Drift av en Benkeplate bioreaktor

Bioengineering
 

Summary

Fermentorer brukes for å øke kultur avkastning og produktivitet av bioengineered celler. Etter screening flere mikrobielle eller animalske cellekultur kandidater i ristekolber, er det neste logiske skrittet for å øke valgte kulturens biomasse med fermentoren. Denne videoen viser oppsett og drift av et typisk bord bioreaktor system.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a Benchtop Bioreactor. J. Vis. Exp. (79), e50582, doi:10.3791/50582 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fermentering systemer brukes til å tilveiebringe en optimal vekstmiljø for mange forskjellige typer av cellekulturer. Evnen som gis av fermentorer for å nøye kontrollere temperatur, pH og oppløst oksygenkonsentrasjon spesielt gjør dem avgjørende for effektiv storskala vekst og ekspresjon av fermenteringsprodukter. Denne videoen vil kort beskrive fordelene med fermentoren over riste kolben. Det vil også identifisere viktige komponenter i et typisk bord gjæring systemet og gi grunnleggende opplæring i oppsett av fartøyet og kalibrering av sine sonder. Den seer vil bli kjent med steriliseringsprosessen og vist hvordan å inokulere vekstmediet i beholderen med kulturen. Grunnleggende begreper i drift, sampling, og høsting vil også bli vist. Enkel dataanalyse og system opprydding vil også bli diskutert.

Introduction

Grunnleggende gjæring teknologi er en forlengelse av den enkle riste kolben teknikk for voksende kulturer. Det vokste ut av et ønske om å kontrollere vekstmiljøer for levende kulturer i en mer komplett og kvantitativ måte. Batch-kultur ryste-flasker er vanligvis begrenset ved upresis styring av temperaturen. Temperatur ensartethet i en ruges shaker eller varmt rom er svært variabel, noen ganger avvik 5 ° C eller mer fra den tiltenkte nominell verdi. Siden shake kolbe normalt omrøres ved en fast hastighet, er oksygenopptak og gassutveksling begrenset. Når tilgjengelig ambient oksygen er oppbrukt, de fleste kulturer ikke trives. Det er ingen pH-kontroll i rystekolber. I mange tilfeller, hvis kulturen er ikke begrenset av råstoff, blir det sure til det punktet av skade til kulturen og respirasjon avtar dramatisk. De fleste rystekolbekulturer også drives som en "batch", dvs. at de mates bare en gang ved eller nær begynnelsen av kulturene inoculation. Etter denne første karbonkilde er fortært, stopper kulturen vokser. I noen tilfeller metabolismen kan forskyve og begynner å forbruke andre metabolitter i kulturkraften, av og til å endre egenskapene av den resulterende biomasse eller protein. Rystekolber er også vanligvis gjenstand for media fordampningstap i varmere kulturmiljøer, typisk 10% av volum per 24 timer ved 37 ° C. Dette tapet forandrer tettheten i kulturen og hindrer sikt drift av systemet. Endelig kan brukeren støter skummingen fra mediet etter omrøring. Forekomsten av skum i det øvre område ovenfor kulturen vil begrense gassutvekslingen og videre vekst knær.

Den grunnleggende gjæring systemet er designet for å håndtere alle disse begrensningene. Nøye temperaturkontroll oppnås i gjærings fartøy ved bruk av skovlhjulet omrøring og en varmekappe. En føler innføres i beholderen og tilbakekoplingsstyring av oppvarming og kjøling av denne jakken vanligvisresultater i temperaturkontroll ± 0,1 ° C rundt settpunktet. Stasjonære fermentorer generelt gi kontroll av pH-verdien via flytende reagens tillegg gjennom en pumpe. PH-verdien overvåkes kontinuerlig i et forsøk på å holde miljøet for optimal cellevekst. Riktig lufting opprettholdes av den tidligere nevnte blanding løpehjulet, eller ved tilførsel av luft eller oksygen supplert gass direkte inn i kulturen. Med skjærsensitiv kulturer, er oksygen supplert gass den primære mekanisme for å opprettholde oksygennivået i kultur. Måling av oksygen i oppløsningen oppnås vanligvis ved en polarographic sonde som er normalt ikke tilgjengelig for bruk i rystekolber. Det er også mulig å fortløpende eller periodisk å legge innmating til fartøyet for å opprettholde veksten i en lineær eller eksponentiell måte. Utgangen gass kondensator gir en kald overflate for vanndamp i eksosstrømmen for å kondensere, og dermed bevare kulturvolum og tetthet. Periodisk tillegg av antifoam surfaktant er påvirkedeav en konduktivitetssensor i kulturen, noe som reduserer skum på overflaten og tillater gassutveksling.

Skipet, med alle sonder, fittings, impellere, høste rør og slanger, er samlet og steriliseres i en standard autoklav. Etter avsluttende probe kalibreringer og stabilisering til driftsmiljøet, blir kulturen tilsatt til karet. Systemet kan deretter brukes for å karakterisere kulturen på en måte som er mer kvantitativ og nøyaktig enn ved et rystekolbe metode. Tett kontroll av temperatur, pH, oksygeninnhold, næringsinntak, flytende fordampning, og skumnivået som alle bidrar til en mye høyere biomasse og bedre proteinutbytte.

Protocol

  1. Begynn drift med oppsett fartøy. En konvensjonell fermentor har følgende komponenter som må være installert (figur 1):
    1. pH-probe - for måling av pH i den levende kultur. Kalibrere proben før installasjon og sterilisere med fartøyet. Installer sonde i headplate.
    2. pO to probe - for måling av oppløst oksygeninnhold inne i beholderen i løpet av fermenteringen. Installer i headplate.
    3. Harvest-rør for prøvetaking kulturen. Ved å installere denne justerbar høyde komponent i headplate.
    4. Gass sparger - ligger på bunnen av karet og gir gass infusjon til kulturen. Krok sparger inntil gasskilden til fermentoren og montere i headplate.
    5. Impeller akselen og løpehjulet - skovlhjulet rører kulturen og er kritisk for å opprettholde kultur ensartethet i fartøyet.
    6. Eksosgass kondensator - for å dempe fordamping tap i fartøyet ved å kjøle eksosen banen.
    7. Reagens pumpelinjer for pH kontroll eller fôr tillegg.
  2. Rengjør fartøy og headplate med såpe og vann. En myk børste anbefales for skrubbing fartøyet og headplate. Blekemiddel-eller rengjøringsmidler med klor, kan ikke brukes til å rense karet.
  3. Hvis media ikke er varme labil, legge den til i rene kar. Bare legge til maksimalt arbeidsvolum er nådd. I dette tilfelle er maksimalt arbeidsvolum 3,3 l i en 5 l totalt volum fartøy.
  4. Monter fartøy headplate, slik at o-ringen sitter ordentlig.
  5. Sett på avgasskjøler.
  6. Installer antifoam sonde inn i sin 10 mm port.
  7. Installer innhøstingen røret inn sin 10 mm port. Legg et stykke rør på toppen av det og klemme den av.
  8. Installer slange og en 0,20 mikrometer filter på sparge innløp og deretter klemme dette av.
  9. Kalibrere pH-probe:
    1. Samle to referanse buffere i små begre, en vaskeflaske, og et reserve wash beger.
    2. Hekt pH probe opp til fermentoren og slå fermentoren på.
    3. Bla til pH parameter og bruk menyknappen, bla til "Cal"-alternativet, og trykk "Enter".
    4. Velg '2 'for 2-punkts kalibrering.
    5. Vask av sondespissen og senk i det lave referansebuffer. Verdien på fermentoren vil stabilisere seg. Med + og - tastene, justere den viste verdien til å matche verdien av pH referansen buffer. Når det slutter å blinke, trykk "Enter".
    6. Vask sonden ut og sett det inn i den andre referanse buffer. Tillat verdien å stabilisere og deretter bruke tastaturet for å gjøre den viste verdien matche den høye referansen bufferverdien. Trykk "Enter" for å bekrefte.
    7. Vask sonden spissen av og koble den fra gjærings. Sett beskyttelseshetten på tilkoblingen og installere den i headplate.
  10. Åpne pO 2 sonde tips og kontroller for å sikre at deter nok elektrolytt for å dekke dysen. Hvis ikke, legg til litt til reservoaret og lukke den opp igjen.
  11. Installer pO 2 sonde i headplate og sørg for at autoklaven hetten er satt på for å beskytte de elektriske koblingene. Det vil være kalibrert etter sterilisering.
  12. Skaff en flaske for reagens fôr med en dukkert rør og luftfilter. Legg pumpeslangen til dip tube port og feste den andre enden til inntaksporten på fermentoren.
  13. Plasser slangen på alle ubrukte porter deretter klemme slangen av.
  14. Installer en 0,45 mikrometer filter på eksosgass kondensator. Dette filteret sikrer at fartøyet ikke utsettes for trykk i autoklaven.
  15. Kontroller at alle rør som går under nivået for mediet er fastklemt av for å hindre mediet i å komme ut.
  16. Sett fartøyet i autoklav i 25 - 30 minutter ved 121 ° C, væsken sykle. Forsiktig: Når det kommer ut vil det være veldig varmt.
  17. Sett på fartøyet på fermentoren basen.
  18. Hook opp pHsondere kabel.
  19. Fest pO 2 probe kabel.
  20. Hekt sparger opp til gass tillegg rotameter.
  21. Sterilt tilsett 1 M NaOH reagens til flasken med dypprøret og montere pumpehodet i basepumpehuset spindel.
  22. Sett temperatursensoren i termolommen på headplate. Sørge for at det går hele veien ned til bunnen av termolommen.
  23. Senk agitasjon armen på fartøy impeller kopling.
  24. Kontroller at gjærings er på.
  25. Kontroller at vann er tilgjengelig til fermentoren.
  26. Slå på lufttilførselen til fermentoren.
  27. Bla til temperaturparameteren, og temperaturen til 37 ° C. Trykk på "Enter"-knappen for å starte temperaturkontroll. Fartøyet vil varme opp i 15 minutter eller mindre.
  28. Drei gasstrømmen til en beholdervolum av mediet pr minutt eller mindre. Av denne oppstilling, i gasstrømmen 3 L / min. Boblene skal vises nederst.
  29. Bla til agitasjon parameter og satt til 300 rpm. Trykk "Enter" for å slå på agitasjon.
  30. Når temperaturen har nådd 37 ° C, bla til pH parameter og sette den til 6,8. Snu pH kontroll på ved å trykke på "Enter"-knappen.
  31. Sett agitasjon til maksimal hastighet på 1000 rpm for kjøringen.
  32. Kontroller at pO 2 sonden er polarisert riktig å vise riktige verdier. Etter to timer, bla til pO 2 parameter og bruk menyknappen for å velge 'Kalibrer Function "og velg ett punkt kalibrering.
  33. Etter 15 min, bruker pekere for å sette verdien til 100 og trykk "Enter". Dette vil kalibrere pO 2.
  34. Bla til agitasjon og satt til 300 rpm.
  35. Ved hjelp av "Meny"-knappen, vri 'Cascade' til 'på' i agitasjon menyen. Dette vil øke hastigheten på agitasjon i et forsøk på å hogge opp luftbobler og tvinge mer oksygen inn i løsningen som vekst etterspørselen øker. Bla til pO 2 parameter og sette verdien til 30 år. Trykk på "Enter"-knappen for å starte pO 2.
  36. Start kontrollprogrampakke på PC.
  37. Når sondene er kalibrert, er stabil omrøring ved 300 rpm, er temperaturen ved 37 ° C og pH-verdien ligger i nærheten av 6,8, er det tid for å inokulere. Ved hjelp av alkohol, sterilisere porten som skal brukes for vaksinasjon.
  38. Tegn podestoff inn i en sprøyte og legge den inn i den steriliserte porten. Lukk porten.
  39. Markere tidspunktet for vaksinasjon i en loggbok.
  40. Det er også viktig å ta en prøve på sterilisering tid. Steril slutten av innhøstingen pipe tube med alkohol.
  41. Åpne klemmen dekker innhøstingen port og bruke en sprøyte for å trekke et utvalg. Denne første prøve blir vanligvis kassert fordi det har sittet på røret.
  42. Bruk en annen sprøyte for å trekke en ny prøve.
  43. Med en tredje sprøyte, presse luft tilbake gjennom røret for å fjerne så mye dødvolumfra linjen og klemme linjen av.
  44. Bestem celletetthet, og pH og registrere verdiene. Med mikrobielle kulturer, er det nyttig å loggverdier hver time. Intervall er kultur avhengig.
  45. Innhøstings metode avhenger av den hensikt for kulturen etter at veksten er avsluttet. I dette tilfellet prøve kulturen en endelig tid til å motta endepunkts-verdier for celletetthet og eventuelt pH-eller måling av våt cellevekt. Åpne headplate kastes av innholdet i en utpekt "kill tank" med blekemiddel eller andre antimikrobielle midler.

Representative Results

Den bioreaktor kan drives med eller uten IRIS programvare. Men å fange opp data, er det best å bruke programvaren. Før tilsetting av bakterier, må pH-og oksygensensorer kalibreres, impelleren hastigheten satt og innstilt temperatur. I figur 2, blir datautgangen for en bioreaktor kjøre frem. Temperaturen ble innstilt på 30 ° C, pumpehjulet hastighet på 200 rpm. Parametrene kan være forskjellig for hvert eksperiment, men før tilsetningen av bakterier, bør systemet være i stabil tilstand. I figur 3, er endringen i oksygenkonsentrasjonen ved tilsetning av bakteriekulturen vist. Set-poeng for dette eksperimentet er 37 ° C, røre på 200 rpm, O 2 på 70%. På tiden 19:20, leverer matepumpen bakteriell såkultur på en OD på 0,1 forårsaker en umiddelbart slippe i O 2-nivå. Den bioreaktor reagerer på skiftende O to-nivå med en økning i luftstrømmen og viftehjul hastighet. Than set-punkter for de regulering er satt i kaskade (trinn 35). Reaktoren pH-verdien ble overvåket i sann tid, med avtagende pH deretter øke som vist ved pH linje svingning over tid (fig. 4). Hele løp kan analyseres og parametere justert for senere eksperimenter.

Figur 1
Figur 1. Benkeplate bioreaktor med alle deler som er merket og koblet. Denne figuren viser rørt tank reaktoren ved begynnelsen av et løp. De delene av reaktoren er merket og omfatter sensorer, impeller, temperaturmåler, fôr og prøvetaking flasker, eksos port, trykkluftmåler, varmekappe, kondensator tårnet, og kontrollpanelet.

Fig. 2
Figur 2. Skjermbilde av bioreaktor SOFtware i begynnelsen av løp. Ved starten av en rørt tank løp, ble temperaturen satt til 30 ° C (gul linje), røreskovlehastigheten på 200 rpm (rød linje), pH på 6,5 (grønn linje), og pO 2 på 57,2% (blå linje). Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Skjerm bilde av bioreaktor programvare under kjøringen som oksygen reduseres. Når kulturen er i aktiv vekstfase, bruker den oksygen og mengden av oksygen i reaktoren er redusert (blå linje). Ved å øke røreskovlehastigheten, kan mer oksygen legges til kultur (rød linje). Klikk her for å se større figur .


Figur 4. Skjerm bilde av bioreaktor software som viser pH-endring over tid. PH-verdien av kulturen overvåkes kontinuerlig og over tid, men senker som melkesyre produseres og deretter øker når basen tilsettes til bioreaktoren (blå linje). for å vise større figur .

Discussion

Stirred tank bioreaktorer er standard i bioteknologisk industri, og har vært brukt i over 40 år en. Den lille rørt tanken har vært viktig for oppskalering, skala-ned, belastning optimalisering, karakterisering, og prosessutvikling. Det kan også ha en viktig rolle i utviklingen av individualisert medisin to. Den lille målestokk bioreaktor er mest lik den in situ-betingelser for cellevekst fordi det kan overvåkes og optimaliseres gjennom en sikt. Oftest er innledende forsøk utført ved hjelp ristekolber men forholdene i den lille skala bioreaktor avvike vesentlig fra shake kolbe. I ett eksperiment fant vi at vilkårene for optimal vekst av E. coli og produksjon av grønt fluorescerende protein (GFP) i shake kolbe ikke oversette til rørt tank (upubliserte data).

Andre metoder for voksende celler i stor skala omfatter rulleflasker, enkelt uSE rocking plattform bioreaktorer 3 og større engangs bioreaktorer med arbeids volumer fra 50 til 5000 L. Hver metode gir utfordringer for oppskalering, men har funnet et sted i produksjonen. Den engangsbruk vuggende plattform bioreaktor er lik den omrørte tanken, og gir et regulert miljø. Den skiller seg fra den omrørte tank ved at blandingen inntrer på grunn av en vippende bevegelse for å generere bølger for å forebygge celleling og gir oksygenering. De hydrodynamikk for denne fremgangsmåten er forskjellig fra den omrørte tank og maksimalt volum er begrenset til 1,000 L. Forskjellene kan påvirke cellevekst og produktproduksjon. Andre engangsbruk systemer kombinerer den omrørte tank med engangs reaktor for å, tilveiebringe en plattform med et minimum av infrastruktur og tilhørende overliggende, og mulighet for høy gjennomstrømning bioprocessing 4..

Nye brukere av stasjonære Bioreaktorer kan ha problemer med å bestemme innledende nominelle verdier for pH, pO 2 og temperaturen, men publiserte undersøkelser kan refereres til denne informasjonen 5, 6, 7, 8, 9. Med bakteriekulturer i særdeleshet, er det anbefalt å starte agitering i samme hastighet som den ristekolbe og temperaturen på samme skal-verdi. Kultur pH fra tidligere rystekolber løper kan også brukes som et utgangspunkt. Innstilling av pO 2 verdien er mer vanskelig og er vanligvis bestemmes empirisk. Men, som begynner med 50% pO 2 er et anbefalt utgangspunkt.

Disclosures

Forfatter A. Magno er ansatt i ATR Biotech som produserer reagenser og instrumenter som brukes i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette prosjektet var støtte i en del av Johns Hopkins University, kontor Provost gjennom Gateway Science Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth Sigma L3022
ampicillin Sigma A1593-25G
LB broth Sigma L3022
antifoam 204 Sigma A8311
1 M Sodium Hydroxide Sigma 38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00 Sigma B5020
Reference Buffer, pH 7.00 Sigma B4770
pO2 probe electrolyte Broadley James AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter Cole Parmer EW-02915-22
0.22 micron filter Cole Parmer EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL Cole Parmer EW-07940-12
Minifors Bioreactor Infors HT B-Pack 5.0
Air Admiral air pump Cole Parmer EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator VWR 13721-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuler, M., Kargi, F. Bioprocess Engineering Basic Concepts. 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).
  2. Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10, (6), 22-33 (2012).
  3. Wave [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave (2012).
  4. Xcellerex [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm (2012).
  5. Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5, (01), S10-S17 (2007).
  6. Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7, (11), 46-52 (2009).
  7. Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
  8. Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).
  10. Bioreactors [Internet]. Applied Technical Resources. Available from: http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf (2012).
  11. Infors, H. T. Minifors operating Manual and user guide. Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. Excellent Video

    Reply
    Posted by: Paliz K.
    January 23, 2018 - 2:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics