Exploitatie van een tafelmodel Bioreactor

Bioengineering
 

Summary

Fermentoren worden gebruikt voor cultuur opbrengst en productiviteit van bioengineered cellen te verhogen. Na het screenen van meerdere microbiële en dierlijke celkweek kandidaten in schudflessen, de volgende logische stap is om biomassa de geselecteerde cultuur met de vergister te verhogen. Deze video toont de installatie en bediening van een typisch benchtop bioreactor systeem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a Benchtop Bioreactor. J. Vis. Exp. (79), e50582, doi:10.3791/50582 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fermentatie systemen worden gebruikt om een ​​optimale groei omgeving voor vele verschillende soorten celculturen. De mogelijkheid geboden door fermentoren zorgvuldig controleren temperatuur, pH en zuurstofgehalte in het bijzonder zijn ze essentieel voor efficiënte groei en grootschalige expressie van fermentatieproducten. Deze video zal kort de voordelen van de fermentor via schudfles. Het zal ook de belangrijkste componenten van een typische benchtop fermentatie systeem te identificeren en geeft basis instructie over de installatie van het schip en de kalibratie van de sondes. De kijker maakt kennis met het sterilisatieproces en getoond hoe het groeimedium te enten in het vat met cultuur. Basisbegrippen van de operatie, de bemonstering, en de oogst zal ook worden gedemonstreerd. Eenvoudige gegevensanalyse en systeem opschonen worden besproken.

Introduction

Basic fermentatie technologie is een uitbreiding van de eenvoudige schudkolf techniek voor groeiende kweken. Het is ontstaan ​​uit de wens om de groei omgevingen voor levende culturen in een meer volledige en kwantitatieve manier te beheersen. Batch cultuur schudflessen zijn meestal beperkt door onnauwkeurige controle van de temperatuur. Temperatuur uniformiteit in een bebroede shaker of warme kamer is zeer variabel, soms afdwalen 5 ° C of meer van de beoogde setpoint. Sinds de schudfles normaal geroerd bij een vaste snelheid, zuurstofopname en gasuitwisseling is beperkt. Zodra het beschikbare omgevingslicht zuurstof is uitgeput, de meeste culturen niet gedijen. Er is geen pH-regeling in schudflessen. In veel gevallen, wanneer de kweek niet beperkt uitgangsmateriaal, het zuur wordt tot het punt van aantasting van de cultuur en de ademhaling vertraagt ​​dramatisch. Meest schudkolf culturen worden ook uitgevoerd als een "partij", hetgeen betekent dat zij slechts eenmaal op of nabij het begin van de kweken gevoed inoculation. Na deze koolstofbron wordt verbruikt, de cultuur stopt met groeien. In sommige gevallen kan het metabolisme veranderen en beginnen andere metabolieten consumeren in de kweekbouillon, soms die de kenmerken van de resulterende biomassa of eiwit. Schudkolven ook meestal media verdampingsverlies in warmere omgevingen cultuur, typisch 10% van het volume per 24 uur bij 37 ° C onderworpen Dit verlies verandert de dichtheid van de cultuur en verbiedt langere termijn werking van het systeem. Tenslotte kan de gebruiker geconfronteerd schuimende van de media na roeren. Het optreden van schuim in de bovenruimte boven de cultuur zal de gasuitwisseling en de verdere groei knie te beperken.

De basis fermentatiesysteem is ontworpen om al deze beperkingen te pakken. Zorgvuldige temperatuurregeling in fermentatievaten bereikt door het gebruik van drijvende agitatie en verwarmingsmantel. Een sensor geplaatst in het vat en feedback regeling van verwarming en koeling van deze jas meestalResultaten temperatuurregeling ± 0,1 ° C om de streefwaarde. Tafelmodel fermentors algemeen bieden controle van de pH via vloeibare reagens door een pomp. De pH-waarde wordt continu gecontroleerd in een poging om de optimale omgeving voor celgroei houden. Een goede beluchting wordt gehandhaafd door de bovengenoemde mengen waaier of de infusie van lucht of zuurstof aangevuld gas direct in de cultuur. Met afschuifgevoelige culturen, zuurstof aangevuld gas is het belangrijkste mechanisme voor het onderhoud van zuurstofgehalte in de cultuur. Meting van zuurstof in oplossing wordt gewoonlijk bereikt door een polarografische probe die niet normaal beschikbaar voor gebruik in schudkolven. Het is ook mogelijk om voer continu of periodiek toevoegen vaartuig groei in een lineaire of exponentiële wijze te handhaven. Het uitlaatgas condensor zorgt voor een koud oppervlak voor damp in de uitlaatgasstroom te condenseren, waardoor cultuur volume en dichtheid behoud. Periodieke toevoeging van antischuim oppervlakteactieve bediendeen geleidbaarheidssonde in de cultuur, waardoor schuim op het oppervlak en waardoor gasuitwisseling.

Het schip, met alle sondes, fittingen, waaiers, oogst pijpen en buizen, is gemonteerd en gesteriliseerd in een standaard autoclaaf. Na de laatste sonde kalibraties en stabilisatie werkomgeving, wordt de cultuur toegevoegd aan het vat. Het systeem kan dan worden gebruikt om de kweek te karakteriseren op een manier die meer kwantitatief en nauwkeuriger dan met schudflesmethode. Strakke controle van de temperatuur, pH, zuurstofgehalte, voeropname, vloeistof verdampen en schuim niveaus dragen een veel hogere biomassa en betere eiwitopbrengst.

Protocol

  1. Begin samenwerking met setup schip. Een conventionele fermentor de volgende componenten die moeten worden geïnstalleerd (Figuur 1):
    1. pH probe - voor het meten van pH in de levende cultuur. Kalibreer sonde voor de installatie en steriliseren met het schip. Installeer sonde in de gitaarkop plaat.
    2. pO 2 probe - voor het meten van opgeloste zuurstof in het vat tijdens de gisting. Installeer in de gitaarkop plaat.
    3. Oogst pijp voor de bemonstering van de cultuur. Installeer deze in hoogte verstelbaar component in de gitaarkop plaat.
    4. Gas verdeelinrichting - bevindt op de bodem van het vat en levert gas infusie aan de cultuur. Haak borrelaar tot de bron van gas op de fermentatie-en monteren in de gitaarkop plaat.
    5. Waaieras en waaier - de waaier roert de cultuur en is van cruciaal belang voor het behoud van cultuur uniformiteit in het vat.
    6. Uitlaatgassen condensor - voor het terugdringen van verlies door verdamping in het vat door het koelen van de uitlaatgassen weg.
    7. Reagens pomp lijnen voor pH-regeling of diervoeders toevoeging.
  2. Reinig het vat en gitaarkop plaat met water en zeep. Een zachte borstel wordt aanbevolen voor het schrobben van het schip en gitaarkop plaat. Bleach of reinigingsmiddelen met chloor kunnen niet worden gebruikt om het vat te reinigen.
  3. Als de media niet wordt hitte labiel, toe te voegen aan het schoon schip. Alleen toe te voegen totdat de maximale arbeidstijd volume is bereikt. In dit geval, de maximale werkvolume is 3.3 L voor een 5 liter totaal volume vat.
  4. Monteer het vat kopplaat, ervoor te zorgen dat de o-ring correct aanligt.
  5. Installeer de uitlaatgassen condensor.
  6. Installeer de antischuim sonde in haar 10 mm poort.
  7. Installeer de oogst pijp in zijn 10 mm poort. Leg een stuk slang op de top van het en klem het af.
  8. Installeer slangen en een 0,20 pm filter op de sparge inlaat en vervolgens klem dit af.
  9. Kalibreer de pH-sonde:
    1. Verzamel 2 verwijzing buffers in kleine bekers, een spuitfles, en een reserve wash beker.
    2. Haak de pH-sonde tot aan de vergister en zet de fermentatie op.
    3. Blader naar de parameter pH en het gebruik van de menu-knop, gaat u naar de optie 'Cal', en druk op 'Enter'.
    4. Selecteer '2 'voor 2 punts kalibratie.
    5. Afwassen de sonde en onder te dompelen in de lage referentie buffer. De waarde van de fermentatie zal stabiliseren. Met behulp van de toetsen + en -, de weergegeven waarde om de waarde van de pH referentie buffer passen. Zodra het stopt met knipperen, druk op 'Enter'.
    6. Was de sonde uit en steek deze in de tweede referentie buffer. Laat de waarde te stabiliseren en gebruik vervolgens de cijfertoetsen om de weergegeven waarde overeenkomt met de hoge referentiewaarde buffer waarde. Druk op 'Enter' om te bevestigen.
    7. Was de sonde uit en koppel het los van de vergister. Plaats de beschermkap op de verbinding en moet hij in de gitaarkop plaat.
  10. Open de pO 2 sonde en controleren om ervoor te zorgen dat ervoldoende elektrolyt de punt dekken. Zo niet, doe er wat aan het reservoir en sluit het terug.
  11. Installeer de pO 2 sonde in de kopplaat en zorg ervoor dat de autoclaaf dop wordt gelegd op haar elektrische aansluitingen te beschermen. Het zal worden gekalibreerd na sterilisatie.
  12. Verkrijgen van een fles voor reagens feed met een inwendige pijp en luchtfilter. Voeg pomp slang aan op de dompelbuis poort en sluit het andere uiteinde aan de inlaat poort van de vergister.
  13. Plaats slangen op alle ongebruikte poorten klem vervolgens tubing af.
  14. Installeer een 0,45 pm filter op de uitlaatgassen condensor. Dit filter zorgt ervoor dat het schip niet onder druk in de autoclaaf.
  15. Controleer of alle buizen die verder gaan onder het niveau van de media worden afgeklemd om media te voorkomen coming out.
  16. Plaats het vat in de autoclaaf gedurende 25 - 30 minuten bij 121 ° C, vloeibaar cyclus. Let op: Als het gaat uit het erg heet worden.
  17. Installeer het schip op de fermentatie-basis.
  18. Aansluiten van de pHsonde kabel.
  19. Bevestig de pO 2 sondekabel.
  20. Haak de borrelaar tot het gas toevoeging rotameter.
  21. Steriel voeg 1 M NaOH reagens om de fles met de dompelbuis en installeer de pomp op de basis pompkop spindel.
  22. Plaats de temperatuursensor in de beschermbuis op de kopplaat. Zorg ervoor dat het gaat allemaal van de weg naar de bodem van de beschermbuis.
  23. Laat de agitatie arm op de schepen waaier koppeling.
  24. Zorg ervoor dat de fermentatie is ingeschakeld.
  25. Controleer dat water beschikbaar om de fermentor.
  26. Schakel de luchttoevoer naar de vergister.
  27. Ga naar de maateenheid temperatuur en de temperatuur tot 37 ° C. Druk op de knop 'Enter' om de temperatuurregeling starten. Het schip zal opwarmen in 15 minuten of minder.
  28. Draai de gastoevoer naar 1 vaartuig volume van media per minuut of minder. Voor dit opgezet, gasstroom is 3 L / min. Bubbles moet verschijnen aan de onderkant.
  29. Blader naar de agitatie parameter en ingesteld op 300 opm. Druk op 'Enter' in te schakelen op de agitatie.
  30. Zodra de temperatuur 37 ° C heeft bereikt, gaat u naar de parameter pH en stel deze in op 6.8. Draai de pH-regeling aan door op de knop "Enter".
  31. Stel agitatie om de maximale snelheid van 1000 rpm voor de run.
  32. Zorg ervoor dat de pO 2 sonde goed is gepolariseerd om de juiste waarden weer te geven. Na 2 uur, gaat u naar de parameter pO 2 en gebruik de knop 'Menu' om de 'Calibrate Function' te selecteren en selecteer de 1 punt kalibratie.
  33. Na 15 min, gebruik de cursors om de waarde op 100 en druk op 'Enter'. Dit wordt gekalibreerd pO 2.
  34. Scroll naar agitatie en ingesteld op 300 tpm.
  35. Met behulp van de knop 'Menu', zet de 'Cascade' op 'aan' in de agitatie menu. Dit zal de snelheid van de agitatie in een poging om hakken luchtbellen en dwingen meer zuurstof in oplossing als de vraag de groei toeneemt verhogen. Ga naar de maateenheid pO 2 en zet de waarde op 30. Druk op de knop 'Enter' om pO 2 te starten.
  36. Start de control software pakket op de PC.
  37. Wanneer de probes zijn gekalibreerd, agitatie stabiel is bij 300 rpm, de temperatuur is 37 ° C en pH dicht bij 6,8, is het tijd om inoculeren. Met alcohol, steriliseren de poort die wordt gebruikt voor inoculatie.
  38. Teken de entstof in een injectiespuit en voeg het in de gesteriliseerde poort. Sluit de poort.
  39. Geven de tijd van inenting in een logboek.
  40. Het is ook belangrijk om een ​​monster te nemen op sterilisatietijd. Steriliseer het einde van de oogst pijp buis met alcohol.
  41. Open de klem voor de oogst-poort en gebruik een injectiespuit om een ​​steekproef te trekken. Deze eerste monster wordt meestal weggegooid omdat het is zitten in de pijp.
  42. Gebruik een andere spuit om een ​​ander monster te trekken.
  43. Met een derde spuit, duw lucht terug door de buis om zo veel dode volume verwijderenuit de lijn en klem de lijn af.
  44. Bepaal de celdichtheid en pH en noteer de waarden. Met microbiële culturen, is het nuttig waarden log per uur. Interval is cultuur afhankelijk.
  45. Harvest methodologie hangt af van de intentie voor de cultuur na groei is voltooid. In dit geval genieten de cultuur een laatste tijd eindpunt waarden ontvangen voor celdichtheid mogelijke pH of meting van natte celgewicht. Open de kopplaat verwijderd van de inhoud in een aangewezen "kill tank" met bleekwater of andere antimicrobiële middelen.

Representative Results

De bioreactor kan worden uitgevoerd met of zonder IRIS. Maar om gegevens vast te leggen, is het het beste om de software te gebruiken. Vóór de toevoeging van bacteriën, moet de pH en zuurstof sensoren worden gekalibreerd, de waaier snelheid ingestelde en de ingestelde temperatuur. In figuur 2 wordt de data-uitgang van een bioreactor run gepresenteerd. De temperatuur werd ingesteld op 30 ° C, de rotorsnelheid van 200 tpm. De parameters kunnen verschillend zijn voor elk experiment maar vóór toevoeging van bacteriën, moet het systeem bij steady state. In figuur 3 is de verandering in zuurstofconcentratie van de toevoeging van de bacteriecultuur weergegeven. De instelpunten voor dit experiment zijn 37 ° C, roerder bij 200 rpm, O 2 70%. Op tijdstip 19:20, de voedingspomp levert de bacteriële zaaikweek bij een OD van 0,1 veroorzaakt een onmiddellijk laten vallen in het O 2-gehalte. De bioreactor aan de veranderende O 2 niveau een verhoging van de luchtstroom en rotorsnelheid. Thij set-punten voor de verhogingen in de cascade (stap 35). De reactor pH werd gecontroleerd in real time, waarbij de pH daalt vervolgens oplopend zoals blijkt uit de pH regel fluctuatie in de tijd (figuur 4). De hele oplage kan worden geanalyseerd en parameters gecorrigeerd voor latere experimenten.

Figuur 1
Figuur 1. Tafelmodel bioreactor met alle delen gelabeld en aangesloten. Deze figuur toont de geroerde tank reactor aan het begin van een run. De onderdelen van de reactor zijn gelabeld en zijn de sensoren, impeller, temperatuurmeter, diervoeders en bemonstering flessen, uitlaatpoort, luchtdrukmeter, verwarmingsmantel, condensor toren, en het bedieningspaneel.

Figuur 2
Figuur 2. Screen beeld van bioreactor software aan het begin van de run. Aan het begin van een geroerde tank run, is de temperatuur ingesteld op 30 ° C (gele lijn), rotor snelheid 200 rpm (rode lijn), pH 6,5 (groene lijn), en pO 2 bij 57,2% (blauwe lijn). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Screen beeld van bioreactor software tijdens de run als zuurstof afneemt. Wanneer de cultuur is in actieve groeifase, verbruikt zuurstof en de hoeveelheid zuurstof in de reactor wordt afgenomen (blauwe lijn). Door het verhogen van de waaier snelheid, meer zuurstof kan worden toegevoegd aan de cultuur (rode lijn). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .


Figuur 4. Screen beeld van bioreactor software toont pH-verandering in de tijd. De pH van de cultuur wordt voortdurend bewaakt en na verloop van tijd afneemt als melkzuur wordt geproduceerd en vervolgens verhoogt als base wordt toegevoegd aan de bioreactor (blauwe lijn). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Geroerde tank bioreactoren zijn de standaard in de biotechnologie-industrie en zijn gebruikt voor meer dan 40 jaar 1. De kleine geroerde tank is belangrijk geweest voor scale-up, schaal-down, stam optimalisatie, karakterisering en procesontwikkeling. Zij kunnen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van geïndividualiseerde geneeskunde 2. De kleinschaligheid bioreactor is het meest vergelijkbaar met in situ-omstandigheden voor celgroei, omdat het kan worden gecontroleerd en geoptimaliseerd gedurende een run. Meestal worden initiële experimenten uitgevoerd met schudkolven maar de omstandigheden in de bioreactor kleinschalige aanzienlijk van de schudfles. In een experiment bleek dat de voorwaarden voor een optimale groei van E. coli en productie van Green Fluorescent Protein (GFP) in de schudkolf niet vertalen naar de geroerde tank (ongepubliceerde gegevens).

Andere methoden van groeiende cellen in grote schaal met roller flessen, een Use schudplatform bioreactoren 3 en grotere single use bioreactoren met het werken volumes van 50 tot 5000 L. Elke methode biedt uitdagingen voor scale-up, maar heeft een plaats in de productie gevonden. Het eenmalig gebruik schudapparaat bioreactor is vergelijkbaar met de geroerde tank en geeft een gereguleerde omgeving. Het verschilt van de geroerde tank die menging optreedt als gevolg van een schommelende beweging golven naar cel bezinking te voorkomen en oxygenatie genereren. De hydrodynamica van deze werkwijze verschillen van de geroerde tank en het maximale beperkt tot 1000 L. De verschillen kunnen celgroei en productie van het product beïnvloeden. Andere eenmalig gebruik systemen combineren de geroerde tank met de beschikbare reactor, een platform met een minimum aan infrastructuur en bijbehorende overhead, en het vermogen voor hoge-doorvoer bioprocessing 4.

Nieuwe gebruikers van stationaire Bioreactoren kunnen moeite bepalen eerste setpoints voor pH, pO 2 en TEM hebbentemperatuur, maar gepubliceerd onderzoek kan worden verwezen naar deze informatie 5, 6, 7, 8, 9. Met bacteriële culturen name wordt aanbevolen roeren beginnen met dezelfde snelheid als de schudkolf en de temperatuur op dezelfde gewenste. Cultuur pH van afgelopen schudflessen runs kan ook gebruikt worden als uitgangspunt. Instelling van de pO 2 waarde moeilijker en wordt meestal empirisch bepaald. Echter, te beginnen met 50% pO 2 is een aanbevolen uitgangspunt.

Disclosures

Auteur A. Magno is een medewerker van ATR Biotech dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Acknowledgments

Dit project was steun voor een deel door de Johns Hopkins University, Bureau van de Provost via de Gateway Science Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth Sigma L3022
ampicillin Sigma A1593-25G
LB broth Sigma L3022
antifoam 204 Sigma A8311
1 M Sodium Hydroxide Sigma 38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00 Sigma B5020
Reference Buffer, pH 7.00 Sigma B4770
pO2 probe electrolyte Broadley James AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter Cole Parmer EW-02915-22
0.22 micron filter Cole Parmer EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL Cole Parmer EW-07940-12
Minifors Bioreactor Infors HT B-Pack 5.0
Air Admiral air pump Cole Parmer EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator VWR 13721-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuler, M., Kargi, F. Bioprocess Engineering Basic Concepts. 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).
  2. Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10, (6), 22-33 (2012).
  3. Wave [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave (2012).
  4. Xcellerex [Internet]. GE Life Sciences. Available from: http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm (2012).
  5. Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5, (01), S10-S17 (2007).
  6. Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7, (11), 46-52 (2009).
  7. Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
  8. Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).
  10. Bioreactors [Internet]. Applied Technical Resources. Available from: http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf (2012).
  11. Infors, H. T. Minifors operating Manual and user guide. Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. Excellent Video

    Reply
    Posted by: Paliz K.
    January 23, 2018 - 2:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics