급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

수용체 티로신 키나아제는 백혈병과 고형 종양을 모두 포함하여 많은 암의 발전과 진행에 연루되어 있고, 매력적인 druggable 치료 표적입니다. 여기에 우리가 급성 백혈병의 치료에 티로신 키나제 억제제 (TKIs)의 전 임상 평가를위한 효율적인 네 단계의 전략을 설명합니다. 처음에, 웨스턴 블롯 분석은 배양 된 백혈병 세포의 대상 억제를 확인하는 데 사용됩니다. 기능적인 활동은 다음 메틸 또는 부드러운 한천 문화 클론 원성 분석을 사용하여 평가됩니다. 세포 배양 분석 활동을 보여 실험 화합물은 인간의 백혈병 세포 라인 orthotopically 이식 NOD-SCID-감마 (NSG) 마우스를 사용하여 생체 내에서 평가됩니다. 초기의 생체 내 약력 학적 연구는 골수에서 분리 백혈병 폭발에 표적 억제를 평가한다. 이 방법은 효과적인 표적 억제에 필요한 투여 량 및 스케줄을 결정하는 데 사용이온. 후속 연구함으로써 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 백혈병 부담과 치료 반응의 평가의 비 침습적 모니터링 생물 발광을 허용 루시퍼 백혈병 발현 세포를 사용하여 생체 내에서 TKIs의 효능을 평가한다. 이 전략은 시험 관내 및 생체 내에서 TKIs의 평가에 효과가있다 및 치료 가능성을 가진 분자 타겟 에이전트의 식별을 위해 또는 여러 화합물의 직접적인 비교 및 우선 순위에 적용 할 수 있습니다.

Introduction

급성 림프 구성 백혈병 (ALL)은 아이들 1,2에서 가장 흔한 악성 종양이다. 소아 B-계보 ALL (B-ALL)의 생존율은 약 85 %이지만, T-혈통 ALL (T-ALL) 등의 특정 생물 학적 아형, 심지어 현재의 치료 프로토콜을 여전히 가난한 예후가. 재발 ALL의 추가 처리는 도전 3 남아있다. 급성 백혈병 성인 환자의 대부분은 선행 화학 요법과 죄 사함을 얻을 수 있지만, 많은 환자는 여전히 재발 사를 겪고 있습니다. 급성 백혈병의 치료에 현재 항암 요법은 관련 독성 장단기 부작용을 일으키는 것으로 알려져있다. 그러므로, 구체적으로 정상 조직에 최소한의 효과 암세포를 표적으로 덜 독성 요법이 크게 요구된다. 최근 강조 신규 암세포에 대한 특이성 분자 타겟 에이전트 종종 반복적 인 화학을 이용하여 개발에 배치되었습니다다음에 비해 5 우선 순위를해야합니다 여러 활성 화합물을 생성 할 수 있습니다. 이 원고는 약물 개발을 용이하게하기 위해 하나의 화합물의 평가를 위해 또는 다중 화합물의 직접 비교에 사용될 수있는 급성 백혈병의 치료를위한 TKIs의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

여기에 제시된 방법은 네 단계로 구성되어 있습니다. 순 생화학 (1) 및 항 백혈병 (2) 화합물 (들)의 활동이 세포 배양에서 평가되고, 그 다음 대상의 억제는 동물 모델 (3)에서 확인하고, TKI 해제 최종적 치료 효능된다 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다 (4). 이들 연구의 경우, 가장 일반적인 생물학적 아형의 대표이다 중요한 세포주를 선택하는 것이 중요하다. 셀 라인은 생물학적 효과 의대 여부를 조사하기 위해, 모두가 관심의 대상을 표현하고 관심의 대상이 결여 된, 선택해야대상의 억제에 의해 iated. 이것은 항 종양 활성을 위해 중요 할 수있다 표적 이탈 효과가 소분자 저해제의 개발에 특히 적합하다. 그런 증식 또는 생존 등의 기능 효과의 대상에 의존하는 세포 라인을 선택하는 것이 필요하다. 타겟을 억제하는 RNA 간섭 또는 다른 특정 수단을 사용하여 (이 문서의 범위 밖) 예비 타겟 검증 연구는 타겟 종속 세포주를 식별하기 위해 사용될 수있다. 그것은 세포 배양 결과는 더 직접적 생체 내 실험으로 변환 될 수 있도록 뮤린 이종 이식편을 형성 할 수있는 세포주를 선택하는 것이 바람직하다.

백혈병 세포에 의해 매개 TKIs 생화학 적 활성의 평가를 위해, 수용체 인산화의 감소는 표적 억제의 지표로서 사용될 수있다. 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA 분석법 항체의 가용성 및 특이성에 따라 채용 될 수있다.대상에 대한 충분한 특이 항체를 사용할 수있는 경우가 더 많은 양적 효율적으로, ELISA 분석 실험이 바람직하다. ELISA에 충분 특이 항체를 사용할 수없는 경우, 웨스턴 블롯 분석이 필요할 수 있습니다. 이 경우, 해물 많은 양의 면역 낮은 풍부에있는 표적의 탐지에 유용 할 수 있습니다. 이 방법은 환경 자극에 대한 응답으로 신호의 급격한 변화를 허용하는 짧은 반감기를 가질 수있다 인산화 단백질의 측정에 특히 적합합니다. 일부 인산화 단백질은 매우 불안정한 포스파타제와 함께 복합체 형성의 결과로 가장 가능성이 높다. 이러한 인산화 된 단백질의 강력하고 일관된 검출을 위해, 또한 종래 전체 세포 용 해물의 제조에 인산화 단백질을 안정화시키기 위해, pervanadate, 비가역 단백질 티로신 포스파타제 억제제 (6)로 세포를 처리하는 것이 가능할 수있다.

에생화학 적 활성은 항 종양 효과가 발생하는지 여부를 결정, 대상에 의존하는 생물 학적 과정은 세포 기반 실험에서 모니터링 할 수 있습니다. 백혈병 세포주, TKIs 의해 매개 항 - 백혈병 활성은 메틸 또는 소프트 한천 7에서 수행 콜로니 형성 어 세이를 사용하여 평가 될 수있다. 이 TKI 반복 치료가 필요한 경우 조작에 더 많은 의무가 고체 배지처럼 부드러운 한천이 바람직 할 수있다. 많은 급성 myloid 백혈병 (AML) 세포 라인은 소프트 아가에서 콜로니를 형성하는 동안, 대부분의 ALL 세포주는 반고체 배지 인, 메틸 셀룰로오스에서 콜로니를 형성 할 것이다. 이 메틸 셀룰로오스 배양 매체 및 / 또는 TKIs를 새로 고침 할 수 있지만, 단지 작은 볼륨은 사용 제한 주파수를 할 수 있습니다. 마찬가지로, 메틸 셀룰로오스에서 그들을 방해하지 않고 식민지를 염색하는 것이 더 어렵다. 예비 연구는 메틸 및 / 또는 소프트 한천 및 t에서 콜로니를 형성하기위한 적절한 세포주의 능력을 정의한다그는 문화에 세포의 최적의 밀도 식민지가 겹치지하고 충분한 수의 (35 mm 플레이트 당 보통 50 ~ 200 식민지) 통계적으로 관련 데이터를 얻을 수 있도록.

체외 분석 강력하고 비용 효율적인, 그리고 가지고 있지만 모든 동물 실험, 치료 화합물의 발전보다 적은 수의 윤리적 의미는 동물 모델에서 효능과 안전성의 증거가 필요합니다. 생체 내 연구의 경우, 인간의 급성 백혈병 세포주 orthotopically 내가 tm1Wjl / SZJ (NSG) 마우스 및 TKIs 쉽게 주입 또는 경구 위관 영양법으로 투여 할 수있다 l2rg NOD.Cg-Prkdc의 SCID에 이식 할 수 있습니다. 일부 세포주 이종 이식 수립하기 위해서는 방사선의 낮은 세포주에 의존 선량 NSG 마우스의 노출을 필요로 할 수 있으며,이 경우에는 마우스는 5 ~ 10 일 회복 기간 후 조사하지 않고 경구 위관을 허용하지 않을 수 있습니다. 이 원고는 사용 B-ALL과 T-ALL 이종 이식의 생성을 설명합니다예이지만 이종 이식편과 같은 특정 세포주 (697 및 된 Jurkat)은 세포주의 다양한 사용 NSG 쥐에서 설립 될 수있다. 다른 세포주가 더 적용되면 일 경우에는, 조사에 대한 요구 사항은, 이식 및 질환 발병과 진행의 타이밍 세포의 최적의 수는 실험적으로 결정되어야한다. 이상적으로,이 모델은 (인해 질병에 이상적 20-30일 연구에서 치료 및 제거의 시작 사이의) 완전한 penetrance (이식 모든 동물은 백혈병을 개발), 일관된 반응 속도 (백혈병은 모든 동물에서 유사하게 진행), 그리고 적절한 치료 창을해야합니다 . 이식 된 세포의 수는 penetrance 및 운동 일관성을 개선하기 위해 증가되거나 필요한 경우, 처리 윈도우를 개선하기 위해 감소 될 수있다.

TKIs는 생체 내에서 대상 억제를 중재 여부를 확인하려면 샘플 TKI 또는 전용 차량과 치료 후 백혈병 이종 이식 생쥐에서 수집됩니다. 이상적으로, 선량이 실험에 대한 정부의 개발 일정은 일반 상업 실험실에서 수행하고이 문서의 범위를 벗어난다 할 수 약동학 연구에 의해 인도된다. 약물 동력 학적 데이터를 사용할 경우에, TKI의 단일 용량 다음 세포 배양에 효과적인 표적 억제 및 최대 혈청 농도에 필요한 화합물의 농도는 동물 연구에 대한 초기 투여 량을 정의하기 위해 사용될 수있다. 약동학 연구는 또한 약물 역학 연구 및 투여 경로에 대한 시료 채취 후 처리의 타이밍을 알릴 수 있습니다. 표적의 억제는 영향을받는 기관에서 평가 될 수 있지만, 대부분 쉽게 수집 및 처리되는 조직이 바람직하다. 특정 장기에 영향 비록 대부분 급성 백혈병 세포주, 간, 골수, 비장, 말초 혈액 및 중추 신경계에 확립하고 이러한 장기에 생착의 정도는 모델에 따라 변화한다. 여기에 제시된 프로토콜은 phosph을 평가O-단백질의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 골수 억제, 그러나 고체 장기 지속적으로 수확하는 것이 더 쉬울 수 및 샘플 수집 및 처리하는 동안 인산화 단백질의 분해를위한 더 적은 기회를 허용하기 전에 동결에없이 또는 최소한의 처리를 필요로 할 수있다. 면역 조직 화학은 또한 고형 종양 또는 백혈병의 영향 장기를 평가할 수있다.

마지막으로, TKI (들)의 치료 효능은 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다. 이들 연구의 경우, 처리 개시 타이밍은 질병이 다소간 확립 될 수 있도록, 변경 될 수있다. 치료는 초기 연구를 위해 이식 후 바로 시작할 수 있습니다 다음 중요한 질병 부담이 더 밀접하게 진단 치료 모델을 대략적으로 감지 될 때까지 후속 연구에서 지연. 이상적으로,이 동물 모델은 질병 부담의 비 침습 측정에 대한 능력이있다. 우리는 반딧불이 루시퍼의 도입을위한 방법을 최적화 한질병의 발병 및 골수와 고체 장기 질병 부담의 진행과 평가의 비 침습, 종 방향 분석을 허용 바이러스 입자를 사용하여 백혈병 세포주에 ASE 유전자. 이 방법은 긴급 클론 세포주의 사용과 관련된 루시 페라 제 발현 백혈병의 개발에 변동을 방지하기 위해 모노클로 루시페라아제 - 태그 된 세포주의 사용이며 TKI 8 치료 무관하다.

이와 함께,이 단계는 하나의 TKI의 평가를 위해 또는 여러 TKIs의 직접 비교하고 순위를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜 TKIs의 개발에 초점을하지만,이 방법은 다른 대상에 적용 할 수 있으며, 분석 개발을위한 고려 사항이 설명되어 있습니다. 따라서,이 전략은 급성 백혈병의 치료에보다 광범위하게 적용 할 수있는 분자 타겟 에이전트의 전 임상 평가를 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

동물을 포함한 모든 실험은 콜로라도 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 규제 기준을 따랐다. 입증 된 프로토콜은 콜로라도 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

1. 인산화 단백질 서쪽 오점

  1. 해물의 준비
    1. 관심의 수용체 티로신 키나아제를 발현 농경 세포주. 수확 세포와 플레이트 3-5 × 10 48 잘 조직 배양 접시에 400 ㎕의 성장 배지에서 6 세포 / 샘플. 2 ~ 3 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 알을 품다.
    2. 성장 매체에서 배 TKI 용액 100 μl를 추가하고 60 분 동안 품어.
    3. 50 mM의 HEPES (pH를 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 EDTA, 10 % (v / v) 글리세롤, 1 % (v / v) 트리톤 X-100, 및 프로테아제 억제제로 용해 버퍼를 준비한다. 문화가 이전에 수확 pervanadate으로 처리하지 않을 경우, 포스 파타 아제 억제제 (1 mM의 나트륨 orthova 추가용해 완충액에 nadate 및 0.1 ㎜ 몰리브덴 산 나트륨).
    4. 사용 직전에 pervanadate (PV) 인산 가수 분해 효소 억제제 솔루션을 준비합니다. 얼음에 어두운 튜브 (30 % 원액의 1:100 희석)에 차가운 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 과산화수소 (주)의 0.3 % 용액을 준비한다. 0.2 M 나트륨 오르토 바나 데이트 5 분 (OV,주의) 원액의 나누어지는 끓인다. 실온 (RT)에서 20 mM의 OV 용액을 만들기 위해 PBS로 1:10 희석. 0.3 %의 과산화수소 및 20 mM의 OV 1:1로 혼합하고 20 분 동안 RT에서 어둠 속에서 배양한다.
    5. 완전 배지 (60 μL의 PV + 940 ㎕의 배지)에 PV를 희석. 잘 희석 PV / 100 μl를 추가합니다. 3 분 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 부화 한 후 얼음에 플레이트를 배치합니다.
    6. 5 분 동안 2,500 rpm에서 감기의 microfuge 튜브에 세포를 수확. 기음 뜨는 용해 버퍼 120 μL의 세포를 Resuspend. 15 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 3 분 동안 6,000 rpm에서 감기의 미세에 해물을 명확히. SUPE 이동신선한 차가운 관에 rnatant. -80 ° C.에 저장
  2. 면역
    1. 1 분 동안 1,000 rpm에서의 미세에 단백질 G 세 파로스 비즈를 스핀 다운. 상층 액을 제거하고 구슬이 1 ㎖ 차가운 PBS로 2 배 씻는다. 50 %의 슬러리를 만들기 위해 PBS의 동일 부피를 추가. 각 샘플 1 차 항체와 20 μL 50 %의 단백질 G 비즈를 추가합니다. O / N 4 ° C에서 회전에 - 2 시간 동안 품어.
    2. 9,000 rpm에서 감기의 미세에있는 구슬을 펄스. 상층 액을 제거하고 구슬 150 μL 차가운 용해 버퍼와 배 씻는다. 1 분 동안 1,000 rpm으로 감기의 미세에 스핀. 2 - 머 캅토 에탄올 (주)와 20 μL 2X SDS 샘플 버퍼에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. -80 ° C에서 즉시 또는 상점 사용
    3. SDS-PAGE 트리스 - 글리신 젤에 5 분 및 실행에 대한 삶아 샘플. 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송하고 서양 얼룩에 의해 인산화 단백질을 감지합니다.
    4. 물로 얼룩을 씻어하고, 2 % SDS에서 62.5 mM 트리스 (산도 6.8), 0을 품어.50 ° C에서 30 분 동안 1 M β-머 캅토 에탄올 (주의) 물로 배를 씻어 다음 솔루션을 박리 제거하는 TBS-T의 5-6 변경에 60 ~ 90 분 동안 세척한다.
    5. 서양 얼룩에 의해 총 단백질을 감지합니다.

2. 메틸 셀룰로오스 분석

  1. 멸균 큰 구멍 무딘 엔드 바늘을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브에 메틸 인간의 기본 매체의 나누어지는 4 ML. (주 :. 프로필 메틸 사용 전에 RT O / N에서 C. 해동 ° 분취하고 -20에 저장 될 수있다)
  2. 10 초 동안 메틸 셀룰로오스와 소용돌이 혼합물 4 ㎖에 성장 배지에서 10 배 TKI 또는 차량의 500 μl를 추가합니다.
  3. 수확과 수를 셀. 최종 세포 농도보다 10 배 더 높은 농도에서 성장 매체에 세포 현탁액을 준비합니다. 메틸 혼합물에 500 ㎕의 세포 현탁액을 추가합니다. 10 초 동안 소용돌이와 거품을 제거하는 10 분 동안 앉아 보자.
  4. 5 ML의 주사기 및 멸균 larg의를 사용하여 메틸 혼합물 4 ㎖를 그리기전자는 무딘 엔드 바늘을 낳았다. 거품을 그리기하지 마십시오. 세 35mm 조직 배양 플레이트의 중심으로 메틸 혼합물 1 ㎖를 분배. 바닥이 완전히 메틸 셀룰로오스로 덮여 때까지 요리를 소용돌이 친다.
  5. 각 메틸 플레이트를 들어, 다습 한 환경을 보장하기 위해 멸균 물이 가득 두 개의 추가 35mm 조직 배양 접시에 10cm 무균 조직 배양 접시를 준비합니다. 물에있는 장소의 문화가 10 ~ 14 일 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터를 재킷.
  6. 1~2주 후 식민지를 계산합니다. 식민지는 20 개 이상의 세포와 중복되지해야합니다. 콜로니 격자 현미경 스테이지를 탑재 도립 현미경을 사용하여 또는 자동 콜로니 계수기를 이용하여 계산 될 수있다. TKI 치료에 대한 응답으로 식민지의 크기 나 형태의 변화도 평가되어야한다. (4,5 - 디메틸 -2 - 티아 졸릴) -2,5 - 디 페닐-2H-테트라 졸륨 브로마이드 졸 - (3 60-100 μL를 첨가하여 콜로니 카운터 스테인 콜로니에 의해 탐지를 향상시키는의 ution (MTT, -20 ° C에서 H 2 O, 상점에서 5 ㎎ / ㎖가, 빛,주의로부터 보호) 드롭 현명한 각 판의 표면에 5 % CO 2에서 37 ° C에서 8 시간 동안 배양.

3. 소프트 한천 분석

  1. 아래 층, 상층 0.7 % 고귀한 한천 배 성장 매체 1 % 귀족 한천을 준비합니다. 42 ° C의 물을 욕조에 2 배 성장 매체를 평형. 열 1 % 전자 레인지 (약 1 min/100의 ML) 0.7 % 귀족 한천과 42 ° C의 물을 욕조에 평형. 1 %의 한천 배의 중간과 50 ㎖의 conicals에 별도로 0.7 %의 한천 배 매체의 동일한 부분을 섞는다. 각 층에 대한 부드러운 한천 혼합 / 여섯 잘 플레이트의 계획 10 ㎖.
  2. 라벨 6 잘 조직 배양 플레이트. 1.5 ml의 1 % 부드러운 한천 혼합물로 잘 각을 입력합니다. 도금하는 동안 거품을 피하십시오. 30 분 동안 멸균 후드 뚜껑을 끈 건판.
  3. 세포를 계산합니다. 최종 세포 concentrati보다 500X 높은 농도에서 성장 매체에 세포 현탁액을 준비에. 0.7 % 아가 혼합물에 세포 현탁액을 추가 잘 혼합하고 1 % 아가 층 위에 한천 세포 혼합액 1.5 ㎖를 분배. 상부 층은 30 분 동안 고화하자.
  4. TKI 또는 차량 제어를 포함하는 1X 성장 매체를 준비합니다. 상단 한천 층 위에 TKI의 원하는 농도 매체의 2 ML을 추가합니다.
  5. 5 %에서 37 ° C에서 10 일 동안 배양한다 CO 2. 3 일마다 제거하고 중첩 매체를 교체하십시오.
  6. 식민지는 육안, 대기음 오버레이 매체에 볼 수 있으며 (4 ° C에서 H 2 O, 저장소에 1 ㎎ / ㎖ NBT 빛,주의로부터 보호) 200 ㎕의 니트로-테트라 졸 블루 솔루션을 추가합니다. 48 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 이전 세기에 적어도 2 시간 동안 4 ° C로 이동합니다. 스테인드 접시는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 현미경 또는 자동화 된 식민지 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다.

4. 생체 내에서 포스 포 - 단백질 억제의 평가

  1. C를 수집ELL 학생은 5 분 동안 1,500 rpm에서 테이블 탑 원심 분리기에서 원심 분리하여 로그 단계에서 성장. 무균 PBS로 한번 세척하고 세포를 적당한 농도로 PBS에 재현 탁 (전형적으로 1-5 × 10 7 세포 / ㎖). 28 G 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 꼬리에 정맥 주사로 6-12주 된 NSG 마우스에 100 μL의 부피에 이식 세포. 혈관을 팽창하기 위해 따뜻한 물을 비커에 꼬리를 가열 전에 주입 클로르헥시딘 면봉으로 꼬리를 청소, 제한 수단에 동물을 배치합니다. 주사 후 출혈이 멈출 때까지 멸균 거즈를 이용하여 주입 부위에 압력을 적용한다. 이식 적어도 3 동물 / 그룹. 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 황산염을 함유하는 물에 마우스를 유지한다.
  2. 포티 일 이식 후, 대상 억제 분석 TKI 또는 전용 차량 및 수확 샘플 동물을 취급합니다. 동물의 무게를 측정하고 적절한 복용량 TKI 또는 차량의 (체중 ㎎ / ㎏)으로 취급합니다. 5 ㎖ / K의 볼륨 처리를 관리경구 위관 영양법에 의해 복강 내 (IP) 주입 또는 10 ㎖ / kg 체중 기준 g 체중. IP 주입의 경우, 수동으로 마우스를 억제하고 29 G 바늘을 사용하여 복부의 우측 사분면에 주입. 경구 위관의 경우, 수동으로 마우스를 억제하고 직립 동물을 개최합니다. 혀를 통해 입의 뒷면에 입 위관 튜브를 놓습니다. 식도를 통해 위장으로 튜브를 통과하는 약간의 압력을 적용합니다. 치료를 관리하기 위해 주사기 플런저를 우울. 플런저 쉽게 우울하지 않으면 위관 영양법 바늘을 제거하고 재배치한다. 사용 직전에 TKI 제제를 준비합니다.
  3. pervanadate 치료가 요구되는 경우 (단계 1.1.4) 상술 한 바와 같이 수확 전에 PV 용액을 20 분을 준비하고 1 μM MgCl2를 100 U / ㎖ DNA 분해 효소 (120 μL의 PV + 880 ㎕의 배지) 배지로 희석한다. 주 : PV가 희석 후 최소 1 시간 동안 안정하다.
  4. AP에서 CO 2 마취에 의해 동물을 희생와 적합한 시간 (s) 후 처리. 뼈가 완전히 노출되도록 다리 전체에서 모피, 피부와 근육을 제거하여 대퇴골을 해부하다. 다만 고관절 아래에 다시 무릎 관절 위의 가위를 해부 클리핑하여 대퇴골을 제거합니다. 주사기와 27 G 바늘을 사용하여 1 ㎖ 차가운 PBS 또는 희석 PV 솔루션 페트리 접시와 플러시 골수에 전송합니다. PV로 처리하는 경우, 10 분 동안 어두운 데에서 RT에서 배양한다.
  5. 해물을 준비하고 (단계 1.1.6-1.2.5) 전술 한 바와 같이 인산화 단백질과 총 단백질 수준을 분석 할 수 있습니다.
  6. 농도계를 사용하여 각 샘플에 대하여 포스 포 - 단백질 및 총 단백질 수준을 정량화. 차량 처리 된 동물의 평균 phospho-protein/total-protein 값에 phospho-protein/total-protein 기준으로 계산합니다.

5. ALL 이종 이식 모델에서 TKIs의 반대로 백혈병 활동의 평가

  1. 필요한 경우, RS-2000 조사기 언젠가 프리 오 방사선 200 CGY에 마우스를 노출이식에 대한 연구. (단계 4.1) 상술 한 바와 같이 백혈병 세포주와 함께 이식 생쥐. 그룹 당 이식 적어도 6 마우스. 귀 펀치 마우스를 확인합니다. 대안으로, 블랙 마커 그들의 꼬리에 해시 마크 가진 마우스를 식별하기 위해 사용될 수있다. 연구 기간 동안 케이지 메이트 침략의 가능성을 줄이기 위해 새장에 농축을 추가합니다.
  2. (4.2 단계) 위의 설명에 따라 TKI 또는 차량과 쥐를 치료​​. 신체 검사와 체중 측정을 통해 매일 생쥐의 건강 상태를 모니터링합니다. 백혈병의 예상 증상 (활동 수준, 체중 감소, 뒷다리 마비, 눈의 감염을 감소). 체중 감량보다 10 % -15 %는 일반적으로 두 일 이내에 마우스의 죽음과 관련된 일반적으로 표준 IACUC의 요구 사항에 따라 사망을 대리 엔드 포인트입니다.
  3. 매주 최대 2 배의 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 통해 생착과 백혈병의 개발을 모니터링합니다. steri에 200 배의 D-루시페린 원액 (30 ㎎ / ㎖)를 준비르 물. D-루시페린이 완전히 용해 될 때까지 반전에 의해 부드럽게 혼합한다. -20 ℃에서 바로 사용하거나, 나누어지는 동결 종래 RT에서 D-루시페린의 분취 량을 해동하고 15 ㎎ / ㎖ 및 필터는 0.2 ㎛의 필터를 통해 살균의 최종 농도로 PBS에 1:2로 희석, 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 이미징.
  4. 산소 1.5 % 흡입 이소 플루 란과 영상 전에 마우스를 마취. 근육 이완, 운동의 손실 및 발가락 핀치 자극에 대한 반응의 손실을 특징으로 충분한 마취를 모니터링합니다.
  5. 즉시 이미징 전에, IP 주사 (체중의 15 ㎎ / ㎖ 루시페린 / g의 10 μL) 150 ㎎ / ㎏ 체중 D-루시페린을 관리 할 수​​ 있습니다.
  6. 연속 30, 60, 90 초 노출 및 120 초 노출 최종 이미지와 이미지의 2 시리즈를 캡처하기 위해 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용합니다. 촬영 후, 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복을 모니터링 할 수 있습니다. 에 따라생물 발광의 강도, 노광 시간이 변경 될 수있다. 최적의 노출 시간은 해당 모델에 대한 일정 및 개별 시점에 대한 신호 강도가 전체 연구에서 비교 것을 일관성 등을 보관해야합니다.
  7. 생활 이미지 3.2 수집 및 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마우스에 대한 생물 발광 강도를 결정합니다. 두 번째 각 마우스에 동일한 크기의 관심 영역 (ROI)을 그려 광자 / 측정 광속의 값을 결정합니다.
  8. 보다 큰 15 %의 중량 손실이 발생, 마비를 나타내는, 빈사 또는 연구 끝에 경우 CO 2 노광 및 경추 탈구하여 마우스를 희생한다. 마우스 및 기록 관찰 (, 골수 창백한 비장, 간, 또는 림프절의 확대)을 해부하다. 27 G 바늘을 사용하여 대퇴골과 차가운 PBS로 세척 골수를 해부하다.
  9. 5 분 동안 2,500 rpm에서의 미세 세포를 수집합니다. 2 % FBS를 함유하는 PBS에서 세포를 재현 탁하고 RT에서 5 분 동안 배양한다.20 ㎎ / ㎖ DAPI (4,6 - Diamidino -2 - 페닐 인돌 디 히드로 클로라이드, 1:1,000) 및 FITC - 복합 α-hCD45 (1:100) 또는 마우스 IgG의 1 이소 제어 항체 (1:100)와 세포와 얼룩을 수집 . 유동 세포 계측법을 사용하여 백혈병의 생착을 평가합니다. 가능한 인구에 게이트 (DAPI 음) 및 CD45 + 세포 (%의 골수 돌풍)의 비율을 결정합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

여기에 제시된 분석은 TKIs 의해 매개되는 생화학 적 및 기능적 효과를 평가하고, 시험 관내생체 내 표적 억제의 정도에 기초하여 신규 한 화합물을 평가하기 위하여 사용될 수 있으며, 콜로니 형성의 감소, 및 NSG 생쥐 leukemogenesis 지연 루시퍼 라제-이식 백혈병 세포를 태그.

면역 블롯 분석은 TKIs 치료 다음 백혈병 세포에서 표적 단백질의 활성 형태의 인산화의 억제를 결정하는 데에 이용되었다. TKIs 함께 치료. 1 TKI C가 가장 유력한 채로 급성 백혈병 세포주에서 세 가지 TKIs 의해 타겟 인산화의 억제를 보여준다 인산화 된 단백질의 양의 용량 의존적 감소의 결과, TKI B 덜 강력한 것으로하고 TKI 아무 효과가 없습니다. 따라서, 이러한 분석은 셀 기반 모델 시스템에서의 생화학 적 활성의 효능에 기초 화합물의 순위를 허용한다. 에 나타낸 예에서는도 1, 면역 침전 및 포스파타제 억제제 pervanadate의 사용에 의한 항원의 농축은 해석 결과를 달성하기 위해 필요했다. 그 이유는이 티로신 키나제의 단백질 인산화 극단적으로 불안정한 것을, 수 있습니다.

급성 백혈병 세포의 종양 특성에 TKIs의 효과를 연구하기 위해, 콜로니 형성 어 세이를 사용 하였다. 우리는 메틸 셀룰로오스 기반 (ALL) 배지 및 소프트 한천 (AML)에서 콜로니를 형성하기 위해 타겟 종속 백혈병 세포의 능력을 조사 하였다. 도 2a, 콜로니 수의 통계적으로 유의 한 감소에 도시 된 예에서 TKI 치료 후 ALL 세포주에서 관찰되었다. 비슷한 결과는 부드러운 한천 TKIs 치료 후에 AML 세포 라인에서 관찰되었다. 그림 (b)에, TKI 치료와에 대한 응답으로 감소 식민지 번호 경향이있다 감소는 용량 의존적으로 나타납니다,하지만 차이는 세인트 없습니다반복 실험 사이의 변화의 결과로 atistically 의미. 도 2a를 그림 2B 상대적으로 큰 표준 오차를합니다. 반 고체 매체와 우물 판에 반 고체 매체의 균등 분할에 세포의 충분한 혼합 클론 원성 분석에서 반복 실험의 일관성을 중요합니다. 이전 도금 가능한 세포의 정확한 계산은.도 2c는, 식민지의 편재와 접시를 보여줍니다 부드러운 한천에 거품, 불완전 접시에 부드러운 한천 (오른쪽 패널)의 확산도 실험 사이의 일관성을 유지하는 것이 중요하다 비교 (왼쪽 패널)에 적합한 도금 접시. 메틸 셀룰로오스는 배양 기간 동안 건조하지 않도록 각 접시에 멸균 플레이트를 포함하는 것도 중요합니다. 메틸 매체의 탈수 밀도를 변경함으로써 잠재적으로, 콜로니를 형성하는 세포의 능력을 감소유용한 결과의 발생을 방지한다.

TKIs는 생체 내에서 목적 단백질을 억제 할 수 있는지 여부를 확인하려면, 웨스턴 블롯 분석은 급성 백혈병 세포주 이식 NSG 생쥐에서 분리 된 골수 돌풍의 인산화 단백질과 총 단백질 수치를 검사하기 위해 사용되었다. 그림 3의 예에서, 약력 학적 분석은 차량으로 처리 마우스에 TKI 상대적으로 처리 생쥐에서 분리 된 백혈병 폭발의 인산화 단백질 수준의 감소를 공개했다. 이러한 연구는 이러한 화합물은 골수에 도달하고 효율적으로 대상을 억제하는 것을 확인하고, 생체 내에서 TKIs 치료 다음과 같은 백혈병 세포의 자동 인산화의 억제를 보여줍니다. TKI D는이 분석에서 TKI E보다 활발했다. 예, 대상 인산화 단백질을 안정화 및 탐지를 허용 할 pervanadate의 요구 활용도를 표시.

NSG 마일 급성 백혈병의 소성을 마우스 이종 이식 모델세륨은 루시퍼 라제 발현 ALL 세포주는 생체 내에서 종양 발생 가능성에 TKI 치료의 효과를 평가하기 위해 사용 된 주입. 도 4에 도시 된 바와 같이, TKI로 처리 한 마우스는 비히클 처리 한 마우스에 감소 백혈병 부담 상대적으로 나타내는 생물 발광 상당히 낮은 수준이었다. 치료 10 일 후, 모든 마우스는 차량과 TKI 치료 동물 치료 동물 사이에 차이가 없었다 생물 발광의 낮은 수준을했다. TKI의 고용량으로 치료 마우스가 훨씬 낮은 신호 강도가 있었을 때 대조적으로 19 일까지 후 처리, 차량 처리 된 마우스는 (86.12 ± 19.17 광자 / 초) 중요한 높은 생물 발광 강도를 가지고 있었다 (29.64 ± 9.04 광자 / 초) .

그림 1
그림 1. TKIs는 체외에서 목적 단백질의 인산화를 억제한다. 세포 배양이 1 시간 동안 TKI, TKI B, 또는 TKI C의 지시 농도로 처리 하였다. Pervanadate는 표적 단백질의 인산화 된 형태를 안정화하기 위해 3 분 동안 세포 배양 물에 첨가 하였다. 대상 단백질은 세포 용 해물로부터 면역 침강하고 인산화 단백질과 총 단백질은 서양 얼룩에 의해 발견되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. TKI는 메틸 부드러운 한천 급성 백혈병 세포주에서 콜로니 형성을 감소시킨다. 모든 세포가 메틸 셀룰로오스 (A)와 AML 세포에 도금 한은의 도금한다TKI 또는 DMSO (차량 제어)의 존재 하에서 OFT 한천 (B). 식민지 문화 2 주 후 계수 하였다. 평균 값과 표준 오차는 세중 판에서 파생되었다. (C) 식민지의 최적 분포 (왼쪽 패널) 또는 식민지의 불평등 한 분배와 부분적으로 분리 된 부드러운 한천 (오른쪽 패널)와 대표 부드러운 한천 플레이트가 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. TKI 치료는 생체 내에서 인산화 단백질 수준을 감소시킨다. NSG 마우스는 모든 세포주를 이식 만 백혈병의 개발 후 하나의 TKI D의 복용량, TKI E, 또는 차량으로 처리 하였다. 뼈 M화살표 세포는 대퇴골에서 채취 전에 전체 세포 용 해물의 준비에 pervanadate로 치료했다. 표적 단백질과 서양 얼룩에 의해 인산화 총 - 단백질의 검출 면역을 수행 하였다. B 신호 강도는 농도계 및 차량 처리 된 동물에 인산화 표적 단백질의 상대적으로 계산 된의 비율에 의해 정량 하였다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. TKI 치료는 루시퍼 라제 발현하는 인간의 모든 세포 라인 이식 생쥐에서 질병의 진행을 지연시킨다. NSG 생쥐의 꼬리에 주사 루시 페라 제 - 형질 ALL 세포의 단일 클론 인구 이식정맥. D-루시페린은 복강 내 주입 및 생물 발광의 이미지 (Bining : 8, FOV 19.6, F / 정지 1, 노출 시간이 120 초)를 일주일에 두 번 촬영​​했다. 의사 색조 이미지는 백혈병 세포로 이식 된 마우스에서 시간에 따른 증가 된 생물 발광 강도 및 TKI로 처리 된 동물의 생물 발광 강도의 용량 의존적 감소를 보여 나타낸다. 각 연구 그룹의 평균 생물 발광 강도와 표준 오차의 B 정량. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 원고는 급성 백혈병의 치료에 신규 한 티로신 키나제 억제제의 평가를위한 효과적인 전략을 설명한다. 이 방법을 사용, 생화학 및 항 백혈병 활동은 체외에서 세포 기반 분석에서 먼저 평가 한 후 생체 내에서 이종 이식 모델에 있습니다. 면역 블롯 분석은 성공적 TKIs 치료 후 백혈병 세포에서 표적 티로신 키나아제의 저해를 입증하는 직접 세포에서 여러 화합물의 효능을 비교하기 위해 이용 하였다. 여기에 제시된 프로토콜에 pervanadate은 인산화 단백질을 안정화하는 데 사용하고, 표적 단백질은 면역 침전에 의해 농축 하였다. 이러한 측정은 서양 얼룩에 의한 검출을 허용하기에 충분했다, 인산화 단백질의 수준도 또는 pervanadate없이 하나, 리간드의 첨가에 의해 증가 될 수있다. 유사하게, 리간드는 약동학 연구를위한 골수를 세척하는 데 사용되는 용액에 첨가 될 수있다. 리GAND은 정제 될 수 있고, 경우에 따라서, 소 태아 혈청의 구성 요소로 제공 될 수있다. 그것이 가능하면 직접 표적 단백질의 활성을 평가하기 위해 바람직하지만 이러한 방법은 자동 인산화 된 티로신 키나아제의 검출을 허용하지 않는 경우, 하류 표적은 또한, 타겟 억제 평가를 위해 사용될 수있다. 많은 세포 단백질에 영향을 미치는 비 선택적 포스파타제 억제제 pervanadate을 이용​​한 실험의 결과를 해석 할 때 참고의주의가 사용되어야한다. 이러한 이유로, pervanadate 하류 신호 성분의 변화 검출에 사용되어서는 안된다.

동물 모델에서 연구하기에 앞서 백혈병 세포에 의해 매개 TKIs 항 백혈병 활성을 확인하는 것이 바람직하다. 이 연구를 위해 우리는 메틸 또는 부드러운 한천 배지에서 클론 원성 분석에 의존하고 있습니다. 다른 분석법은 또한 배양에서 항 종양 효과를 평가하는 데 사용될 수 있지만, 콜로니 형성 어 세이는 종종 더 PR 아르액체 문화의 확산 및 / 또는 생존을 평가하는 전통적인 분석에 생체 내 효능 상대의 edictive. 그러나 이러한 분석은 TKIs 의해 매개 항 - 백혈병 활성의 메카니즘을 평가하고, 또한 그 세포주가 콜로니를 형성하지 않는 경우에 유용 할 수 콜로니 형성 어 세이와 함께 사용될 수있다. 구체적으로는 벽개 / 활성화 된 카스파의 수준을 결정하기 위해 유세포 분석법을 이용하여 TKIs 치료에 반응하여 아폽토시스의 유도를 평가하는데 유용 할 수도, 세포 표면에 아 넥신 V의 결합을 증가 또는 YOPRO -1 - 요오드화 차등 흡수 . 이와 유사하게, 또한 반대로 백혈병 활동에 기여할 수있는 증식 또는 분화 유도를 감소. 이와 같이, 성장 곡선은 증식 및 세포 형태학 및 분화 단계를 결정하기 위하여 검사 될 수있다 세포 표면 마커의 발현의 변화를 평가하기 TKI의 존재 및 부재하에 생성 될 수있다. 클론 원성의 사용분석은 물론 신약 개발 분야에 설립 TKIs의 평가를위한 비용 효과적인 도구로서 역할을한다. 그러나, (성장 인자 및 다른 보조제, 혈청 조성물의 변화 및 TKI 용액의 pH 차이를 첨가 등) 배양 조건에서의 체계적인 변화가 콜로니의 성장과 감수성 9,10 모두에 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져있다. 따라서, 배양 조건에 일관성이 분석의 재현성이 중요합니다. 세포 또는 TKI의 고르지 못한 분포는 실험적인 치료 (그림 2C)의 효능의 잘못된 분석으로 이어질 수 있습니다. 약물 노출 후 식민지 계산 또는 도금 한 번 이상 포인트의 추가 평가에 항 증식 효과를 중재하지만 치료 가능성 7이없는 약물을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에 설명 된 생체 내 연구하기 Clínica 향해 경로에 중요한 단계를 나타냅니다TKI의 L 응용 프로그램입니다. 대상 억제를 보여주기 위해 약물 역학 연구는 효능을 평가하기위한 후속 연구에 관련 투여 량 및 투여 빈도를 정의하는 것이 중요하다. 대부분의 경우에는 목적 단백질의 완전하고 연속적인 억제를 달성하기 위해,이보다 하루에 한 번 이상 처리가 필요할 수있다 바람직하다. 또한, 이종 이식 모델에서 leukemogenesis 증가 생존의 억제는 골수에있는 완전하고 지속적인 생화학 억제를 위해 필요한 것보다 TKI의 높은 용량을 필요로 할 수있다. 백혈병 여러 사이트에서 설정하고 TKIs에 노출이 뇌를 포함한 다른 해부학 적 위치에 불균일이 될 수 있기 때문에 발생할 수 있거나 (능동 표적 단백질의 제한 나머지 금액을 검출하는 장애의 결과 분석의 감도 한계를 반영 할 수있다 불완전 대상 억제). 그럼에도 불구하고, 자신의 최대 투여하는 기존의 세포 독성 요법과는 달리허용 선량, 더 종양 선택적 분자 타겟 에이전트는 목적 단백질의 생화학 적 억제에 충분하지만 상당한 독성과 연관되지 않은 낮은 복용량에 동등하게 효과적 일 수있다. 따라서, 에이전트의이 클래스에 대해, 이종 이식 모델에서 백혈병의 진행에 TKI의 효과를 평가하는 초기 연구들은 표적의 완전하고 연속적인 억제를 얻기 위해 필요한 최소 투여 량을 이용한다. 백혈병의 진행이나 ​​생존에 아무런 효과가 관찰되지 않는 경우 독성이 관찰 될 때까지 투여 량을 증가시킬 수있다. 이러한 모델은 또한 이에 후속 개발 임상 프로토콜을 알리는 표준 백혈병 치료제와 함께 투여 TKI의 효과를 조사하기 위하여 사용될 수있다.

루시 페라 제 - 표현 세포를 사용하여 급성 백혈병의 이종 이식 모델의 설립은 전통적인 이종 이식 모델에 비해 큰 진보를 대표하고 상당히 가속화 할 가능성이있다약물 발견 및 개발 (11)의 방법. 생물 발광 촬상함으로써 연구에 필요한 동물의 수를 감소 백혈병 부담의 비 침습 종 결정을 허용하고, 또한 질환의 해부학 적 위치에 대한 정보를 제공 할 수있다. 또한, TKIs의 잠재적 인 임상 유틸리티을 확장하기위한 노력의 일환으로, 생물 발광 영상을 재현 인간의 기본 루시 페라 제를 붙인 환자 샘플 (12)의 이식 후 달성 될 수있다. 그러나, 생물 발광 이미지의 해석에 의한 발광 세포의 위치 불확실성에 도전하기 때문에 생체 내 생물 발광 영상 동일한 조건 13에서 동일한 동물을 수행하는 반 정량적 도구로 사용되어야 할 수 있습니다.

여러 화합물이 더 순위에 사용할 수 있습니다 여기에 기술 분석, 추가 기준에 중요하고 유사한 작용을하는 행운 이벤트화합물 G는 상대 화합물 합성의 용이성, 가용성, 경구 생체 이용률의 정도, 약물 동태 학적 특성 및 독성 연구를 포함한다. 이와 함께, 이러한 데이터는 임상 수사 진행 상황에 대한 최적의 화합물의 식별을 허용하고 임상 연구를 가능하게하는 식품의 약국 (FDA)과 Investigational 신약 (IND) 응용 프로그램의 제출을​​ 지원하기 위해 필요합니다. 병원에이 새로운 에이전트의 발전에 필요한이 중요한 사전 임상 데이터를 생성 한 후, 건강의 암 치료 평가 프로그램 (CTEP)의 국립 연구소의 활용이 고려되어야한다. 이 프로그램에서는 임상 시험은 번역 상 연구에 특히 중점을두고, 새로운 항암제를 평가하기 위해 후원하고 있습니다. 케어는 보호 장치로 특허 출원의 제출과 함께, 새로운 화합물의 구조 및 합성에 대한 설명을 포함하여 전 임상 데이터의 공개 프리젠 테이션을 조정하기 위해주의해야한다지적 재산권을 t. 물질의 구성과 사용 방법을 보호하는 특허 출원이 제출 될 때까지 일반적으로, 데이터는 공개적으로 표시 할 수 없습니다.

결론적으로, 우리는 급성 백혈병의 치료를위한 치료제로 소설 TKIs의 가능성을 조사하고 평가하기위한 효율적인 전략을 증명하고있다. 백혈병 세포에서 표적 억제는, 배양 및 인간 백혈병 이종 이식편을 가진 마우스의 골수로부터 단리 모두 면역 블롯에 의해 평가 될 수있다. 표적 억제의 기능적 의미는 발광 생물 이미징 클론 원성 분석 및 동소 뮤린 이종 이식 모델을 사용하여 평가할 수있다. 함께 이러한 분석은 병원에 이러한 소설 번역 요원의 발전에 필요한 중요한 사전 임상 데이터를 제공합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

생체 내 이미징에서 콜로라도 암 센터의 대학에서 IVIS 공유 자원 (부여 P30-CA046934에서 지원)를 사용하여 수행 하였다. 유동 세포 계측법은 유동 세포 계측법 공유 자원, 콜로라도 암 센터의 대학 (부여 P30CA046934에서 지원)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DKG에 RO1CA137078)에 의해 부분적으로 지원되었다. ABLS 소아과의 미국 아카데미, 미국 소아과 학회 및 아동 보건 인간 발달 (K12-HD000850)의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되는 소아 과학자 개발 프로그램의 연구원입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332 
2-Mercaptoethanol  Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410  
ColonyGel Human Base Medium  ReachBio #1101  
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341  
Difco Noble Agar  BD Biosciences #214883  
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302 
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796  
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542  
FITC CD45  BD Bioscience #347463  
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2  
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04  
Protease Inhibitors  Roche #11836153001  
DNase Sigma #D4263  
Protein G Beads Invitrogen #10-1242  
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60  
  Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA  
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm   Nunclon #D8429-1CS  
6-well plates BD Bioscience #353046  
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956  
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646  
GelCount automated colony counter Oxford Optronix  
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200  
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202  
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR  
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02  
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800  
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042  
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38  
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628  
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465  
Extra fine bonn scissors FST #14084-08  
Student fine scissors FST #91460-11  
Moria ultra fine forceps FST #11370-40  
Extra fine graefe forceps FST #11150-10  
Scalpel handle FST #10003-12  
Scalpel blades FST #10011-00  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
  2. Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
  3. Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
  4. Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
  5. Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
  6. Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
  7. Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
  8. Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
  9. Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
  10. Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
  11. Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
  12. Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
  13. Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics