Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu

Bioengineering
 

Summary

Fermantörler biyomühendislik hücrelerinin kültür verim ve verimliliği artırmak için kullanılır. Çalkalama şişelerinde birden fazla mikrobiyal ya da hayvan hücre kültürü aday tarama sonra, bir sonraki mantıksal aşama fermantöre Seçilen kültürün biyokütle artırmaktır. Bu video, tipik bir tezgah üstü biyoreaktör sisteminin kurulumunu ve çalışmasını gösterir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a Benchtop Bioreactor. J. Vis. Exp. (79), e50582, doi:10.3791/50582 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fermentasyon sistemleri hücre kültürleri çok farklı türleri için uygun bir büyüme ortamı sağlamak için kullanılır. Dikkatli sıcaklık, pH ve özellikle çözünmüş oksijen konsantrasyonunu kontrol etmek için mayalama sağladığı yeteneği etkili büyük ölçekli büyümesi ve fermantasyon ürünlerinin ifadesinin onları gerekli kılar. Bu video kısaca sallama şişesi üzerinde, fermentöre avantajlarını anlatacağız. Aynı zamanda tipik bir tezgah üstü fermantasyon sisteminin önemli bileşenlerini belirlemek ve sondaları, geminin ve kalibrasyon kurulumu hakkında temel eğitimi verecek. Izleyici, sterilizasyon işlemi ile aşina ve kültür ile, kap içindeki büyüme ortamı aşılamak için nasıl gösterilir. Operasyon, örnekleme, ve hasat temel kavramlar da gösterilecektir. Basit veri analizi ve sistem temizleme da ele alınacaktır.

Introduction

Temel Teknoloji fermantasyon kültür üretmek için basit bir çalkalama şişesi tekniğinin bir uzantısıdır. Bu daha tam ve nicel bir şekilde canlı kültürleri için büyüme ortamları kontrol etmek arzusu büyümüştür. Toplu kültür çalkalama şişeleri genellikle sıcaklığın kesin kontrolü ile sınırlıdır. Bir kuluçkaya çalkalayıcı veya sıcak bir odada sıcaklık tekdüzelik bazen 5 ° C ayrılmanın veya amaçlanan set daha, çok değişkendir. Çalkalama şişesi, normal olarak sabit bir hızda çalkalanmıştır olduğu için, oksijen kullanımı ve gaz değişimi sınırlıdır. Mevcut ortam oksijen bitince, çoğu kültürde gelişmek için başarısız. Çalkalama şişelerinde hiç bir pH kontrolü yoktur. Kültür besleme stoku ile sınırlı değilse, bir çok durumda, bu kültüre zarar noktasına asidik hale gelir ve solunum önemli ölçüde yavaşlatır. En çalkalama balonu kültürleri ayrıca inoculatio ya da kültürlerin başlangıcında yakınında sadece bir kez beslenir anlamına gelen bir "yığın" olarak çalıştırılırn. Bu ilk karbon kaynağı tüketildikten sonra, kültür büyüme durur. Bazı durumlarda metabolizması kayması ve kültür et suyu içinde başka metabolitleri tüketmeye başlar, bazen edilen biyokütle veya proteinin özelliklerini değiştirmek olabilir. Çalkalama şişelerinde aynı zamanda 37 ° C 'de sıcak bir kültür ortamı, 24 saat başına hacim, tipik olarak% 10 in ortam buharlaştıncı kaybı genellikle tabidir Bu kayıp kültürünün yoğunluğunu değiştiren ve sistemin uzun süreli çalışmasını engeller. Son olarak, kullanıcının çalkalama sonra ortamdan köpük karşılaşabilir. Yukarıdaki kültür üst kısmında bir köpük oluşumu gaz değişimi ve bundan başka genu büyümesini sınırlar.

Temel fermantasyon sistemi bu sınırlamalar tüm çözmek için tasarlanmıştır. Dikkatli sıcaklık kontrolü pervane çalkalama ve bir ısıtma ceketi kullanımı ile fermantasyon damarları elde edilir. Genellikle bu ceket ısıtma ve soğutma kabı ve geri besleme kontrolü içine yerleştirilen sensorset etrafında ± 0.1 ° C sıcaklık kontrolü sonuçları. Benchtop fermante genellikle bir pompa aracılığıyla sıvı reaktif madde ilave edilerek pH kontrolü sağlar. PH değeri sürekli hücre büyümesi için ortam optimum tutmak için bir çaba olarak izlenir. Uygun havalandırma belirtilen karıştırma pervane tarafından veya doğrudan kültür içine hava veya oksijen ilave gaz infüzyonu ile muhafaza edilmektedir. Kesme duyarlı kültürleri ile, oksijen takviye gaz kültüründe oksijen seviyesinin bakım için ana mekanizmadır. Solüsyonu içinde oksijenin ölçümü, genellikle çalkalama şişelerinde kullanım için normal olarak mevcut olmayan bir polarografik sonda ile elde edilir. Bu, sürekli veya periyodik olarak, bir doğrusal ya da lineer olarak bir büyüme sağlamak için kaba yem ilave etmek de mümkündür. Çıkış gazı kondansatör ve böylece kültür hacmi ve yoğunluk koruyarak aktarmak egzoz gazı akışında buhar için soğuk bir yüzey sağlar. Köpük önleyici yüzey aktif periyodik olarak ek çalıştırılırYüzeyde köpük azaltılması ve gaz alışverişini sağlayan kültüründe bir iletkenlik probu ile.

Bu kap, her probları ile, bağlantı parçaları, fanlar, hasat borular ve tüpler, monte edilir ve standart bir otoklavda sterilize edilir. Nihai prob kalibrasyon ve çalışma ortamı için istikrar sonra, kültür kabına ilave edilir. Sistem daha sonra bir çalkalama şişesi yöntemi ile daha nicel ve hassas bir şekilde kültür karakterize etmek için kullanılabilir. Sıcaklık, pH, oksijen içeriği, yem tüketimi, sıvı buharlaştırma ve köpük seviyeleri arasında sıkı kontrol tüm çok daha yüksek bir biyokütle ve daha iyi bir protein verimi katkıda bulunur.

Protocol

  1. Damar kurulumu ile çalışmaya başlayın. Geleneksel fermantor (Şekil 1) yüklü olması gerekiyor aşağıdaki bileşenlere sahiptir:
    1. pH sondası - canlı kültürde pH ölçümü için. Kurulumdan önce probu kalibre ve gemi ile sterilize. Headplate içinde probu yükleyin.
    2. pO prob 2 - fermantasyon sırasında kap içindeki çözünmüş oksijen içeriğinin ölçülmesi için. Headplate kurun.
    3. Kültürünü örnekleme için hasat boru. Headplate bu ayarlanabilir yükseklik bileşeni yükleyin.
    4. Gaz serpme -, teknenin alt kısmında bulunur ve kültüre gaz infüzyon sağlar. Fermantörden üzerinde gaz kaynağına sparger kadar kanca ve headplate monte.
    5. Pervane ve pervane mili - pervane kültür karıştırır ve kap içinde kültür muntazamlık için çok önemlidir.
    6. Egzoz gazı kondansatör - egzoz gazı yolu soğutma ile kap içindeki buharlaştıncı kaybını engelleme için.
    7. PH kontrolü veya yem ilavesi için Reaktif pompa hatları.
  2. Gemiyi temizleyin ve su ve sabun ile headplate. Yumuşak bir fırça kap ve headplate fırçalama için tavsiye edilir. Klor ağartıcı veya temizleyiciler damar temizlemek için kullanılamaz.
  3. Ortam ısı kararsız değilse, temizleme kabına ekleyin. Maksimum çalışma hacmi ulaşana kadar sadece ekleyin. Bu durumda, yüksek bir çalışma hacmi, 5 L toplam hacim kabı için 3.3 L.
  4. O-ring conta düzgün oturmasını sağlayacak, damar headplate monte edin.
  5. Egzoz gazı Kondansörü takın.
  6. Onun 10 mm portuna köpük prob takın.
  7. Onun 10 mm portuna hasat borusunu takın. Bunun üstüne tüp bir parça koyun ve onu kelepçe.
  8. Serpme girişine tüp ve bir 0.20 mikron filtre takın ve daha sonra bu kapalı kelepçe.
  9. PH probu kalibre:
    1. 2 küçük bardak referans tamponlar, bir yıkama şişesi ve bir yedek wa toplayınsh beher.
    2. Fermentöre pH probu yukarı kanca ve fermentörünü açın.
    3. PH parametresine ilerleyin ve menü düğmesini kullanarak, 'Cal' seçeneğine gidin ve 'Enter tuşuna basın.
    4. 2 noktalı kalibrasyon için '2 'seçeneğini seçin.
    5. Prob ucunu yıkayın ve düşük referans tampon daldırın. Fermantörden üzerindeki değeri stabilize olacaktır. + Ve - tuşları, pH referans tampon değeri maç görüntülenen değeri ayarlayın. Yanıp durduğunda, 'Enter'a basın.
    6. Kapalı prob yıkayın ve ikinci referans tampon takın. Değer stabilize ve daha sonra görüntülenen değeri yüksek referans tampon değerini maç yapmak için tuş takımını kullanmak için izin verir. Onaylamak için 'Enter'.
    7. Kapalı prob ucunu yıkayın ve fermantörden ayırın. Bağlantıda koruyucu kap koymak ve headplate takın.
  10. PO2 prob ucu açın ve orada emin olmak için kontrol edinucunu karşılamak için yeterli bir elektrolittir. Değilse, rezervuar bazı eklemek ve o kadar geri kapatın.
  11. Headplate içinde pO2 sonda takın ve otoklav kapağı elektrik bağlantılarını korumak için üzerine koymak olduğundan emin olun. Bu sterilizasyon sonra kalibre edilecektir.
  12. , Bir daldırma tüpü ve bir hava filtresi ile reaktif madde besleme için bir şişe elde edilir. Daldırmalı boru bağlantı noktasına pompa hortumunu ekleyin ve fermantör üzerinde giriş portuna diğer ucunu ekleyin.
  13. Kullanılmayan tüm portları yer hortumu kapatıp tüp kelepçe.
  14. Egzoz gazı kondansatör üzerinde 0.45 mikron filtre takın. Bu filtre, damar otoklav içinde basınç etmez sağlar.
  15. Medyanın seviyesinin altında gitmek tüm tüpleri dışarı çıkmasını medya önlemek için kapalı kenetlenmiş olduğunu kontrol edin.
  16. 121 ° C'de, sıvı döngüsü 30 dakika - 25 için otoklav içinde kap yerleştirin. Dikkat: dışarı geldiğinde çok sıcak olacak.
  17. Fermentörü baz gemi yükleyin.
  18. PH Hook upkablo prob.
  19. PO2 prob kablosunu takın.
  20. Gaz ilave Rotametre için serpme kanca.
  21. Sterilely daldırma tüp ile şişesine 1 M NaOH reaktifmi ve taban pompa kafası mili üzerindeki pompa kafasını yükleyin.
  22. Headplate üzerinde termo sıcaklık sensörü koyun. Bu termovel altına tüm yol gider emin olun.
  23. Gemilerin pervane bağlantı üzerine ajitasyon kolu indirin.
  24. Fermantor üzerinde olduğundan emin olun.
  25. Su fermentöre mevcut olduğunu kontrol edin.
  26. Fermentöre hava beslemesi açın.
  27. Sıcaklık parametresi ilerleyin ve 37 ° C sıcaklığı ayarlamak Sıcaklık kontrolünü başlatmak için 'Enter' tuşuna basın. Gemi 15 dakika veya daha az ısınır.
  28. Dakika ya da daha az ortam 1 damar hacme kadar gaz akışını açın. Bu kurmak için, gaz akışı 3 L / dk. Bubbles altta görünmelidir.
  29. Ajitasyon p ilerleyinarameter ve 300 rpm'ye ayarlayın. Basın ajitasyon açmak için 'Enter'.
  30. Sıcaklığı 37 ° C ulaştığında, pH paremetresine ve 6.8 olarak ayarlayın. 'Enter' tuşuna basarak pH kontrolünü açın.
  31. Çalıştırmak için 1.000 rpm maksimum hıza ajitasyon ayarlayın.
  32. PO2 prob uygun değerleri görüntülemek için doğru polarize emin olun. 2 saat sonra, pO2 paremetresine ve 'Kalibre Function' seçin ve 1 nokta kalibrasyon seçmek için 'Menü' düğmesini kullanın.
  33. 15 dakika sonra, 100 ve basın değerini ayarlamak için imleçleri kullanın 'girin.' Bu po 2. kalibre edecektir.
  34. Ajitasyon ilerleyin ve 300 rpm ayarlanır.
  35. 'Menü' düğmesini kullanarak, içinde ajitasyon menüsünde 'açık' için 'Cascade' açın. Bu hava kabarcıkları kıymak ve büyüme talep arttıkça çözeltinin içine daha fazla oksijen zorlamak için bir çaba ajitasyon hızını artıracaktır. PO2 parametresine ilerleyin ve 30 değerini ayarlayın. PO2 başlatmak için 'Enter' tuşuna basın.
  36. PC'de kontrol yazılım paketi başlatın.
  37. Problar kalibre edildikten sonra, karıştırma 300 rpm, kararlıdır, sıcaklık 37 ° C'de ve pH 6.8 'e yakındır, bu inoküle etmek için zamanı. Alkol kullanarak, aşılama için kullanılacak olan port sterilize edin.
  38. Bir şırınga içine inokulum çizin ve sterilize liman içine ekleyin. Noktasını kapatın.
  39. Bir günlük kitapta aşılama zamanını işaretlemek.
  40. Bu sterilizasyon zaman örnek almak da önemlidir. Alkol ile hasat boru borunun ucunu sterilize edin.
  41. Hasat noktasını kaplayan kelepçesini açın ve bir örnek çizmek için bir şırınga kullanın. Bu boru oturan olmuştur, çünkü bu ilk örneği genellikle atılır.
  42. Başka bir örnek çekmek için başka bir şırınga kullanın.
  43. Üçüncü bir şırınga ile, kadar ölü hacim çıkarmak için borudan havayı geriye itinhattına gelen ve hattı kapalı kelepçe.
  44. Hücre yoğunluğu ve pH belirlemek ve değerleri kaydedin. Mikrobiyal kültürler ile, değerleri her saat oturum yararlıdır. Aralığı kültür bağlıdır.
  45. Büyüme tamamlandıktan sonra hasat yöntemi kültürü için niyet bağlıdır. Bu durumda, kültür hücre yoğunluğu ve ıslak hücre ağırlığının olası pH veya ölçüm için son nokta değerleri almak için son bir kez örnek. Çamaşır suyu veya diğer antimikrobiyal ajanlar ile belirlenen "öldürmek tank" in içeriğinin elden headplate açın.

Representative Results

Biyoreaktör IRIS yazılımı ile veya olmadan çalıştırılabilir. Ancak veri yakalamak için, bu yazılımı kullanmak en iyisidir. Bakteri ilave edilmeden önce pH ve oksijen sensörleri, pervane hızı değerine ve sıcaklık seti kalibre edilmelidir. Şekil 2'de, bir biyoreaktör çalıştırmak için veri çıkış sunulmuştur. Sıcaklık 30 ° C, 200 rpm'de çark hızına ayarlanmıştır. Bu parametreler her bir deney için farklı olabilir ama bakteri ilave edilmeden önce, sistem, kalıcı halde olmalıdır. Şekil 3'te, bakteriyel kültür eklenmesi ile oksijen konsantrasyonundaki değişim gösterilmiştir. Bu deney için set noktaları 37 ° C,% 70 200 rpm, O 2 de karıştırıcı vardır. Zamanda 19:20 olarak, besleme pompası bir derhal O 2 seviyesindeki damla neden olan 0.1 'lik bir OD bakteriyel tohum kültürünü sunar. Biyoreaktör hava akımı ve pervane hızı artarak değişen O 2 seviyesine yanıt verir. Tartar diye ayar noktaları kaskad (adım 35) ayarlanır. Reaktör pH pH zaman pH hattı dalgalanma (Şekil 4) ile gösterildiği gibi, daha sonra artan azalan, gerçek zamanlı olarak izlenmiştir. Tüm çalışma analiz edilebilir ve parametreler daha sonraki deneyler için ayarlandı.

Şekil 1
Şekil 1. Etiketlenmiş ve bağlı olan tüm parçaları ile Benchtop biyoreaktör. Bu şekil bir çalışma başlangıcında karıştırılan tank reaktörü göstermektedir. Reaktörün parçaları etiketli ve sensörler, çarkı, sıcaklık göstergesi, yem ve örnekleme şişeleri, egzoz portu, hava basıncı göstergesi, ısıtma ceketli, kondansatör kule ve kontrol paneli içerir.

Şekil 2,
Şekil 2. Biyoreaktör sof ekran görüntüsüçalışma başında tware. karıştırılan tank çalışma başlangıcında, sıcaklık 30 ° C (sarı hat) olarak kabul edildi, 200 rpm (kırmızı çizgi), 6.5 (yeşil hat) pH ve pO 2 de pervane hızı 57.2% (mavi çizgi). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Oksijen gibi çalışması sırasında biyoreaktör yazılım ekran görüntüsü kültür aktif büyüme aşamasında olduğunda, oksijen tüketir ve reaktör içindeki oksijen miktarı (mavi çizgi) azaltılır. Azalır. Pervane hızını artırarak, daha fazla oksijen kültürü (kırmızı çizgi) eklenebilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .


Şekil 4. Kültürünün zaman içinde pH değişikliği gösteren biyoreaktör yazılımı. PH ekran görüntüsü sürekli olarak izlenir ve zaman içinde bu laktik asit üretildiği azalır ve daha sonra baz biyoreaktör (mavi çizgi) eklenir artar. büyük rakam görüntülemek için .

Discussion

Karıştırılan tank reaktörler Biyoteknoloji sektöründe standart ve 40 yıldır 1 süredir kullanılmaktadır. Küçük karıştırılan tank ölçekli-up, küçültülmesi, gerginlik optimizasyonu, karakterizasyonu ve süreç geliştirme için önemli olmuştur. Ayrıca, bireyselleştirilmiş tıp 2 gelişiminde önemli bir role sahip olabilir. Bu, izlenmekte ve çalışma boyunca optimize edilebilir, çünkü küçük ölçekli biyo-reaktörü hücre büyümesi için in situ koşullarında en benzer. Çoğu zaman, ilk deneyler, çalkalama şişeleri içinde gerçekleştirilir, ancak küçük ölçekli biyoreaktörde koşullar sallama şişesi önemli ölçüde farklıdır. Bir deney içinde bulduğumuz E optimal büyüme koşulları coli ve sallama şişesi içinde yeşil floresan protein (GFP) üretimi karıştırma deposu (yayınlanmamış veriler) çevirmek değildi.

Büyük ölçekte gelişen hücrelerin diğer yöntemler silindir şişe, tek bir u içerirse Her yöntem 50 5.000 L. çalışma hacmi ile platformu Reaktörler 3 ve daha büyük tek kullanımlık Reaktörler sallanan ölçek kadar zorlukları sağlar, ancak üretimde bir yer bulmuştur. Platform biyoreaktör sallanan tek kullanım karıştırma deposu benzer ve düzenli bir ortam sağlar. Bu hücre çökmesini önlemek ve oksijen sağlamak için dalgaları üretmek nedeniyle sallanan bir hareket oluşur karıştırma karıştırma deposu farklıdır. Bu yöntem için hidrodinamik karıştırma deposu farklıdır ve en fazla hacim farklılıkları, hücre büyümesini ve ürün üretimini etkileyebilir 1000 L ile sınırlıdır bulunmaktadır. Diğer tek kullanımlık sistemleri, altyapı ve ilişkili yükü minimum bir platform sağlamak için tek reaktör ile karıştırılır tankı birleştirmek ve yüksek verimlilik için yeteneği 4 Biyoişleme.

Benchtop Biyoreaktörler Yeni kullanıcılar sorun pH, PO 2 ve tem ilk ayar noktalarını belirleyen olabilirken, ancak yayımlanan araştırma, bu bilgi 5, 6, 7, 8, 9 için başvurulabilir. Özellikle bakteri kültürleri ile, bir çalkalama şişesinde ve aynı set sıcaklık olarak aynı hızda çalkalama başlatmak için tavsiye edilir. Önceki shake flasks çalıştırmasının Kültür pH değeri, aynı zamanda bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. PO2 değeri ayarı daha zordur ve genellikle ampirik olarak belirlenir. Ancak,% 50 pO 2 ile başlayan tavsiye edilen başlangıç ​​noktasıdır.

Disclosures

Yazar A. Magno bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten ATR Biotech bir çalışanıdır.

Acknowledgments

Bu proje Johns Hopkins Üniversitesi, Ağ Geçidi Bilim Girişimi aracılığıyla Provost Ofisi tarafından kısmen destek oldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth Sigma L3022
ampicillin Sigma A1593-25G
LB broth Sigma L3022
antifoam 204 Sigma A8311
1 M Sodium Hydroxide Sigma 38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00 Sigma B5020
Reference Buffer, pH 7.00 Sigma B4770
pO2 probe electrolyte Broadley James AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter Cole Parmer EW-02915-22
0.22 micron filter Cole Parmer EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL Cole Parmer EW-07940-12
Minifors Bioreactor Infors HT B-Pack 5.0
Air Admiral air pump Cole Parmer EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator VWR 13721-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuler, M., Kargi, F. Bioprocess Engineering Basic Concepts. 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).
  2. Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10, (6), 22-33 (2012).
  3. Wave [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave (2012).
  4. Xcellerex [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm (2012).
  5. Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5, (01), S10-S17 (2007).
  6. Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7, (11), 46-52 (2009).
  7. Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
  8. Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).
  10. Bioreactors [Internet]. Applied Technical Resources. Available from: http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf (2012).
  11. Infors, H. T. Minifors operating Manual and user guide. Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. Excellent Video

    Reply
    Posted by: Paliz K.
    January 23, 2018 - 2:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics