संस्कृति में विभेदित मानव Neuroprogenitor कोशिकाओं से न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION

1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

मानव neuroprogenitor कोशिकाओं (NPCs) proliferating परिस्थितियों में विस्तार किया गया. NPCs neurotrophins का एक संयोजन की उपस्थिति में न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों में भेदभाव किया गया. Neuronal मार्करों immunofluorescence धुंधला द्वारा पता चला रहे थे. न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए, NPCs कलम झिल्ली स्लाइड पर भेदभाव कर रहे थे और लेजर कब्जा MICRODISSECTION प्रदर्शन किया गया था.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

मानव भ्रूण के मस्तिष्क से अलग Neuroprogenitor कोशिकाओं (NPCs) epidermal वृद्धि कारक (EGF) और कोशिकाओं का एक प्रचुर मात्रा में आपूर्ति प्रदान करने के लिए fibroblast वृद्धि कारक (FGF) की उपस्थिति में proliferative परिस्थितियों में विस्तार किया गया. NPCs तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) का एक नया संयोजन की उपस्थिति में भेदभाव कर रहे थे, मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF), dibutyryl शिविर (डीबीसी) और पाली एल lysine और माउस laminin साथ लेपित व्यंजन पर retinoic एसिड न्यूरॉन प्राप्त करने के लिए अमीर संस्कृतियों. NPCs भी neurotrophins का अभाव, डीबीसी और retinoic एसिड में और astrocyte युक्त संस्कृतियों उपज के लिए सिलिअरी neurotrophic कारक (CNTF) की उपस्थिति में भेदभाव कर रहे थे. विभेदित NPCs NeuN, synapsin, एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़, synaptophysin और GAP43 सहित neuronal मार्करों के एक पैनल के लिए immunofluorescence धुंधला द्वारा विशेषता थे. Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और STAT3, astrocyte मार्कर, विभेदित NPCs के 10-15% में पाया गया. सुविधा के लिएसेल प्रकार विशिष्ट आणविक लक्षण, लेजर कब्जा MICRODISSECTION पॉलीथीन naphthalate (पेन) झिल्ली स्लाइड पर सभ्य न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए प्रदर्शन किया था. इस अध्ययन में वर्णित तरीकों neurodegeneration के आणविक तंत्र की हमारी समझ अग्रिम करने के लिए कीमती उपकरण प्रदान करते हैं.

Introduction

जीवन भर न्यूरोजेनेसिस पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र में और वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क 1 की दांतेदार गाइरस के subgranular परत में होने के लिए जाना जाता है. Neuroprogenitor कोशिकाओं (NPCs) है कि इन क्षेत्रों से उत्पन्न न्यूरॉन्स astrocytes और oligodendrocytes 2 में अंतर कर सकते कि multipotent कोशिकाओं रहे हैं. NPCs क्योंकि पार्किंसंस रोग, amyotrophic पार्श्व काठिन्य, स्ट्रोक और अल्जाइमर रोग (ई.) 3 सहित विभिन्न neurodegenerative विकारों के साथ रोगियों में प्रत्यारोपित किया जा करने के लिए अपनी क्षमता की रुचि उत्पन्न की है. NPCs के साथ अध्ययन आम तौर पर इस प्रत्यारोपण के कोण पर ध्यान केंद्रित किया है लेकिन neurodegeneration के तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक सेल संस्कृति मॉडल के रूप में एनपीसी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की क्षमता पूरी तरह दोहन नहीं किया गया. वे नहीं कर रहे हैं के रूप में पिछले अध्ययनों से आम तौर पर एक प्रयोग के लिए अलग किया जा करने की जरूरत है जो कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों से अलग बाद mitotic न्यूरॉन्स का इस्तेमाल किया हैस्वयं renewing. एसएच SY5Y और एस एन एम सी कोशिकाओं सहित मानव neuroblastoma सेल लाइनों का विस्तार किया जा सकता है, वे प्राथमिक न्यूरॉन्स की विशेषताओं की जरूरत नहीं है. वे कई मार्ग के लिए विस्तारित किया जा सकता है और प्राथमिक न्यूरॉन्स 4,5 की विशेषताओं के साथ एक सेल की आबादी उत्पन्न करने के लिए भेदभाव किया जा सकता है, क्योंकि मानव NPCs, दूसरे हाथ पर, दोनों लाभ प्रदान करते हैं. वर्तमान अध्ययन में, हम मानव भ्रूण के मस्तिष्क से अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NPCs से लगातार न्यूरॉन समृद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए एक नया भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन. इन संस्कृतियों glial कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत होते हैं, इसलिए, हम आणविक लक्षण वर्णन के लिए न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी को अलग करने के अतिरिक्त तरीकों की जरूरत है. लेजर कब्जा MICRODISSECTION (LCM) एक ऊतक अनुभाग से कोशिकाओं का एक समरूप जनसंख्या चुनिंदा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 6 कब्जा किया जा सकता है जिसके द्वारा एक उपन्यास तकनीक है. मस्तिष्क के न्यूरॉन्स, glia और अन्य सेल Ty से मिलकर एक विषम ऊतक हैPES. एलसीएम न्यूरॉन विशेष जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण किया गया है 7-10 विश्लेषण करती है. हम पहले से विशेष रूप से hippocampal न्यूरॉन्स 11 में कमी आई चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति (CREB) और BDNF प्रदर्शन के लिए विज्ञापन (Tg2576) माउस मस्तिष्क वर्गों से hippocampal न्यूरॉन्स की एलसीएम प्रदर्शन किया है. अध्ययन में मौजूद है, हम कलम झिल्ली स्लाइड पर सभ्य न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए मानव NPCs के विस्तार, neuronal भेदभाव, neuronal मार्करों के लिए immunofluorescent धुंधला और एलसीएम के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मानव NPCs के विस्तार (चित्रा 1)

  1. जमे हुए भ्रूण के मस्तिष्क (Lonza, Walkersville, एमडी, यूएसए) और प्रसार की खुराक, EGF (10 एनजी / एमएल) युक्त Neurobasal मध्यम में neurospheres (चित्रा 1 ए) के रूप में टी 75 बोतल में निलंबन में संस्कृति उनमें से मानव NPCs के शेयर और पुनर्जीवित FGF (10 एनजी / एमएल).
  2. संस्कृति में 3 दिनों के बाद, 5 मिनट के लिए 500 rpm पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र neurospheres हस्तांतरण.
  3. सेल गोली ऊपर ~ 100 μl मध्यम पीछे छोड़ने पर तैरनेवाला त्यागें और एक Eppendorf ट्यूब में हस्तांतरण. एक 100 μl सेल गोली 2 टी 75 बोतल में विभाजित करने के लिए पर्याप्त है. Neuroprogenitor कोशिकाओं पतली विभाजित अगर पैदा करना असफल के रूप में कम, बोतल की संख्या कम हैं.
  4. ट्यूब के नीचे के खिलाफ 200 μl टिप रखते हुए एक 200 μl टिप 50x के साथ गोली Triturate. समान रूप से दो भागों में सेल निलंबन फूट डालो और 2 टी 75 बोतल (1-2 विभाजन) जारी रखा, के लिए एक के लिए उन्हें जोड़नेभेदभाव के विस्तार और अन्य.
  5. Neurospheres 300-500 माइक्रोन के अपने मूल आकार तक पहुंचने तक हर 4-5 दिनों मध्यम बदलकर विस्तार (प्रथम कुप्पी) के लिए neuroprogenitor कोशिकाओं की संस्कृति जारी. (500 आरपीएम, 5 मिनट) centrifugation द्वारा मध्यम बदलें, पुराने मध्यम त्यागें और नए माध्यम जोड़ें.

2. एक न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति में मानव NPCs के भेदभाव (चित्रा 2)

  1. एक न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति में neuroprogenitor कोशिकाओं की भिन्नता के लिए, प्रत्येक कुएं में 500 μl जोड़कर पाली एल lysine की 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली और कोट के प्रत्येक कुएं में एक एकल coverslip जगह. आरटी पर 30 मिनट के लिए व्यंजन सेते हैं.
  2. पाली एल lysine समाधान Aspirate और बाँझ पानी के साथ थाली कुल्ला.
  3. अगला, कोट 5 ग्राम / एमएल माउस laminin की 500 μl के साथ थाली के कुओं और 30 मिनट के लिए सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ कुओं धो लो.
  4. 4 दिन splitti के बादकोशिकाओं (1.4 कदम) एनजी, 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह ~ 500 neurospheres के घनत्व पर लेपित व्यंजन में 'भेदभाव के लिए' लेबल कुप्पी में छोटे neurospheres हस्तांतरण.
  5. Neurospheres पकवान के लिए देते हैं जब 6 घंटे के बाद, प्रसार मध्यम हटाने और Neurobasal मध्यम से मिलकर भेदभाव मध्यम जोड़ने, B27 पूरक, NGF (20 एनजी / एमएल), BDNF (10 एनजी / एमएल), डीबीसी (100 मिमी), और retinoic एसिड (2 माइक्रोन).

3. विभेदित NPCs के immunofluorescence धुंधला (चित्रा 3)

  1. दो सप्ताह के लिए neuronal भेदभाव मध्यम में neuroprogenitor कोशिकाओं की संस्कृति के बाद, एक न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति प्राप्त की है. एक बार पीबीएस में न्यूरॉन्स कुल्ला और फिर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में उन्हें ठीक. तय कर लेंगे, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला.
  2. 60 मिनट के लिए आरटी पर permeabilization बफर (5% BSA और पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस मैं पर बर्तन ओ / एन सेतेNA निम्नलिखित पीबीएस में 3% BSA में पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के संयोजन के साथ एक प्रकार के बरतन: NeuN (1:250) और synapsin (1:250); cholinesterase एसिटाइल (1:500) और synaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) और GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) और GFAP (1:1,000).
  4. पीबीएस के साथ coverslips तीन बार धोएं और फिर 90 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी पर विरोधी खरगोश Cy3 और विरोधी माउस FITC माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उन्हें सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ coverslips तीन बार धोएं.
  5. संदंश के साथ संस्कृति पकवान से coverslip बाहर ले, और बढ़ते मध्यम पर यह उल्टा जगह है, एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते मध्यम के 10 μl रखें. धीरे, किसी भी अधिक के बढ़ते मध्यम पोंछ और नेल पॉलिश के साथ किनारों को सील.
  6. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में immunostained न्यूरॉन्स की जाँच करें.

4. न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION (चित्रा 4)

  1. कलम झिल्ली स्लाइड पर एक न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति में NPCs अलग हैचित्रा 2 के लिए वर्णित प्रक्रियाओं का पालन पाली एल lysine और माउस laminin साथ लेपित है.
  2. RNase मुक्त परिस्थितियों में बाद के सभी चरणों को पूरा करें.
  3. कोशिकाओं कल्पना HistoGene दाग (Arcturus) का उपयोग संस्कृतियों दाग.
  4. वेरिटास एलसीएम प्रणाली के साथ पूरे स्लाइड का रोड मैप छवि का उपयोग astrocytes से रहित शुद्ध neuronal आबादी के क्षेत्रों का पता लगाएं. आरेखण उपकरणों का उपयोग न्यूरॉन्स निशान.
  5. एक दो कदम प्रक्रिया में कंप्यूटर नियंत्रित सटीक और स्वचालन का उपयोग कर इन क्षेत्रों के लेजर कब्जा प्रदर्शन. सबसे पहले, आईआर (इन्फ्रारेड) झिल्ली टोपी के लिए देते हैं पाने के लिए 70 मेगावाट और 2,500 μsec की एक नाड़ी की एक लेजर सत्ता स्थापित करने के साथ कई स्थानों पर गोली चलाई है. अगला, चिह्नित क्षेत्र 10 एमवी का एक कम स्तर पर स्थापित करने में एक यूवी काटने के उपकरण का उपयोग excised है.
  6. इन प्रक्रियाओं का चुनिंदा CapSure एलसीएम मैक्रो टोपियां पर कलम झिल्ली से चिह्नित क्षेत्रों पर कब्जा किया. टोपी को उठा लिया जाता है, एन के साथ झिल्लीeurons टोपी का पालन करता है.
  7. एक PicoPure आरएनए अलगाव किट (Arcturus) का उपयोग एलसीएम नमूनों से कुल शाही सेना को अलग और DNase के साथ व्यवहार करते हैं.
  8. किट से निर्देशों का पालन RiboAMP आरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग कर अलग आरएनए बढ़ाना.
  9. मानव neurofilament भारी श्रृंखला (hNFHc) का पता लगाने के लिए TaqMan जांच का उपयोग वास्तविक समय RT-पीसीआर विश्लेषण करते हैं.

लघुरूप:

ई., अल्जाइमर रोग, BDNF, मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक, CREB, चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन, डीबीसी, Dibutyryl चक्रीय एएमपी; EGF, epidermal वृद्धि कारक, FGF, fibroblast वृद्धि कारक, GFAP, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन, एलसीएम, लेजर microdissection कब्जा, NGF, तंत्रिका वृद्धि कारक, एनपीसी, neuroprogenitor सेल, पेन, पॉलीथीन naphthalate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NPCs के विस्तार (चित्रा 1)

Neurospheres विचूर्णन द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन के लिए टूट रहे हैं, पिपेट टिप निलंबन ऊपर और नीचे pipetted है जब कुछ प्रतिरोध इतना है कि वहाँ ट्यूब के नीचे स्पर्श की जरूरत है. विचूर्णन के अवसरों की संख्या व्यक्तियों और एक खुर्दबीन के नीचे परिणामस्वरूप सेल निलंबन का परीक्षण करके परीक्षण और त्रुटि द्वारा तय किए जाने की जरूरत के बीच अलग अलग होंगे. NPCs निकट संपर्क में आते हैं जब प्रसार एक तेज दर से किया जाएगा क्योंकि यह सेल निलंबन की पर्याप्त घनत्व प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है. NPCs हो जाना नहीं है, तो सेल घनत्व बोतल की संख्या को कम करने से वृद्धि की जानी चाहिए. हम अप करने के लिए 10-15 अंश के लिए neurospheres का विस्तार करने में सक्षम है. मानव NPCs के इस प्रकार प्रचुर मात्रा में आपूर्ति के लिए मानव भ्रूण ऊतक के उपयोग को कम करने, उत्पन्न किया जा सकता है. NPCs और न्यूरॉन्स की निरंतर आपूर्ति के लिए, यह बाद में 3-4 मार्ग के लिए शुरू में उन्हें विस्तार करने के लिए वांछनीय है और, NPCs के आधा neurospheres के रूप में विस्तारित किया जा सकता है और अन्य आधा चल रहे प्रयोगों के लिए भेदभाव किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, NPCs भी शेयरों की बड़ी आपूर्ति उत्पन्न करने के लिए सेल लाइनों के मामले में के रूप में तरल नाइट्रोजन में जमे हुए अधिक मार्ग, के लिए विस्तार किया, और जब जरूरत को पुनर्जीवित किया जा सकता है. यह NPCs के विभिन्न बैचों से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के साथ प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए भी वांछनीय है.

NPCs के neuronal भेदभाव (चित्रा 2)

NPCs multipotent कोशिकाओं रहे हैं और संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है न्यूरॉन्स astrocytes या oligodendrocytes में भेदभाव किया जा सकता है. हमारी भेदभाव प्रोटोकॉल लेपित व्यंजन (2A चित्रा) में 4 दिन पुरानी neurospheres के बोने शामिल किया गया. हम यह फर्क न्यूरॉन्स के आसपास फैला है और neuronal प्रक्रियाओं के एक घने नेटवर्क के रूप में इतनी है कि neurospheres की पर्याप्त घनत्व बीज के लिए आवश्यक है कि मनाया. छवियों के बाद 1 (चित्रा 2 बी) और 4 दिन (चित्रबोने की ure -2 सी) दिखाए जाते हैं. 80-90% न्यूरॉन्स और 10-15% astrocytes उपज न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति, NGF, BDNF, डीबीसी और दो ​​सप्ताह (चित्रा 2 डी) के लिए retinoic एसिड का एक संयोजन की उपस्थिति में NPCs के भेदभाव के बाद प्राप्त किया गया. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, neuronal भेदभाव के लिए इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल दूसरों के द्वारा पहले से सूचित नहीं किया गया है. कम घनत्व के क्षेत्रों में, NPCs astrocytes (चित्रा 2 ई) में विभेदित. एक astrocyte युक्त संस्कृति को प्राप्त करने के लिए, NPCs CNTF (10 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में और NGF, BDNF, डीबीसी और retinoic एसिड के अभाव में संवर्धित किया जा सकता है. इस प्रकार न्यूरॉन astrocyte रचना प्रयोग करने के उद्देश्य के आधार पर भेदभाव के दौरान चालाकी से किया जा सकता है.

विभेदित न्यूरॉन्स की विशेषता (चित्रा 3)

आगे इन विभेदित NPCs चिह्नित करने के लिए, हम w neuronal मार्करों के लिए दोहरी immunostaining प्रदर्शन कियाCy3 (लाल) और क्रमशः FITC (हरा) से जुड़ा हुआ खरगोश और माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए जोखिम द्वारा पीछा ith पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी,. निम्नलिखित neuronal मार्कर पाया गया: चित्रा 3:. NeuN और synapsin 3B चित्रा:. Acetyl cholinesterase (दर्द) और synaptophysin चित्रा -3 सी: BDNF और GAP43. इस प्रकार, विभेदित NPCs प्राथमिक न्यूरॉन्स के लक्षण हैं. इसके अलावा, astrocyte मार्करों STAT3 और GFAP कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी (चित्रा 3) में पाया गया. इसलिए अतिरिक्त तरीकों न्यूरॉन विशेष जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं.

न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION (LCM) (चित्रा 4)

वे दृढ़ता से लेपित व्यंजन से जुड़े होते हैं, क्योंकि एलसीएम एक संस्कृति डिश में विफल रहे, न्यूरॉन्स के साथ एलसीएम की हमारी आरंभिक प्रयास से कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस समस्या को दूर करने के लिए, हम NPCs ओ विभेदितn पाली एल lysine और माउस laminin साथ लेपित कलम झिल्ली आवेषण के साथ स्लाइड. स्लाइड एक 100 मिमी सेल संस्कृति पकवान (चित्रा -4 ए) के अंदर रखा गया था. कलम झिल्ली स्लाइड और LCM टोपी की व्यवस्था 4B चित्रा में दिखाया गया. संस्कृति कोशिकाओं (चित्रा 4C) कल्पना करने के लिए HistoGen दाग (Arcturus) के साथ दाग रहे थे. स्लाइड आर्कटुरस वेरिटास साधन में माइक्रोस्कोप में रखा गया था. कब्जा होने की न्यूरॉन्स ड्राइंग उपकरण (चित्रा 4D) के साथ चिह्नित किया गया. CapSure एचएस कैप्स कलम झिल्ली पर रखा गया था. यूवी लेजर काटने और आईआर लेजर कब्जा का एक संयोजन का उपयोग करना, चिह्नित क्षेत्रों टोपी पर एकत्र किए गए थे. पर कब्जा कर लिया न्यूरॉन्स कम पर टोपी (चित्रा 4F) और उच्च (चित्रा 4F) बढ़ाई पर दिखाए जाते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1.मानव NPCs के विस्तार. ए NPCs neurospheres के रूप में T75 बोतल में निलंबन में सुसंस्कृत थे. Neurospheres 300-500 माइक्रोन के आकार पर पहुंच गया जब बी, वे 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरित और 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर centrifuged थे. सी. सतह पर तैरनेवाला खारिज किया गया था और 200 μl मध्यम में सेल गोली Eppendorf ट्यूबों को हस्तांतरित और triturated किया गया था. विभाजित होने के लिए तैयार डी. Neurospheres दिखाए जाते हैं. विचूर्णन निम्नलिखित ई. टूटी neurospheres दिखाए जाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. मानव NPCs के भेदभाव. ए Neurospheres नई neurospheres उत्पन्न करने के लिए चार दिनों के लिए विचूर्णन और सुसंस्कृत से टूट गए थे. बी चार दिन पुरानी neurospheres पाली एल lysine और माउस laminin साथ लेपित व्यंजन में वरीयता प्राप्त थे. सी. वैशिष्ट्यNPCs के tion बोने के बाद तीन दिनों में NGF, BDNF, डीबीसी और retinoic एसिड की उपस्थिति में मनाया गया. डी. न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति दो सप्ताह के बाद प्राप्त हुई थी. ई. NPCs कम घनत्व के क्षेत्रों में astrocytes में विभेदित. एफ NPCs CNTF (10 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में और NGF, BDNF, डीबीसी और retinoic एसिड के अभाव में एक astrocyte अमीर संस्कृति में भेदभाव.

चित्रा 3
चित्रा 3. Neuronal और. NPCs दो सप्ताह के लिए विभेदित विभेदित मानव NPCs में astrocyte मार्कर तय की और पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संकेत दिया लक्ष्यों के लिए immunostained दोहरे, Cy3 (लाल) और क्रमशः FITC (हरा) से जुड़ा हुआ खरगोश और माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए जोखिम से पीछा किया गया था. निम्नलिखित neuronal मार्करों पता चला रहे थे: NeuN और synapsin.बी Acetyl cholinesterase (दर्द) और synaptophysin. सी. BDNF और GAP43. इसके अलावा, निम्न astrocyte मार्करों पता चला रहे थे: डी. STAT3 और GFAP.

चित्रा 4
चित्रा 4. न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION. ए NPCs पाली एल lysine और माउस laminin साथ लेपित एक कलम झिल्ली स्लाइड पर भेदभाव कर रहे थे. स्लाइड एक 100 मिमी सेल संस्कृति डिश के अंदर रखा गया था. बी आर्कटुरस वेरिटास साधन में कलम झिल्ली स्लाइड और एलसीएम कैप की व्यवस्था दिखाए जाते हैं. सी. संस्कृति कोशिकाओं कल्पना HistoGen दाग (Arcturus) के साथ दाग रहे थे. डी. कब्जा होने की न्यूरॉन्स आरेखण उपकरण के साथ चिह्नित किया गया. पर कब्जा कर लिया न्यूरॉन्स कम पर टोपी (ई) और उच्च (एफ) magni पर दिखाए जाते हैंदिखाएं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम इस अध्ययन में स्वयं renewing मानव neuroprogenitor कोशिकाओं के भेदभाव से एक न्यूरॉन अमीर सेल संस्कृति मॉडल और लेजर कब्जा MICRODISSECTION द्वारा न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम NGF, BDNF, डीबीसी और NPCs के neuronal भेदभाव के लिए retinoic एसिड का एक संयोजन का इस्तेमाल किया है. डीबीसी CREB, न्यूरोजेनेसिस 12 को बढ़ाता है कि एक प्रतिलेखन कारक सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Retinoic एसिड सेल चक्र से बाहर निकलें लाती और glial आबादी 13 कम कर देता है. इस अध्ययन में वर्णित विधि हमारी पिछली रिपोर्ट पर 14 संशोधनों को शामिल किया गया. हम पहले एक एकल कक्ष निलंबन को neurospheres triturating और फिर लेपित व्यंजन में यह बोने के कदम का इस्तेमाल किया था. यह कम घनत्व (चित्रा 2 ई) के क्षेत्रों में अक्षम neuronal भेदभाव पैदा कर सकते हैं. हम अब वैशिष्ट्य के बीच संपर्कों को सुनिश्चित करने के लिए चार दिन पुराने छोटे neurospheres (चित्रा 1 बी) बोने की प्रक्रिया शुरू की हैting न्यूरॉन्स (चित्रा 1C). इसके अलावा, भेदभाव पूरक (सेल टेक्नोलॉजीज स्टेम) 4-5 दिनों बोने के बाद, B27 पूरक (Invitrogen) के साथ बदल दिया है. वर्तमान पद्धति लगातार 80-90% न्यूरॉन्स पैदावार. प्रक्रियाओं की एक व्यापक नेटवर्क के साथ इन न्यूरॉन्स, 2-3 महीने के लिए संस्कृति में मानव neuroblastoma सेल लाइनों के भेदभाव से उत्पन्न neuronal मॉडल पर एक विशिष्ट लाभ को बनाए रखा जा सकता है. NeuN, synapsin, एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़, synaptophysin और GAP43 सहित कई neuronal मार्करों के लिए immunostaining विभेदित NPCs (चित्रा 3) के साथ मनाया गया. STAT3 और GFAP, astrocytes के मार्कर भी कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी में पाया गया. 2-5 सुक्ष्ममापी retinoic एसिड की एकाग्रता में वृद्धि करके, astrocyte आबादी और कम किया जा सकता है. Glial कोशिकाओं की वृद्धि कारकों के स्राव से neuronal अस्तित्व का समर्थन हालांकि, क्योंकि ऐसी संस्कृतियों एक लंबी अवधि के लिए नहीं रखा जा सकता. हमने देखा है कि यह3-5 दिनों के प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले retinoic एकाग्रता बढ़ाने के लिए वांछनीय है.

विभेदित न्यूरॉन्स की विषम प्रकृति सेल प्रकार विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा निर्धारित करने के संदर्भ में चुनौतियों प्रस्तुत करता है. इसलिए, हम सभ्य न्यूरॉन्स का एलसीएम (चित्रा 4) के लिए शर्तें अनुकूलित है. वे मजबूती से जुड़े होते हैं के रूप में इस तकनीक नियमित रूप से सेल संस्कृति व्यंजन पर सभ्य न्यूरॉन्स के साथ कठिनाइयों प्रस्तुत क्योंकि वर्तमान अध्ययन में, हम कलम झिल्ली सम्मिलित करता है और प्रदर्शन किया एलसीएम साथ स्लाइड्स पर NPCs विभेदित. एलसीएम के उद्देश्यों immunohistochemical विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है, एलसीएम, आरएनए स्तर पर संकेत बढ़ाना मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता है, और सटीक quantitation सहित कई लाभ प्रदान करता है. माइक्रोएरे के साथ संयुक्त, एलसीएम चयनित सेल प्रकार 15 में जीनों के हजारों की अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

घोषित करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष.

Acknowledgments

यह काम (सपा) के लिए दिग्गजों प्रशासन से मेरिट समीक्षा अनुदान (NEUD-004-07F) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics