

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Discussion

La ricostituzione dei canali KvAP in diverse membrane è stata utilizzata in diversi studi 8-10. Seguendo l'idea di garantire la distribuzione dei lipidi tra detergenti / lipide micelle miste e le proteine ​​/ detergente / lipide micelle miste, siamo in grado di raggiungere quasi completa ricostituzione del KvAP nelle membrane in molto differenti lipidi. Ogni canale KvAP tetramerica bisogno ~ 100 molecole lipidiche per coprire pienamente il suo dominio transmembrana. Il requisito essenziale è permettere molecole lipidiche insufficienti per fusibile nel proteine ​​/ lipidi / detergente micelle prima i detergenti sono rimossi. Le nostre condizioni standard (0,5 mg di proteine ​​e lipidi 5,0 mg) garantire che non vi sono in media ~ 1.000 molecole lipidiche per molecola proteica. Il nostro esperimento di galleggiamento e di esperimenti biochimici hanno confermato che la ricostituzione è quasi completo. Registrazioni elettriche dai canali inseriti in membrane lipidiche nere, la proiezione dei canali ricostituiti unagainst una libreria peptidica fago visualizzato e la crescita dei cristalli 2D dei canali nelle membrane dimostrano tutte le applicazioni di successo di membrana ricostituzione per vari scopi.

I lipidi-dipendenti cambiamenti conformazionali dei canali KvAP e la proiezione contro una libreria di fagi visualizzata peptide vetrina una nuova strada per lo screening per bloccanti dei canali o attivatori dei canali con metodi biochimici, invece di affidarsi a elettrofisiologia per mantenere i canali in conformazioni specifiche 8. Il successo nel nostro schermo per leganti conformazione-specifici suggerisce che la stessa strategia può essere applicata a trovare leganti specifici per la conformazione attivato. E 'prevedibile che i canali ricostituito in vescicole possono essere usati contro singoli Fv librerie di catena, librerie Fab, ecc Allo stesso modo, altre proteine ​​di membrana possono essere eseguite attraverso queste operazioni e garantire il loro leganti stretti che possono essere utili a vari scopi. Noi crediamo che questo neMetodo w vedrà applicazioni più generali in futuro.

Sistemi a membrana ricostituite permetteranno la delucidazione dei dettagli chimici che stanno dietro gli effetti sui lipidi sulle proteine ​​di membrana 11. Interazione proteina-lipide è stato conosciuto per essere importante per molte proteine ​​di membrana, ed è stato sottoposto a diversi studi in passato 3. Negli studi basati sulle cellule, manipolazioni possono essere implementate per modificare i componenti specifici nelle membrane e poi i cambiamenti funzionali nelle proteine ​​di membrana sono associati con i cambiamenti strutturali e composizionali nelle membrane. Tali connessioni sono indiretti e potrebbero derivare da molteplici fattori nelle membrane cellulari che non ben caratterizzati. In una membrana omogenea ricostituito, è più definitivo negli allacciamenti fra i cambiamenti strutturali e funzionali delle proteine ​​di membrana e le variazioni nella composizione lipidica e proprietà di membrana. In ultima analisi, per capire tegli principi chimici dietro l'interazione lipidi-proteine, abbiamo bisogno di delineare la distribuzione dei lipidi in tutto il dominio transmembrana, e per comprendere i cambiamenti dinamici di questi lipidi, proprio accanto alle proteine. Un sistema ricostituito sembra essere un modo affidabile verso tale comprensione.

Ricostituzione di proteine ​​di membrana richiede la rimozione controllata dei detergenti dalle proteine ​​/ lipidi / detergente micelle miste, e la fusione delle micelle miste in grandi quelli che alla fine si trasformano in vescicole 30. Tre metodi diversi vengono utilizzati per la rimozione di detergenti, dialisi, perline e ciclodestrine 14, 31, 32. Ma resta difficile ottenere un ben controllato, graduale rimozione dei detergenti da un piccolo volume 33, 34. Un metodo ideale per la rimozione detersivo prenderebbe i detergenti fuori della fase acquosa in modo uniforme sull'intero volume in un ritmo controllabile, e non dovrebbe esercitare forte interferenza on la ricostituzione delle membrane a doppio strato. Tale metodo potrebbe essere in grado di cambiare la velocità e l'efficacia di ricostituzione, e probabilmente consentire alla ricostituzione in un piccolo volume. Una combinazione di lenta diluizione e qualsiasi dei tre metodi convenzionali per la rimozione del detersivo può avvicinarsi a questo obiettivo. Lenta diluizione introducendo piccole quantità di acqua nella miscela di proteine ​​/ detergente / lipide è un modo controllabile per diminuire la concentrazione di detersivo uniformemente fino alla sua CMC. La rimozione detersivo poi è meno critica per la formazione delle vescicole, sebbene ancora importante per la fusione di piccole vescicole in quelle più grandi. Altri modi per ottenere la rimozione detergente controllata devono ancora essere concepito e sviluppato.

Nostra procedura di ricostituzione tiene conto della distribuzione dei lipidi tra micelle miste e la fusione indotta detergente di vescicole nonché le micelle miste. Il suo successo apre la strada che porta a un più ampio spettro di applicazioni del rvescicole econstituted, molto più che le tre direzioni che abbiamo presentato. L'adattamento della nostra procedura ad altre proteine ​​di membrana non dovrebbe incontrare serie limite tecnico. Anche se molte proteine ​​di membrana sono stati ricostituiti in un modo o nell'altro, è stato difficile raggiungere quasi completo ricostituzione e per valutare la funzionalità delle proteine ​​da più prospettive diverse. I nostri sforzi per la ricostituzione KvAP suggeriscono che i nostri metodi possono consentire piena ricostituzione e sarà adatto per questi scopi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli studi sulla KvAP nel Jiang laboratorio hanno ottenuto un aiuto significativo dal laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon presso la Rockefeller University. Un ringraziamento particolare va al Dott. Kathlynn Brown e Michael McQuire per i loro consigli e aiuto sui nostri esperimenti fago schermo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

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References

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