Præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere for Behandling af akut leukæmi

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Receptortyrosinkinaser er ektopisk udtrykkes i mange cancertyper og er blevet identificeret som terapeutiske mål i akut leukæmi. Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til præ-klinisk vurdering af tyrosinkinaseinhibitorer til behandling af akut leukæmi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Receptortyrosinkinaser har været impliceret i udviklingen og progressionen af ​​mange kræftformer, herunder både leukæmi og solide tumorer, og er attraktive druggable terapeutiske mål. Her beskriver vi en effektiv fire trin strategi for præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere (Tkis) i behandlingen af ​​akut leukæmi. Indledningsvis er Western blot-analyse anvendt til at bekræfte target hæmning i dyrkede leukæmiceller. Funktionel aktivitet evalueres derefter bruge klonogene assays i methylcellulose eller blød agar kulturer. Eksperimentelle forbindelser, der demonstrerer aktivitet i cellekultur-assays er vurderet in vivo ved hjælp af NOD-SCID-gamma (NSG)-mus transplanteret orthotopisk med humane leukæmi-cellelinier. Indledende in vivo farmakodynamiske undersøgelser evaluere mål hæmning i leukæmiske blaster isoleret fra knoglemarven. Denne fremgangsmåde anvendes til at bestemme dosis og administration er nødvendig for effektiv mål hæmmerion. Efterfølgende undersøgelser evaluere effekten af TKI'er in vivo under anvendelse luciferase udtrykker leukæmiceller, hvilket giver mulighed for ikke-invasiv bioluminescerende overvågning af leukæmi byrde og vurdering af det terapeutiske respons ved hjælp af en in vivo bioluminescens imaging system. Denne strategi har været effektiv til evaluering af TKIs in vitro og in vivo, og kan anvendes til identifikation af molekylært målrettede agenter med terapeutisk potentiale eller til direkte sammenligning og prioritering af flere forbindelser.

Introduction

Akut lymfoblastisk leukæmi (ALL) er den mest almindelige malignitet hos børn 1,2. Den samlede overlevelse for pædiatrisk B-afstamning ALL (B-ALL) er ca 85%, men specifikke biologiske undertyper, herunder T-slægt ALL (T-ALL), har stadig dårligere prognose, selv med nuværende terapeutiske protokoller. Yderligere behandling af recidiverende ALL fortsat en udfordring 3. Selv om de fleste voksne patienter med akut leukæmi opnå en remission med up-front kemoterapi, mange patienter stadig lider tilbagefald 4. Aktuelle kemoterapeutiske regimer i behandlingen af ​​akut leukæmi, er kendt for at forårsage toksicitet-associeret kort-og langsigtede bivirkninger. Derfor er mindre giftige behandlinger, der specifikt retter sig mod kræftceller med minimal effekt på normale væv stort behov. I de senere år er der lagt vægt på udvikling af nye, molekylært målrettede agenter med specificitet for kræftceller, ofte udnytter iterative kemiat generere flere aktive forbindelser, som derefter skal sammenlignes og prioriteret 5.. Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til præ-klinisk vurdering af TKI'er til behandling af akut leukæmi, som kan anvendes til evaluering af en enkelt forbindelse eller en direkte sammenligning af flere forbindelser for at lette udvikling af lægemidler.

Metoden præsenteres her består af fire trin. Først biokemiske (1) og anti-leukæmi (2) aktiviteter af forbindelsen (e) er evalueret i cellekultur, og derefter inhibering af målet er bekræftet i dyremodeller (3), og endelig terapeutiske effekt TKI (r) bestemmes i ortotopisk leukæmi xenograftmodeller (4). Til disse undersøgelser, er det vigtigt at vælge relevante cellelinjer, som er repræsentanter for de mest almindelige biologiske undertyper. Bør vælges cellelinjer, som begge giver udtryk for målet af interesse og mangler mål af interesse at undersøge, om biologiske effekter withiated ved inhibering af målet. Dette er særlig relevant for udvikling af små molekyle inhibitorer, som har ikke-tilsigtede virkninger, der kan være vigtige for anti-tumor aktivitet. Det er også nødvendigt at vælge en cellelinie, som er afhængig af målet for funktionelle virkninger såsom proliferation eller overlevelse. Foreløbige mål valideringsstudier (uden for rammerne af denne artikel) ved hjælp af RNA-interferens eller andre specifikke midler til at hæmme målet kan bruges til at identificere target-afhængige cellelinier. Det er også ønskeligt at vælge cellelinier, der kan danne murine xenotransplantater, således at cellekultur resultater kan være mere direkte oversat til in vivo eksperimenter.

Ved evaluering af biokemisk aktivitet medieret af TKI'er i leukæmiceller, kan et fald i receptor-phosphorylering anvendes som en indikator for målet hæmning. Western-blot-analyse eller ELISA-assays kan anvendes, afhængigt af tilgængeligheden og specificiteten af ​​antistoffer.Hvis antistoffer med tilstrækkelig specificitet for målet er til rådighed, ELISA-assays er at foretrække, da de er mere kvantitativ og effektiv. I tilfælde, hvor antistoffer med tilstrækkelig specificitet til ELISA er tilgængelige, kan det være nødvendigt western blot analyse. I dette tilfælde kan immunopræcipitation af en stor mængde af lysat være nyttig til påvisning af mål, der er i lav tæthed. Denne fremgangsmåde er særlig relevant til måling af fosfor proteiner, som kan have en kort halveringstid for at muliggøre hurtige ændringer i signalering som reaktion på miljømæssige stimuli. Nogle phosphorylerede proteiner er ekstremt labile, sandsynligvis som følge af kompleksdannelse med phosphataser. For robust og konsekvent detektering af disse phosphorylerede proteiner, kan det også være muligt at behandle celler med pervanadat, en irreversibel proteintyrosinkinase phosphataseinhibitor 6 at stabilisere phospho-protein forud for fremstilling af helcellelysater.

Tilafgøre, om biokemisk aktivitet resulterer i anti-tumor-virkninger, kan mål-afhængige biologiske processer overvåges i cellebaserede forsøg. For leukæmi cellelinier, kan anti-leukæmi aktivitet medieret af TKIs vurderes ved hjælp kolonidannelse analyser udført i methylcellulose eller blød agar 7. Blød agar kan foretrækkes, da dette er et fast medium, der er mere modtagelig for manipulation, hvis det er nødvendigt gentagen behandling med en TKI. Mens mange akutte myloid leukæmi (AML)-cellelinjer vil danne kolonier i blød agar, vil de fleste ALLE cellelinjer kun danne kolonier i methylcellulose, der er en halvfast medium. Selv om det er muligt at opdatere medium og / eller TKI'er i methylcellulose kulturer, kan kun små mængder skal anvendes, og med begrænset frekvens. Ligeledes er det vanskeligere at plette kolonier uden at forstyrre dem i methylcellulose. Foreløbige undersøgelser bør definere evne egnede cellelinier til at danne kolonier i methylcellulose og / eller blød agar og than optimal tæthed af celler i kultur sådan, at kolonier er ikke-overlappende og i tilstrækkeligt antal til at opnå statistisk relevante data (normalt 50-200 kolonier pr 35 mm plade).

Mens in vitro assays er robuste og omkostningseffektive, og har færre etiske implikationer end hele dyreforsøg, fremme af terapeutiske forbindelser kræver bevis for effekt og sikkerhed i dyremodeller. For in vivo-undersøgelser, kan humane akut leukæmi cellelinier orthotopisk transplanteret ind NOD.Cg-Prkdc SCID jeg l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) mus og TKIs kan let administreres ved injektion eller oral sonde. Nogle cellelinier kan kræve eksponering af NSG mus til et lavt cellelinie-afhængige strålingsdosis for at xenotransplantater at etablere, og i dette tilfælde kan musene ikke tåle oral sondeernæring uden en 5-10 dages restitutionsperiode efter bestråling. Dette håndskrift beskriver generation af B-ALL og T-ALL xenografter hjælpspecifikke cellelinier (697 og Jurkat) som eksempler, men implanteret kan være etableret i NSG mus ved hjælp af en bred vifte af cellelinier. I tilfælde af at andre cellelinier er mere anvendelig og kravet om bestråling optimale antal celler til transplantation, og tidspunktet for sygdommens indtræden og progression skal bestemmes eksperimentelt. Ideelt set vil disse modeller har fuldstændig penetrans (hvert dyr transplanteret udvikler leukæmi), konsekvente kinetik (leukæmi skrider på samme måde i alle dyr) og en rimelig behandling vindue (ideelt 20-30 dage mellem initiering af behandling og fjernelse fra undersøgelsen på grund af sygdom) . Antallet af celler transplanteret kan øges for at forbedre penetrans og kinetisk konsistens eller reduceres for at forbedre behandlingen vinduet, hvis det er nødvendigt.

At afgøre, om TKIs mægle mål hæmning in vivo, der prøver fra mus med leukæmi implanteret efter behandling med TKI eller eneste køretøj. Ideelt dosis end tidsplan for administration for disse eksperimenter er styret af farmakokinetiske studier, som ofte kan udføres af kommercielle laboratorier og er uden for rammerne af denne artikel. Hvis der foreligger farmakokinetiske data, kan koncentrationen af ​​forbindelse, der kræves for en effektiv mål hæmning i cellekultur og den maksimale serumkoncentration efter en enkelt dosis af TKI bruges til at definere en dosis for dyreforsøg start. Farmakokinetiske undersøgelser kan også informere timingen af ​​prøvetagningen efterbehandling for farmakodynamiske undersøgelser og administrationsvejen. Hæmning af målet kan vurderes i alle berørte organ, men væv, der er lettest indsamles og behandles, er at foretrække. Mest akutte leukæmi cellelinier etablere sig i leveren, knoglemarv, milt, perifert blod, og det centrale nervesystem, selv om de specifikke berørte organer og omfanget af transplantation i disse organer varierer mellem modeller. Protokollen præsenteres her vurderer Phospho-protein-hæmning i knoglemarven ved hjælp western blot analyse, men faste organer kan være lettere at konsekvent høste og kræver minimal eller ingen behandling inden frysning, så mindre mulighed for nedbrydning af fosfor proteiner under prøven indsamling og behandling. Immunohistokemi kan også bruges til at evaluere solide tumorer eller organer ramt af leukæmi.

Endelig er den terapeutiske effektivitet af TKI (r) bestemt i ortotopisk leukæmi xenograftmodeller. Til disse studier kan timingen af ​​behandlingsstart varieres, således at sygdom er mere eller mindre etableret. Behandlingen kan påbegyndes umiddelbart efter transplantation for indledende undersøgelser og derefter blive forsinket i efterfølgende undersøgelser indtil betydelig sygdomsbyrde opdages til i højere grad tilnærme en diagnostisk behandling model. Ideelt set er disse dyremodeller har også evnen til ikke-invasiv måling af sygdomstilfælde. Vi har optimeret metoder til indførelse af ildflue luciferase-genet i leukæmicellelinjer anvendelse af virus-lignende partikler, der giver mulighed for ikke-invasiv, longitudinal analyse af sygdommens indtræden og progression og vurdering af sygdomsbyrden i knoglemarv og massive organer. Afgørende for denne fremgangsmåde er anvendelse af monoklonale luciferase-mærket cellelinjer forhindre variation i udviklingen af luciferase-udtrykkende leukæmi er forbundet med anvendelsen af polyklonale cellelinier og er relateret til behandling med en TKI 8.

Tilsammen kan disse trin anvendes til evaluering af et enkelt TKI eller til direkte sammenligning og rangordning af flere TKIs. Mens de protokoller, der præsenteres her at fokusere på udvikling af TKI'er kan disse metoder kan tilpasses til andre mål og overvejelser for assayudvikling beskrevet. Derfor kan denne strategi være mere bredt anvendelig til præklinisk evaluering af molekylært målrettede midler til behandling af akut leukæmi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med dyr, fulgte de lovgivningsmæssige standarder, der er godkendt af University of Colorado Institutional Animal Care og brug Udvalg. Den viste protokol blev godkendt af University of Colorado Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Phospho-protein Western Blot

  1. Fremstilling af lysater
    1. Kultur cellelinier, der udtrykker receptoren tyrosinkinase af interesse. Harvest celler og plade 3-5 x 10 6 celler / prøve i 400 pi vækstmedium i en 48-brønds vævsdyrkningsskål. Inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 2-3 timer.
    2. Tilsæt 100 pi 5x TKI opløsning i vækstmedium og inkuberes i 60 min.
    3. Forbered lyseringspuffer med 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) glycerol, 1% (v / v) Triton X-100 og proteaseinhibitorer. Hvis kulturerne ikke vil blive behandlet med pervanadat før høst, tilføje phosphataseinhibitorer (1 mM natrium orthovanadate og 0,1 mM natriummolybdat) lysis buffer.
    4. Forbered pervanadat (PV) phosphataseinhibitor opløsning umiddelbart før brug. Der fremstilles en 0,3% opløsning af hydrogenperoxid (PAS) i koldt phosphatbufret saltvand (PBS) i et mørkt rør på is (1:100 fortynding af en 30% stamopløsning). Kog en portion af 0,2 M natriumorthovanadat (OV PAS) stamopløsning i 5 min. Fortynd 1:10 i PBS for at gøre 20 mM OV opløsning ved stuetemperatur (RT). Bland 0,3% hydrogenperoxid og 20 mM OV 1:1 og inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter.
    5. Fortyndet PV i komplet medium (60 ul PV + 940 pi medium). Tilsæt 100 pi fortyndet PV / brønd. Inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 3 min og derefter placere plade på is.
    6. Cellerne høstes i kolde mikrocentrifugerør ved 2.500 rpm i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 120 pi lysisbuffer. Inkuberes på is i 15 min. Afklar lysatet i en kold mikrocentrifuge ved 6.000 rpm i 3 minutter. Overfør supernatant til et frisk koldt rør. Opbevar ved -80 ° C.
  2. Immunpræcipitation
    1. Spin ned protein G sepharoseperler i mikrocentrifuge ved 1.000 rpm i 1 min. Fjern supernatanten og vask perler 2x med 1 ml kold PBS. Læg et tilsvarende volumen PBS til at gøre en 50% opslæmning. Tilføj primær antistof og 20 pi 50% protein G-perler til hver prøve. Inkuber i 2 timer - O / N ved 4 ° C på en rotator.
    2. Pulse ned perler i en kold mikrofuge ved 9.000 rpm. Fjern supernatanten og vaske perlerne 2x med 150 pi kold lysepuffer. Spin i koldt mikrocentrifuge ved 1.000 rpm i 1 min. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 20 pi 2X SDS Sample Buffer med 2-mercaptoethanol (PAS). Anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.
    3. Kog prøver til 5 min og køre på en SDS-PAGE tris-glycin-gel. Overfør proteinerne til en nitrocellulosemembran og afsløre phospho-protein ved Western blot.
    4. Skyl blot med vand og derefter inkuberes i 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoethanol (PAS) i 30 minutter ved 50 ° C. Skyl 2x med vand og derefter vaskes for 60-90 min i 5-6 ændringer i TBS-T for at fjerne stripping løsning.
    5. Detect total-protein ved Western blot.

2. Methylcellulose Assay

  1. Afmål 4 ml methylcellulose humant basemedium i 50 ml koniske rør ved hjælp af en steril stor boring stump ende nål. (Bemærk:. Methylcellulose kan alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Optø ved RT O / N før brug)
  2. Tilsæt 500 pi 10x TKI eller køretøj i vækstmedium til 4 ml methylcellulose og vortex blandingen i 10 sek.
  3. Høst og tælle celler. Forbered en celle suspension i vækstmedium i en koncentration, der er 10x højere end koncentrationen endelige celle. Tilsæt 500 pi cellesuspension til methylcellulose blanding. Vortex i 10 sek og lad det sidde i 10 minutter for at fjerne bobler.
  4. Udarbejde 4 ml methylcellulose blanding ved hjælp af en 5 ml sprøjte og sterilt large boring stumpe ende nål. Undgå at udarbejde bobler. Doser 1 ml af methylcellulose blandingen i midten af ​​tre 35 mm vævskulturplader. Swirl retter indtil bunden er helt dækket med methylcellulose.
  5. For hver methylcellulose plade, udarbejde en 10 cm steril vævskulturplade med to yderligere 35 mm vævskulturplader fyldt med sterilt vand for at sikre et fugtigt miljø. Place kulturer i vandkappe inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 10-14 dage.
  6. Tæl kolonier efter 1-2 uger. Kolonier bør være mere end 20 celler og ikke overlappende. Kolonier kan tælles ved anvendelse af et inverteret mikroskop udstyret med et mikroskop scenen med et gitter eller anvendelse af en automatiseret kolonitæller. Ændringer i kolonistørrelse eller morfologi i respons på behandling med TKI bør vurderes. For at forbedre påvisning ved koloni tæller, bejdse kolonier ved tilsætning af 60-100 pi (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid solution (MTT, 5 mg / ml i H 2 O, opbevares ved -20 ° C, beskyttet mod lys, PAS) dråbevis over overfladen af hver plade og inkubering i 8 timer ved 37 ° C i 5% CO2.

3. Soft Agar Assay

  1. Forbered 1% ædle agar til bundlaget, 0,7% ædle agar til øverste lag og 2x vækstmedium. Ækvilibrer 2x vækstmedium i et 42 ° C vandbad. Varm 1% og 0,7% ædle agar i en mikrobølgeovn (ca. 1 min/100 ml) og ligevægt i et 42 ° C vandbad. Bland lige dele af 1% agar og 2x medium og hver 0,7% agar og 2x medium i 50 ml conicals. Plan 10 ml blød agar blandingen / seks-brønds plade for hvert lag.
  2. Label 6-brønds vævskulturplader. Fyld hver brønd med 1,5 ml 1% blød agar blanding. Undgå bobler under plating. Tørre plader med låg off i steril hætte i 30 min.
  3. Tæl celler. Forbered en celle suspension i vækstmedium i en koncentration, som er 500x højere end den endelige celle Concentratipå. Tilføj cellesuspension til 0,7% agar blandingen, bland godt og dispensere 1,5 ml agar celle blandingen på toppen af ​​1% agar lag. Lad det øverste lag størkne i 30 minutter.
  4. Forbered 1x vækstmedium indeholdende TKI eller køretøj kontrol. Tilsæt 2 ml medium med den ønskede koncentration af TKI på toppen af ​​topagarlag.
  5. Inkuberes kulturerne i 10 dage ved 37 ° C i 5% CO2. Fjern og udskift overliggende medium hver 3 dage.
  6. Når kolonier er synlige for det blotte øje, aspireres overliggende medium og tilsæt 200 ul nitro-tetrazolium blå opløsning (1 mg / ml NBT i H 2 O, opbevares ved 4 ° C, beskyttes mod lys, PAS). Retur til inkubator for 24-48 timer. Flyt til 4 ° C i mindst 2 timer før tælling. Farvede plader kan opbevares ved 4 ° C i en måned. Tæl kolonier ved hjælp af et mikroskop eller en automatiseret kolonitæller.

4.. Evaluering af Phospho-protein-inhibering in vivo

  1. Saml calen vokser i log-fase ved centrifugering i en bordcentrifuge ved 1.500 rpm i 5 min. Vask cellerne en gang med sterilt PBS og resuspenderes i PBS ved en passende koncentration (typisk 1-5 x 10 7 celler / ml). Transplant celler i et volumen på 100 ul i 6-12 uger gamle NSG mus ved intravenøs injektion i halevenen under anvendelse af en 28 G insulinsprøjte. Dyret i en fastholdelsesanlæg opvarmes halen i et bægerglas af varmt vand til at spile venerne og rengør halen med en chlorhexidin vatpind før injektion. Efter injektion, lægge pres på injektionsstedet hjælp steril gaze indtil blødningen stopper. Transplant mindst 3 dyr / gruppe. Oprethold mus på vand indeholdende 1 mg / ml gentamycinsulfat.
  2. Fjorten dage efter transplantationen, behandle dyr med TKI eller eneste køretøj og høst prøver til analyse af target hæmning. Dyr vejes og behandles med en passende dosis (mg / kg legemsvægt) af TKI eller vehikel. Foretage behandling i et volumen på 5 ml / kg kropsvægt ved intraperitoneal (ip) injektion eller 10 ml / kg legemsvægt ved oral tvangsfodring. For ip injektion, begrænse musen manuelt, og injicere i nederste højre kvadrant af maven ved hjælp af en 29 G kanyle. Til oral sondeernæring, begrænse musen manuelt og holde dyret oprejst. Placer gavage rør i munden over tungen og ind i den bageste del af munden. Pres let at passere røret gennem spiserøret og ind i maven. Tryk sprøjtens stempel til at administrere behandlingen. Hvis stemplet ikke trykkes let sonde nål bør fjernes og flyttes. Forbered TKI formuleringer umiddelbart før brug.
  3. Hvis pervanadat behandling er ønsket, forberede PV opløsning 20 min før høst som beskrevet ovenfor (trin 1.1.4) og fortyndes i medium med 1 uM MgCl2 og 100 U / ml DNase (120 pi PV + 880 pi medium). Bemærk: PV er stabil i mindst 1 time efter fortynding.
  4. Sacrifice dyr af CO 2 narkose på apmæssig tid (s) efter behandlingen. Dissekere lårben ved at fjerne skind og muskel fra hele benet, således at knoglerne helt åbent. Fjern lårben ved klipning med at dissekere en saks lige under hofteleddet og igen over knæleddet. Overførsel til en petriskål og skyl knoglemarv med 1 ml kold PBS eller fortyndet PV løsning med en sprøjte og en 27 G kanyle. Hvis behandling med PV, inkuberes ved RT i mørke i 10 minutter.
  5. Forbered lysater og analysere fosfor protein og total-protein niveauer som anført ovenfor (trin 1.1.6-1.2.5).
  6. Kvantificere relativ fosfor protein og total-protein niveauer for hver prøve ved hjælp af densitometri. Beregn phospho-protein/total-protein forhold til den gennemsnitlige phospho-protein/total-protein værdi for vehikelbehandlede dyr.

5.. Evaluering af Anti-leukæmi aktivitet af TKIs i ALLE xenograftmodeller

  1. Hvis det er nødvendigt, udsætte mus til 200 cGy af stråling i en RS-2000 stråleovnen en dag prior til transplantation. Transplant mus med leukæmi-cellelinjer som beskrevet ovenfor (trin 4.1). Transplant på mindst 6 mus per gruppe. Identificer mus ved øret punch. Alternativt kan en sort markør anvendes til at identificere mus med hashmærker på deres haler. Tilføj berigelse til bure for at reducere risikoen for buret mate aggression i løbet af undersøgelsen.
  2. Behandle mus med en TKI eller kun vehikel som beskrevet ovenfor (trin 4.2). Overvåg sundhedstilstand mus dagligt via fysisk undersøgelse og vægt beslutsomhed. Forventede symptomer på leukæmi (reduceret aktivitetsniveau, vægttab, bagbensparalyse og øjeninfektioner). Vægttab mere end 10% -15% er normalt forbundet med død mus inden for to dage, og er typisk en surrogat endpoint for død i overensstemmelse med standard IACUC krav.
  3. Overvåg engraftment og udvikling af leukæmi via en in vivo bioluminescens imaging system op til 2x ugentligt. Forbered en 200X D-luciferin stamopløsning (30 mg / ml) i Sterile vand. Bland forsigtigt ved inversion indtil D-luciferin er helt opløst. Brug det samme, eller portion og fryse ved -20 ° C. Forud for billeddannelse ved hjælp af en in vivo bioluminescens imaging system, optø portioner af D-luciferin ved stuetemperatur og fortyndes 1:02 i PBS til en slutkoncentration på 15 mg / ml og filtreres sterilisere gennem et 0,2 um filter.
  4. Bedøve musene før billeddannelse med 1,5% inhaleret isofluran i oxygen. Overvåg tilstrækkelig anæstesi, kendetegnet ved muskel afslapning, tab af bevægelse, og tab af respons til tå-pinch stimulation.
  5. Umiddelbart før billeddannelse, administrere 150 mg / kg legemsvægt D-luciferin ved ip injektion (10 pi 15 mg / ml luciferin / g legemsvægt).
  6. Brug en in vivo bioluminescens imaging system til at fange 2 serier af billeder med sekventielle 30, 60 og 90 sec engagementer og et endeligt billede med en 120 sek eksponering. Efter billedbehandling, returnere mus til bure og overvåge for genvinding fra anæstesi. Afhængigt afintensiteten af ​​bioluminescens, kan varieres eksponeringstider. Optimal eksponering tider bør forudbestemt for en given model, og holdt konsekvent, således at signalintensiteter for de enkelte tidspunkter er sammenlignelige på tværs af hele undersøgelsen.
  7. Bestem bioluminescens intensitet for hver mus ved hjælp Living Billede 3.2 indsamling og analyse software. Bestem den samlede flux målte værdier i fotoner / sekund ved at tegne regioner af interesse (ROI) af samme størrelse over hver mus.
  8. Sacrifice mus af CO 2-eksponering og cervikal dislokation hvis døende, udviser lammelse, i tilfælde af mere end 15% vægttab, eller ved slutningen af studiet. Dissekere mus og optage observationer (udvidelse af milt, lever eller lymfeknuder, bleg knoglemarven). Dissekere lårben og flugter knoglemarv med kold PBS ved anvendelse af en 27 G nål.
  9. Saml celler i en mikrofuge ved 2.500 rpm i 5 min. Resuspender celler i PBS indeholdende 2% FBS og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.Indsamle celler og pletten med 20 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid, 1:1000) og FITC-konjugeret α-hCD45 (1:100) eller muse-IgG 1 isotype kontrol antistof (1:100) . Vurdere leukæmi engraftment hjælp flowcytometri. Gate på levedygtige population (DAPI negativ) og bestemme procentdelen af ​​CD45 +-celler (% knoglemarv blaster).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Assayene præsenteret her vurdere de biokemiske og funktionelle virkninger medieret af TKI'er og kan bruges til at rangere hidtil ukendte forbindelser baseret på graden af mål-inhibering in vitro og in vivo, reduktion af kolonidannelse, og forsinkelse i leukemogenesis i NSG mus transplanteret med luciferase- mærkede leukæmiceller.

Immunblot-analyse blev anvendt til at bestemme inhibering af den aktive phosphorylerede form af målproteinet i leukæmi-celler efter behandling med TKI'er. Behandling med TKI'er resulterede i et dosisafhængigt fald i mængden af phosphoryleret protein. Figur 1 viser inhibering af målet phosphorylering af tre forskellige TKI'er i en akut leukæmi cellelinje TKI C er den mest potente, TKI B er mindre potent og TKI A ikke har nogen effekt. Således dette assay tillader placeringen af ​​forbindelser baseret på styrken af ​​biokemisk aktivitet i et cellebaseret modelsystem. I de viste i eksemplerneFigur 1, berigelse af antigen ved immunpræcipitation og anvendelse af phosphataseinhibitoren pervanadat var nødvendige for at opnå fortolkelige resultater. Grunden hertil kunne være, at proteinet phosphorylering af denne tyrosinkinase er ekstremt labil.

For at undersøge virkningen af ​​TKI'er på onkogene egenskaber af akut leukæmi celler blev kolonidannelse assays anvendes. Vi undersøgte evnen af ​​mål-afhængige leukæmiceller til at danne kolonier i methylcellulose-baserede (ALL) medie og i blød agar (AML). I eksemplet vist i figur 2A, en statistisk signifikant reduktion i antallet af kolonier eksempel blev observeret i en ALL cellelinje efter behandling med en TKI. Lignende resultater blev observeret i AML cellelinier efter behandling med TKIs i blød agar. I figur 2B er der en tendens mod nedsat antallet af kolonier i respons på behandling med TKI og faldet vises dosisafhængig, men forskellen er ikke statistically signifikant som følge af variation mellem gentagelser. Bemærk den store standardfejl i figur 2B i forhold til figur 2A. Rigelig blanding af celler i halvfaste medium og ligelig fordeling af den halvfaste medium i brøndene eller plader er kritisk for sammenhæng mellem replikater i klonogene assays. Præcis optælling af levedygtige celler før plettering er også vigtigt at sikre sammenhængen mellem eksperimenter. Figur 2C viser en plade med en ujævn fordeling af kolonier, bobler i blød agar, og ufuldstændig spredning af blød agar i pladen (højre panel), og en plade med tilstrækkelig plating til sammenligning (venstre panel). For at sikre at methylcellulose ikke udtørrer under inkubationsperioden er det også vigtigt at medtage plader af sterilt vand i hver skål. Dehydrering af methylcellulose medium ændrer sin tæthed og dermed reducerer cellernes evne til at danne kolonier, potentieltforhindrer dannelsen af ​​nyttige resultater.

For at bestemme om TKIs kan hæmme målproteinet i vivo blev western blot analyse ansat til at undersøge fosfor protein og total-protein niveauer i knoglemarv blaster isoleret fra NSG mus transplanteret med en akut leukæmi cellelinje. I den i figur 3 viste eksempel farmakodynamiske analyse afslørede et fald i phospho-protein-niveauer i leukæmiske blaster isoleret fra mus behandlet med TKI i forhold til mus behandlet med kun vehikel. Disse undersøgelser viser inhibering af auto-phosphorylering i leukæmi-celler efter behandling med TKI'er in vivo, hvilket bekræfter, at disse forbindelser nå knoglemarven og effektivt at inhibere målet. TKI D var mindre aktiv end TKI E i dette assay. Det viste eksempel kræves anvendelse af pervanadat at stabilisere målet phospho-protein og give mulighed for detektion.

En ortotopisk mus xenotransplantatmodel af akut leukæmi i NSG mice injiceret med en luciferase-udtrykkende ALL cellelinie blev anvendt til at vurdere virkningen af behandling med en TKI på onkogent potentiale in vivo. Som vist i figur 4 mus behandlet med TKI haft en betydelig lavere bioluminescens, hvilket indikerer en reduceret leukæmi byrde i forhold til mus behandlet med kun vehikel. Efter 10 dages behandling var alle mus havde et lavt niveau af bioluminescens, der var ikke signifikant forskellig mellem dyr behandlet med bærer og dyr behandlet med TKI. I modsætning hertil med 19 dage efter behandling, vehikelbehandlede mus havde signifikant højere bioluminescence intensitet (86,12 ± 19,17 fotoner / sek), mens mus behandlet med en høj dosis af TKI havde meget lavere signal intensitet (29,64 ± 9,04 fotoner / sek) .

Figur 1
Figur 1. TKI'er inhiberer phosphorylering af målproteinet in vitro. Cellekulturerne blev behandlet med de angivne koncentrationer af TKI A, TKI B eller TKI C i 1 time. Pervanadat blev tilsat til cellekulturer i 3 minutter for at stabilisere den phosphorylerede form af målproteinet. Målet protein blev immunudfældet fra cellelysater og fosfor protein og total-protein blev påvist ved western blot. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. TKI reducerer kolonidannelse i akutte leukæmi cellelinjer i methylcellulose og blød agar. ALL-celler blev udpladet i methylcellulose (A) og AML-celler blev udpladet i soft agar (B) i nærværelse af en TKI eller DMSO (køretøj kontrol). Kolonier blev talt efter 2 uger i kultur. Middelværdier og standardfejl blev afledt fra tredobbelte plader. (C) Repræsentative bløde agarplader med optimal fordeling af kolonier (venstre panel) eller ulige fordeling af kolonier og en delvist løsrevet blød agar (højre panel) er vist. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. Behandling med TKI reducerer phospho-protein-niveauer in vivo. A NSG mus blev transplanteret med en ALL-cellelinie og behandlet med en enkelt dosis af TKI D, TKI E, eller kun vehikel efter udvikling af leukæmi. Bone marrow Cellerne blev opsamlet fra lårben og behandlet med pervanadat forud for fremstilling af helcellelysater. Immunopræcipitation af target protein, og afsløring af fosfor og total-proteiner ved western blot blev udført. B Signal intensitet blev kvantificeret ved densitometri og fraktionen af phosphoryleret target protein i forhold til vehikelbehandlede dyr blev beregnet. Klik her for at se større billede .

Figur 4
Figur 4.. Behandling med TKI forsinker sygdomsprogression i mus transplanteret med et luciferase-udtrykkende human ALL cellelinje. NSG mus blev transplanteret med et monoklonalt population af luciferase-transducerede ALL-celler ved injektion i halenvene. D-luciferin blev injiceret intraperitonealt og bioluminescens billeder blev taget to gange ugentligt (kombinering: 8, FOV 19,6, f / stop 1, eksponeringstid 120 sek). A pseudo-billeder vises demonstrerer øget bioluminescens intensitet over tid i mus transplanteret med leukæmiceller og en dosisafhængig reduktion i bioluminescens intensitet i dyr behandlet med en TKI. B Kvantificering af middelværdi bioluminescens intensitet og standardafvigelse for hver studiegruppe. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til evaluering af nye tyrosinkinaseinhibitorer i behandlingen af ​​akut leukæmi. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, er biokemiske og anti-leukæmi-aktiviteter evalueres først i cellebaserede assays in vitro og derefter i xenograftmodeller in vivo. Immunoblotanalyse blev anvendt med succes til at påvise inhibering af målet tyrosinkinase i leukæmiceller efter behandling med TKI'er og direkte at sammenligne styrken af ​​flere forbindelser i celler. I den protokol, der præsenteres her, blev pervanadat bruges til at stabilisere phospho-protein og målproteinet blev koncentreret ved immunopræcipitation. Hvis disse målinger var utilstrækkelige til give mulighed for detektion af western blot kan niveauerne af fosfor protein også øges ved tilsætning af ligand, enten med eller uden pervanadat. Tilsvarende kan liganden tilsættes til opløsningen anvendes til at skylle knoglemarv for farmakodynamiske studier. Ligand kan oprenses eller i nogle tilfælde, kan tilvejebringes som en bestanddel af føtalt bovint serum. I tilfælde af, at disse metoder ikke tillader påvisning af auto-phosphoryleret tyrosinkinase kan nedstrømsmål også anvendes til vurdering af målet inhibering, selv om det foretrækkes at vurdere aktiviteten af ​​målproteinet direkte, når det er muligt. Notatet, bør der udvises forsigtighed ved fortolkning af resultater af forsøg med pervanadat, som er en non-selektiv phosphataseinhibitor der påvirker mange cellulære proteiner. Af denne grund bør pervanadat ikke anvendes til påvisning af ændringer i downstream signaling komponenter.

Forud for at studere i dyremodeller, er det ønskeligt at bekræfte anti-leukæmi aktivitet medieret af TKIs i leukæmi celler. Til disse undersøgelser vi stole på klonogene assays i methylcellulose eller blød agar medium. Mens andre assays kan også anvendes til at evaluere anti-tumor effekt i kultur, kolonidannelse assays er ofte mere predictive af in vivo-effekt i forhold til mere traditionelle analyser, der vurderer proliferation og / eller overlevelse i flydende kultur. Dog kan disse assays anvendes sammen med kolonidannelse assays til at evaluere de mekanismer af anti-leukæmi aktivitet medieret af TKI'er og kan også være nyttige i tilfælde af, at en cellelinie af interesse ikke danner kolonier. Specifikt kan det være nyttigt at vurdere induktion af apoptose i respons på behandling med TKI'er hjælp flowcytometriske analyser til at bestemme niveauer af de spaltede / aktiverede caspaser, øget binding af Annexin V til celleoverfladen eller differential optagelse af YOPRO-1-iodid . Tilsvarende nedsat proliferation eller induktion af differentiering kan også bidrage til anti-leukæmi aktivitet. Som sådan kan vækstkurver dannes i nærvær og fravær af TKI at vurdere proliferation og cellulær morfologi og ændringer i ekspression af celleoverflademarkører kan undersøges for at afgøre, differentiering fase. Anvendelsen af ​​klonogeneassays er veletableret inden for lægemiddeludvikling og tjener som et omkostningseffektivt redskab til evaluering af TKIs. Imidlertid er det kendt, at den systematiske ændringer i dyrkningsbetingelserne (herunder tilsætning af vækstfaktorer og andre kosttilskud, variationer i serum sammensætning, og forskelle i pH-værdien af TKI opløsning) kan påvirke både kolonivækst og kemosensitivitet 9,10. Derfor konsistens i dyrkningsbetingelser er kritisk for reproducerbarhed i dette assay. Ujævn fordeling af celler eller TKI kan også føre til mischaracterization for effekten af forsøgsbehandlinger (figur 2C). Ud over vurdering af mere end et tidspunkt for kolonitælling eller plettering efter eksponering for lægemidlet kan bidrage til at skelne mellem stoffer, der medierer anti-proliferative virkninger, men har ingen helbredende potentiale 7.

In vivo forsøg er beskrevet her repræsenterer et afgørende skridt på vejen mod Clinical anvendelsen af ​​en TKI. Farmakodynamiske undersøgelser for at påvise mål hæmning er vigtigt at definere den relevante dosis og frekvens af administrationen for efterfølgende undersøgelser for at vurdere effekten. I de fleste tilfælde foretrækkes det at opnå en fuldstændig og kontinuerlig inhibering af målproteinet, og dette kan kræve behandling mere end én gang om dagen. Derudover kan inhibering af leukemogenesis og øget overlevelse i xenograftmodeller kræve en højere dosis TKI, end der kræves til fuldstændig og kontinuerlig biokemisk hæmning i knoglemarven. Dette kan skyldes, leukæmi fastlægger flere steder og eksponering for TKI'er kan være heterogen i forskellige anatomiske steder, herunder hjernen, eller det kan afspejle begrænsninger i følsomhed af assayet resulterer i en manglende evne til at detektere begrænsede resterende mængder af aktiv målprotein ( dvs ufuldstændig mål hæmning). Ikke desto mindre, i modsætning til traditionelle cytotoksiske behandlinger, som administreres på deres maksimaletolererede dosis, kan flere tumorselektive molekylært målrettede midler være lige så effektiv ved lavere doser, der er tilstrækkelige til biokemisk hæmning af målproteinet, men er ikke forbundet med signifikant toksicitet. Således for denne klasse af agenter, indledende undersøgelser for at vurdere virkningerne af en TKI på leukæmi progression i xenograftmodeller ofte udnytte den minimale dosis, der kræves for at opnå fuldstændig og vedvarende hæmning af målet. Hvis ingen effekt på leukæmi progression eller overlevelse er overholdt, kan dosis øges, indtil der iagttages toksicitet. Disse modeller kan også bruges til at undersøge virkningerne af en TKI administreret i kombination med standard leukæmi behandlinger, og dermed informere udviklings efterfølgende kliniske protokoller.

Etableringen af ​​xenograftmodeller af akut leukæmi ved hjælp af luciferase-udtrykkende celler repræsenterer et stort fremskridt i forhold til mere traditionelle xenograftmodeller og har potentiale til betydeligt accelerereprocessen for lægemiddelforskning og-udvikling 11. Bioluminescens billedbehandling giver mulighed for ikke-invasiv langsgående bestemmelse af leukæmi byrde og dermed mindske antallet af dyr, der er nødvendige for undersøgelser, og kan også give oplysninger om den anatomiske placering af sygdom. Desuden, i et forsøg på at udvide potentielle kliniske anvendelser af TKI'er, bioluminescens billeddannelse kan reproducerbart opnås efter transplantation af primære humane luciferase-mærket patientprøver 12. Dog kan tolkning af bioluminescens billederne være udfordrende på grund af positionelle usikkerhed lysemitterende celler og dermed in vivo bioluminescens imaging kun bør anvendes som en semikvantitativ redskab til at følge det samme dyr under identiske betingelser 13.

I det heldige tilfælde, at flere forbindelser har betydelig og sammenlignelig aktivitet i analyserne her beskrevne supplerende kriterier, der kan anvendes til yderligere Ranking forbindelser omfatter relativt lette sammensatte syntese, opløselighed, graden af ​​oral biotilgængelighed, farmakokinetiske egenskaber og toksikologiske undersøgelser. Tilsammen skal disse data giver mulighed for at identificere en optimal forbindelse til progression til klinisk undersøgelse og er nødvendige for at støtte indlevering af en Investigational New Drug (IND) ansøgning til Food and Drug Administration (FDA) for at aktivere de kliniske studier. Efter at generere disse kritiske prækliniske data, der er nødvendige for avancement af disse nye stoffer ind på klinikken, bør udnyttelse af National Institute of Health Cancer Therapy Evaluation Program (CTEP) overvejes. I dette program kliniske forsøg er sponsoreret at evaluere nye anticancer-midler, med særlig vægt på translationel forskning. Der bør udvises omhu for at koordinere offentlig præsentation af præ-kliniske data, herunder beskrivelse af de strukturer og syntese af nye forbindelser, med indsendelse af patentansøgninger til beskyttelset intellektuelle ejendomsrettigheder. I almindelighed, data bør ikke være offentligt fremlagt indtil patentansøgninger beskytter sammensætning af stof og metoder til anvendelse, er blevet indgivet.

Sammenfattende har vi vist en effektiv strategi til at undersøge og vurdere potentialet af hidtil ukendte TKI'er som terapeutiske midler til behandling af akut leukæmi. Target inhibering i leukæmiceller, både i kultur og isoleres fra knoglemarven af ​​mus med humane leukæmi xenotransplantater, kan vurderes ved immunoblot. Den funktionelle betydning af målet hæmning kan evalueres ved hjælp af klonogene assays og ortotopisk murine xenograftmodeller med selvlysende billeddannelse. Tilsammen giver disse undersøgelser giver vigtige prækliniske data, der er nødvendige for avancement af disse nye translationelle agenter ind på klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

In vivo imaging blev udført ved hjælp af IVIS Shared Resource på University of Colorado Cancer Center (støttet af tilskud P30-CA046934). Flowcytometri blev udført på Flowcytometri Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (støttet af tilskud P30CA046934). Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health (RO1CA137078 til DKG). ABLS er en Fellow af Pediatric Scientist Development Program, støttet af tilskud fra American Academy of Pediatrics, American Pediatric Society, og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332 
2-Mercaptoethanol  Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410  
ColonyGel Human Base Medium  ReachBio #1101  
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341  
Difco Noble Agar  BD Biosciences #214883  
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302 
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796  
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542  
FITC CD45  BD Bioscience #347463  
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2  
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04  
Protease Inhibitors  Roche #11836153001  
DNase Sigma #D4263  
Protein G Beads Invitrogen #10-1242  
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60  
  Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA  
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm   Nunclon #D8429-1CS  
6-well plates BD Bioscience #353046  
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956  
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646  
GelCount automated colony counter Oxford Optronix  
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200  
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202  
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR  
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02  
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800  
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042  
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38  
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628  
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465  
Extra fine bonn scissors FST #14084-08  
Student fine scissors FST #91460-11  
Moria ultra fine forceps FST #11370-40  
Extra fine graefe forceps FST #11150-10  
Scalpel handle FST #10003-12  
Scalpel blades FST #10011-00  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
  2. Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
  3. Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
  4. Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
  5. Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
  6. Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
  7. Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
  8. Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
  9. Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
  10. Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
  11. Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
  12. Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
  13. Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics