Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences
Published 3/01/2014
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Behavior
 

Summary

Questo articolo presenta un protocollo di prova paura condizionata contestuale e cued utilizzando un sistema di video analisi per valutare paura apprendimento e memoria nei topi.

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Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. J. Vis. Exp. (85), e50871, doi:10.3791/50871 (2014).

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Abstract

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è uno dei test comportamentali che valuta la capacità dei topi di apprendere e ricordare un'associazione tra stimoli ambientali e le esperienze avverse. In questo test, i topi sono posti in una camera di condizionamento e sono dati ritagli di uno stimolo condizionato (un cue uditivo) e uno stimolo incondizionato aversivo (una scossa elettrica). Dopo un tempo di ritardo, i topi sono esposti alla stessa camera di condizionamento e una camera di forma diversa con presentazione del cue uditivo. Congelamento comportamento durante la prova viene misurata come indice di memoria paura. Per analizzare automaticamente il comportamento, abbiamo sviluppato un sistema di analisi video utilizzando il programma software applicativo ImageFZ, che è disponibile come download gratuito presso http://www.mouse-phenotype.org/. Qui, per mostrare i dettagli del nostro protocollo, dimostriamo la nostra procedura per la contestuale e cued paura di test condizionata nei topi C57BL/6J utilizzando il syst ImageFZem. Inoltre, abbiamo validato il protocollo e il sistema video analisi prestazioni confrontando tempo congelamento misurata dal sistema ImageFZ o un sistema di misurazione computer basato photobeam-con quello ottenuto da un osservatore umano. Come mostrato nei risultati rappresentativi, i dati ottenuti da ImageFZ erano simili a quelle analizzate da un osservatore umano, indicando che l'analisi comportamentale utilizzando il sistema ImageFZ è altamente affidabile. Il presente articolo film fornisce informazioni dettagliate in merito alle procedure di prova e promuoverà la comprensione della situazione sperimentale.

Introduction

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è il paradigma comportamentale utilizzato per valutare la paura associativo apprendimento e la memoria nei roditori 1-3. Questo test è stato ampiamente utilizzato per comprendere i meccanismi neurobiologici dell'apprendimento paura e la memoria in transgenici e topi knockout 1,4-16. Comportamento congelamento, che è definita come immobilità completa con l'eccezione di respirazione, è una risposta comune alle situazioni di paura. In questo paradigma comportamentale, dopo che gli animali sono esposti a un abbinamento di un cue uditiva con footshock elettrico, rispondono allo stimolo paura produzione mediante la visualizzazione di un comportamento di congelamento, che viene misurata come indice di apprendimento associativo paura e la memoria. Questo test richiede attrezzature meno elaborato, meno sforzo fisico dallo sperimentatore, e molto meno tempo di formazione per i topi di altri compiti di apprendimento e memoria, ma in genere richiede circa 5-10 min / giorno per il mouse per 2 giorni. Anche se la procedura di test è SImple e richiede poco tempo per eseguire, l'investigatore deve osservare attentamente e misurare il comportamento del mouse, quindi, diversi sistemi di misura automatici sono stati sviluppati per condurre l'analisi comportamentale 17-20. Il nostro sistema di video-analisi, che abbiamo sviluppato con il programma software ImageFZ, ci permette di analizzare agevolmente il comportamento di congelamento e produrre risultati altamente affidabili. Questo articolo fornisce informazioni dettagliate sulla nostra procedura di prova e descrive come utilizzare il programma software ImageFZ.

Protocol

Tutti gli esperimenti devono essere effettuati secondo la guida e protocolli stabiliti dai Comitati per la cura degli animali e l'uso locale.

1. Ambito Apparatus

  1. L'apparecchiatura per il condizionamento e il contesto di test è una camera quadrata con un pavimento griglia elettrificabile, una sorgente sonora, e un generatore di scossa calibrato. Vari formati da camera vengono utilizzati, con dimensioni che variano da 54 centimetri x 27 cm x 30 cm 21 a 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. In questo protocollo, l'apparato è costituito da una camera quadrata acrilica (33 centimetri x 25 centimetri x 28 centimetri, trasparente nelle pareti anteriori e posteriori, il bianco delle pareti laterali) con reti metalliche (0,2 cm di diametro, distanziati di 0,5 centimetri a parte) coperto da un coperchio acrilico trasparente (Figura 1A). È necessario posizionare la camera su un pavimento bianco acrilico (Figura 1B) per analizzare il comportamento di nero, agouti, o diluire topi marroni poiché un sistema di analisi di immagine con la Iprogramma mageFZ software (disponibile per il download gratuito, vedi Tabella di materiali / reagenti) distingue un soggetto scuro da uno sfondo bianco ogni immagine video catturato in. Topi albini possono essere testati utilizzando griglie di metallo nero e un pavimento nero acrilico (Figura 1B). Light-emitting diode (LED) si accende sono attaccati al soffitto sopra l'apparecchio. Il pavimento griglia è illuminato di 100 lux dalle luci a LED. Un altoparlante collegato ad un generatore di rumore / bianco tono (Figura 1C) è montato su un soffitto 5 cm sopra il coperchio di presentare un cue uditivo (un rumore bianco, 55 dB) come stimolo condizionato (CS). Le griglie sono collegati ad un generatore di shock (Figura 1C) per esprimere un footshock elettrica come stimolo incondizionato (US). La camera di prova è posto in una stanza insonorizzata (170 cm x 210 cm x 200 cm) (Figura 1D) per ridurre il rumore esterno durante le prove. Questa condizione impedisce anche i topi che non sono attualmente soggetti a unaprova di sentire uno spunto uditivo o la vocalizzazione dei topi di prova.
  2. Apparecchiatura per la prova cued è costituito da una camera che ha proprietà differenti dalla camera di condizionamento, fornendo un nuovo contesto. È indispensabile cambiare i suggerimenti sensoriali il più possibile in modo che il mouse percepisce contesto romanzo come estranei alla camera di condizionamento. Generalmente, viene utilizzata una scatola a forma differente o una camera triangolare. Inoltre, diversi spunti di illuminazione e / o olfattivi sono forniti anche al mouse. In questo protocollo, l'apparato è una camera triangolare acrilica (33 centimetri x 29 centimetri x 32 cm; bianche in ciascuna parete laterale) con un appartamento, pavimento bianco per il nero, agouti, o diluire i topi marroni o un appartamento, pavimento nero per albino topi, coperto con un coperchio acrilico trasparente (Figura 1E). Luci LED sono attaccati al soffitto sopra l'apparecchio. Il livello di illuminazione del pavimento è fissato a 30 lux. Un altoparlante è montato sul soffitto 5 cm sopra il coperchio per prESENT un cue uditivo che è lo stesso di quello previsto per i topi al momento del condizionamento. La camera triangolare si trova in una stanza insonorizzata diversa dalla camera in cui vengono eseguiti i condizionamenti e prova contesto.
  3. Ogni camera è dotata di una carica soffitto Coupled Device (CCD), fotocamera connessione a un computer Windows tramite quad splitter video e USB dispositivo di acquisizione immagini per monitorare il comportamento del mouse e le immagini dell'apparato e il mouse vengono catturati e analizzati dal software applicativo ImageFZ (vedi Protocollo 6). I generatori di rumore bianco e footshock sono controllati automaticamente dal programma software ImageFZ, l'ora di inizio e la durata del rumore bianco e footshock devono essere scritti in un file di testo (vedere un file di testo di esempio 'semplice cond' mostrato nel video per il dettagli su come i parametri vengono scritti nel file), che viene letto nell'applicazione.
  4. Prima di ogni prova inizia, le pareti in acrilicoe pavimenti sono puliti con un panno imbevuto di acqua super-ipocloroso (pH 6-7), e le griglie sono puliti con etanolo al 70% per evitare un pregiudizio basato su stimoli olfattivi. Le griglie sono puliti con etanolo al posto dell'acqua ipocloroso super per garantire che le griglie non diminuiscono la loro conducibilità elettrica a causa della ruggine.

2. Preparazione degli animali

  1. Generalmente, 2-4 topi sono alloggiati per gabbia in una stanza tenuta a temperatura controllata (23 ± 2 ° C) con 12 ore di luce / buio ciclo (ad esempio luci accese alle 07:00).
  2. In questo protocollo, per ridurre possibili influenze di trasporto gabbia su comportamento e adattare i topi all'ambiente sperimentale, le gabbie contenenti i topi sono trasferiti dalla camera di conservazione animale in una sala d'attesa insonorizzata adiacente ad una sala prove insonorizzata almeno 30 min Prima dell'inizio di ogni prova.
  3. Tutti gli esperimenti (Figura 2A) devono essere eseguiti durante gli speriodo ame alla luce o fase oscura ogni giorno per minimizzare le variazioni comportamentali prodotti da testare in tempi diversi 23,24. In questo protocollo, tutti gli esperimenti sono condotti tra 1 ora dopo l'inizio della fase di luce e 1 ora prima dell'inizio della fase di buio (8:00-18:00 in fase di luce). Se un solo apparato è disponibile, i topi di ciascun genotipo dovrebbero essere testati in un ordine controbilanciato da ridurre i potenziali effetti del tempo sperimentale e l'ordine di prova dei soggetti sulle prestazioni comportamentali. ImageFZ può controllare un massimo di 4 apparati. Test 4 topi contemporaneamente con 4 apparecchi in un ordine controbilanciato consente al ricercatore di risparmiare tempo e riduce i possibili effetti dei parametri sperimentali sul comportamento del mouse.

3. Condizionata

  1. I topi vengono inseriti nella camera di condizionamento, ed i topi sono tipicamente permesso di esplorare liberamente la camera per 120 sec. Successivamente, l'aucue ditory, come un rumore bianco, tono, e clicker uditivo, si presenta come un CS per 30 sec, e un mA footshock 0.1-0.8 è data ai topi come US dell'ultima 2 sec del suono. La presentazione del paring CS-USA si ripete per rafforzare l'associazione. I topi vengono lasciate nella camera per un periodo di tempo dopo l'ultima presentazione di stabilire ulteriormente l'associazione tra il contesto della camera e l'esperienza aversive. In questo protocollo, dopo 120 sec di esplorazione libera, un cue uditiva (rumore bianco, 55 dB) è presentato per 30 sec, e una footshock 0,3 mA generato continuamente durante l'ultimo 2 sec del rumore bianco. Dopo 90 secondi, l'accoppiamento della stecca uditivo con il footshock viene dato ai soggetti di nuovo. La presentazione di CS-US ripete tre volte per sessione (120, 240, e 360 secondi dopo l'inizio del condizionamento) (Figura 2B). Seguendo il footshock finale, i topi vengono lasciati indisturbati nelle camere per 90 sec.
  2. Prima dell'inizio della sessione di condizionamento, eseguire il programma di software applicativo ImageFZ, selezionare il menu plug-in 'FZ condizionata e FZ Online (4 camera)', e impostare i valori dei parametri step-by-step come segue.
    1. Fase 1: ID Project. Specificare una cartella in cui si desidera memorizzare i file di dati.
    2. Fase 2: Session Name. Digitare ogni parola, ad esempio, la data sperimentale, nella casella 'Session', e selezionare un file di testo di riferimento in cui l'ora di inizio e la durata del rumore bianco e footshock sono scritte, nella casella 'Riferimento'. Un file di testo di esempio viene mostrato nel video.
    3. Fase 3: impostazioni dei parametri. Immettere i valori dei parametri in ciascuna casella come segue.
      1. Rate (frame / sec): frame rate di acquisizione delle immagini, ad esempio, 1 frame / sec.
      2. Durata (sec): nel caso di condizionamento, la durata complessiva è di 480 sec.
      3. Durata Bin (sec): esempio 60 sec; i dati vengono analizzati in ciascun bloccodi 60 sec.
      4. Oggetto dimensioni - min (pixel): ImageFZ rileva un mouse e rumore come particelle nere (alcuni di massa di pixel) in uno sfondo bianco in ogni immagine. Quando l'area della particella nero (pixel) è inferiore alla 'dimensione Oggetto - min (pixel)' valore (ad esempio 100 pixel), le particelle vengono considerati rumore e sono esclusi dall'analisi immagine.
      5. Dimensione Oggetto - max (pixel): quando le dimensioni delle particelle nere sono più che la dimensione della 'dimensione Soggetto - max (pixel)' valore, le particelle sono esclusi dall'analisi.
      6. Dimensione Frame - larghezza / altezza (cm): dimensione della camera, cioè largo 33 centimetri e alto 25 cm.
      7. Congelamento criterio (pixel): ad esempio 30 pixel, per vedere i dettagli del protocollo 6.
      8. Durata congelamento - min (sec): ad esempio 2 secondi, quando viene rilevato alcun movimento del mouse per il solo meno di 2 secondi, il suo comportamento non viene conteggiato come 'congelamento';.
      9. Rate Shock (frame / sec): vedi i dettagli del protocollo 6.
    4. Fase 4: Oggetto ID. Inserire l'identificazione del soggetto.
    5. Fase 5: impostazioni della fotocamera. Controllare la luminosità e il contrasto dell'immagine acquisita.
    6. Fase 6: Impostazioni soglia. Regolare i valori di soglia per rilevare un topo nero come pixel neri in uno sfondo bianco in ogni immagine e di giudicare il comportamento del mouse come 'congelamento' o 'non-zero' (vedi i dettagli nel protocollo 6). Per analizzare un topo albino, spunta la casella 'modo invertito', e regolare i valori di soglia in modo appropriato.
    7. Passo 7: Insieme Cage Field. Specificare il campo di ogni camera che si desidera catturare. Dopo aver cliccato sul pulsante rettangolo nella casella degli strumenti, disegnare un rettangolo intorno al pavimento della camera sulla finestra immagine dal vivo. Quindi, selezionare il numero della camera e fare clic sul pulsante 'Set'. Infine, fare clic sul pulsante 'Completa'.
  3. <li> Dopo che le impostazioni dei parametri sono impostate, un test preparatorio deve essere somministrato usando topi pratica (topi non utilizzati come soggetti) prima della prima prova del giorno per determinare se il sistema di analisi dell'immagine in bianco e generatori di rumore / ammortizzatori funzionano senza problemi.
  4. Spostare una gabbia di casa contenente topi pratica per la sala prove insonorizzata dalla sala d'attesa adiacente, e porre ogni mouse nella camera di condizionamento. Subito dopo aver inserito i topi in camera, fare clic sul pulsante di avvio di ImageFZ. Il software applicativo presenterà segnali uditivi e / o footshocks elettriche per i topi nell'ordine specificato in un file di riferimento.
  5. Trascorso 480 sec, ritorno i topi alla loro gabbia a casa e tornare la gabbia al ripiano nella stanza nell'azienda.
  6. Pulire accuratamente le camere. Quindi, fare clic sul pulsante 'Avanti Analysis', e ripetere i passaggi 3.2.4-3.6 per i topi di prova.
  7. Negozi ImageFZ vivono e tracciano le immagini in formato TIFF. Il programma permettenoi di effettuare un'analisi offline per rianalizzare le immagini utilizzando i valori dei parametri modificati. Se si effettua una analisi offline, selezionare il menu plug-in 'Paura condizionata e FZ offline' e selezionare la cartella dei dati che si desidera analizzare nuovamente. Successivamente, immettere i valori dei parametri di nuovo, e fare clic sul pulsante 'Completa'.

4. Contesto di prova

  1. Dopo la sessione di condizionamento è stata completata, i topi vengono restituiti alla stessa camera di condizionamento e ha ottenuto per il congelamento comportamento per misurare la paura che contestualmente condizionato (test contesto). Un intervallo di ritardo tra il condizionamento e il test contesto è stato generalmente fissato a 24 ore. In questo protocollo, per valutare la memoria recente e memoria remota (misurato dal test 1 giorno e più di 28 giorni dopo il condizionamento, rispettivamente) 25, i topi vengono sottoposti alla prova di contesto circa 24 ore e 30 giorni dopo la sessione di condizionamento. I topi vengono inseriti nella conditioning camera e sono permesso di esplorare liberamente la camera per 300 sec senza CS e statunitensi presentazioni (Figura 2C).
  2. Eseguire il programma software ImageFZ e impostare i valori dei parametri del software applicativo nello stesso modo come nel condizionamento (vedere la sezione 3.2.3), tuttavia, modificare il tempo di durata della prova è di 300 sec e selezionare un file di testo di riferimento per la prova contesto . Dopo aver modificato l'impostazione, un test preparatorio deve essere somministrato usando topi pratica per controllare il sistema ImageFZ.
  3. Mettere ogni mouse nella camera di condizionamento e fare clic sul pulsante di avvio. Trascorso 300 sec, restituire i topi nella loro gabbia a casa, e lasciare la gabbia indisturbati fino all'inizio della prova cued.
  4. Pulire le camere. Quindi, fare clic sul pulsante 'Avanti Analysis', e ripetere i passaggi 4,3-4,4 nei topi di prova.

5. Prova cued

  1. Cued prova è condotta nello stesso giorno della prova contesto o il giorno successivo.In questo test, i topi sono posti in un'altra camera di prova con proprietà molto diverse, fornendo un nuovo contesto che non è correlato alla camera di condizionamento per 3 min. Alla fine del primo 3 min, la stecca uditivo che si presenta al momento del condizionamento è dato a topi per 3 min nell'ambiente contesto romanzo. In questo protocollo, prova cued viene effettuato poche ore dopo il test contesto. I topi sono autorizzati a visitare la camera di triangolare per 360 sec. Nel primo 3 min, né un CS, né degli Stati Uniti è presentato e, successivamente, una CS (un dB di rumore bianco 55) viene presentato per l'ultima 3 min.
  2. Eseguire il programma software ImageFZ e impostare i valori dei parametri nello stesso modo come nel condizionamento, tranne modificare il tempo di durata della prova a 360 sec e selezionare un file di testo di riferimento per la prova cued. Dopo aver regolato l'impostazione, un test preparatorio deve essere somministrato usando topi pratica per controllare il sistema ImageFZ.
  3. Mettere ogni topo nella camera triangolare e fare clic iniziopulsante. Trascorso 360 sec, ritorno i topi alla loro gabbia a casa e tornare la gabbia al ripiano della stanza dell'azienda.
  4. Pulire le camere. Quindi, fare clic sul pulsante 'Avanti Analysis' e ripetere i passaggi 5,3-5,4 nei topi di prova.
  5. Per testare ulteriormente la memoria remota, ripetere i protocolli 4-5 circa 30 giorni dopo la sessione di condizionamento (Figura 2A).

6. Image Analysis

  1. Eseguire l'acquisizione e analisi dei dati automaticamente utilizzando ImageFZ. Questo programma software applicativo è basato sul programma di pubblico dominio ImageJ (sviluppato da Wayne Rasband presso il National Institutes of Health e disponibile a http://rsb.info.nih.gov/ij/), modificato da Tsuyoshi Miyakawa (software applicativo ImageFZ , disponibile per il download gratuito, vedi Tabella di materiali / reagenti).
  2. Per tutti gli esperimenti, le immagini catturare in un determinato frame rate (ad esempio, 1 fps) con ImageFZ utilizzando un dispositivo di acquisizione video USB, tra cui unvideocamera. Per misurare la distanza percorsa dalle immagini consecutive, regolare il valore di soglia 'min' del programma (ad esempio 80 pixel), che è impostato per segmentare le immagini in una particella nero (un topo) e uno sfondo bianco. La distanza percorsa viene calcolata dalla distanza tra ogni serie di coordinate XY per il baricentro della particella nelle immagini consecutive.
  3. Per misurare il comportamento congelamento dalle immagini consecutive, regolare la 'soglia min (xor)' valore del programma (ad esempio 160 pixel), che è impostato per segmentare le immagini in una particella nero (mouse) e lo sfondo, e quindi calcolare la quantità di area (pixel) di regioni non sovrapposte tra particelle di ciascuna coppia di immagini consecutive. Regolare il valore con il cursore dello strumento soglia fino a quando la particella nero in ogni immagine corrisponde alla forma del corpo del mouse coda esclusa. Se l'area della nonoverlapping regione è inferiore al valore di 'criterio congelamento' (ad esempio 30 pixel), il comportamento è considerato 'congelamento' (Figura 3), che è generalmente definita come la completa assenza di qualsiasi movimento tranne per la respirazione e il battito cardiaco. Quando l'area supera questo valore, il comportamento è considerato 'non-congelamento' (Figura 3). La sentenza dovrebbe essere basata sulla definizione di congelamento. I topi a volte mostrano un movimento sottile e una immobilità momentanea, che non potrebbe essere considerato come un comportamento di congelamento che riflette la paura. L'immobilità che dura per un breve tempo (ad esempio meno di 2 sec), che è probabilmente differente dalla manifestazione di paura, può essere escluso dall'analisi impostando la soglia di tempo di congelamento. Per impostare la soglia di tempo, l'ingresso 'la durata di congelamento - min (sec)' valore (es. 2 sec).
  4. Il programma ImageFZ automaticamente calculAtes la distanza percorsa (cm) e la percentuale di congelamento. I risultati vengono salvati in file di testo, e vivono e tracciano immagini vengono memorizzate in un formato TIFF. Per misurare la distanza percorsa (cm) come indice di sensibilità footshock elettrica, il programma ImageFZ acquisisce anche le immagini ad un frame rate elevato (ad es 4 fps) per 6 secondi, misurato dal 2 secondi prima della consegna di un 2 sec footshock fino alle 2 secondi dopo footshock durante l'analisi online. Per impostare il frame rate per la cattura di immagini prima, durante e dopo footshock, immettere un valore nella 'rate Shock (frame / sec)' box. Dopo l'analisi in linea, eseguire analisi offline selezionando un menu plug-in 'FZ Shock linea' per ottenere i dati per la distanza percorsa.
  5. I valori dei parametri del programma ImageFZ dovrebbero essere ottimizzati per generare risultati simili a quelli ottenuti da osservatori umani in prove preparatorie. Per il punteggio manuale, il comportamento di congelamento viene continuamente misurata con un Stopwatch ed un programma di eventi per la registrazione o una procedura di time-campionamento istantaneo ogni 3-10 secondi, durante l'analisi utilizzando il software ImageFZ. Due osservatori in genere conducono l'osservazione comportamentale. Per regolare i valori dei parametri del programma ImageFZ al fine di garantire che i risultati delle analisi dell'immagine sono coerenti con quelli di osservatori umani, eseguire un'analisi in linea del programma ImageFZ, modificando la 'soglia di min (xor)' e valori "criterio congelamento ' . Per eseguire l'analisi offline, selezionare il menu plug-in 'FZ Offline' e inserire i valori dei parametri.

7. Risoluzione dei problemi

  1. Come può il programma ImageFZ essere ottenuto e installato?
    Il programma ImageFZ è disponibile per il download gratuito dal nostro sito (vedi Tabella di materiali / reagenti), e gira su un computer Windows. Scarica la cartella zip per ImageFZ e installare il software sul proprio computer. Vedere il file 'readme.txt' per l'INSTALLAZIONEsui dettagli e seguire le istruzioni passo-passo.
  2. Perché il messaggio di errore 'Errore durante l'impostazione dispositivo di cattura' visualizzato?
    Controllare il collegamento del cavo della telecamera e l'installazione del driver del dispositivo di cattura immagine USB. Se non vi è alcun problema con le impostazioni, quindi il software ImageFZ potrebbe non funzionare con la periferica di acquisizione immagini. Vedere il file 'readme.txt' concernente il dispositivo appropriato da utilizzare con il software ImageFZ.
  3. ImageFZ non può rilevare l'intero corpo del mouse come una particella.
    Impostare il valore della 'soglia min' e / o 'soglia min (XOR)' inferiore al valore corrente. Se ImageFZ non può rilevare il mouse in un luogo specifico, ad esempio l'angolo di una camera di prova, poi, potrebbero esistere condizioni di prova insufficienti, come ad esempio un pavimento illuminato uniformemente o una differenza leggermente contrasto tra il mouse e lo sfondo. Per risolvere questo problema, regolare i valori dei parametri (ad esempio
  4. Acquisizione di immagini ad un frame rate elevato rallenta il computer durante l'analisi online.
    Impostare il frame rate a un valore inferiore al tasso corrente, ed effettuare analisi online. L'analisi ImageFZ, attraverso l'acquisizione di immagini 1 fps, è sufficiente per misurare accuratamente il congelamento, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi.
  5. I risultati dell'analisi ImageFZ non concordano con quelli di competenza umana.
    Esaminare l'immagine memorizzata e file dei risultati di giudizio. Se ImageFZ sopravvaluta il congelamento, impostare il 'criterio di congelamento' a un valore inferiore al valore corrente, ed eseguire analisi offline. Se ImageFZ sottostima congelamento, impostare il 'criterio congelamento' a un valore superiore al valore corrente.
  6. In optogenetical e in vivo elettrofisiologica experiments, il cavo in fibra attaccato alla testa del mouse interferisce con la sentenza di congelamento.
    Coat i cavi in ​​bianco per un topo nero, e modificare la posizione e l'angolo della telecamera fino a quando i cavi non vengono rilevati.
  7. Che cosa è necessario per l'analisi offline?
    Creare una cartella denominata 'Image_FZ' nella directory principale del programma ImageFZ. In questa cartella, creare le sottocartelle 'Immagini' e 'Sessions'. Spostare un'immagine in scala di grigi 8 bit cartella "Immagini", e creare un file di testo in cui il nome del file immagine viene scritto nella cartella 'Sessions'. Successivamente, eseguire l'analisi offline ImageFZ, e seguire le istruzioni del programma.

Representative Results

Nel test di condizionamento alla paura, sperimentatori umani usati per quantificare il comportamento di congelamento attraverso l'osservazione diretta ad alta intensità di manodopera 26-29, ma i sistemi di misura di computer di recente photobeam-based (ad esempio il sistema di 'Fermo Monitor') e l'immagine-l'analisi sono stati utilizzati automaticamente misurare il comportamento di congelamento 26,30-32. ImageFZ è un sistema immagine-analisi automatizzata, che produce risultati paragonabili a quelli ottenuti attraverso l'osservazione umana, come descritto di seguito. Qui, abbiamo confrontato i risultati di osservazione umana con quelli dell'analisi ImageFZ sotto parametri diversi: 'Tasso (frame / sec)' e 'congelamento criterio (pixel).' In questo esperimento, cinque topi C57BL/6J maschi (peso corporeo medio ± SD (g), 31,4 ± 3,55; significano le dimensioni del corpo ± SD (pixel), 351,6 ± 62,2) sono stati utilizzati a 15-27 settimane di età. L'osservazione umana è stata effettuata utilizzando un programma evento di registrazione (un programma software Macintosh OS9); un evento premendo il tasto che continuanod per 2 secondi o più quando un topo visualizzato un attacco di nessun movimento è stato considerato 'congelamento'. La percentuale di congelamento è stato calcolato ogni 60 sec in ciascuna prova e utilizzata per analisi di correlazione. La percentuale di congelamento ha il 2 osservatori (affidabilità inter, per il condizionamento, r = 0,879; prova per contesto, r = 0,957; per prova cued, r = 0.866, per tutti i casi, r = 0,888) è stata in media per generare un umano segnare. Sono state esaminate le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati attraverso ImageFZ con ogni frame rate (cioè 1, 2, e 4 fps) e quelli ottenuti tramite osservazioni umane. Come illustrato nella figura 4, le percentuali di congelamento calcolati attraverso ImageFZ (1, 2, e 4 fps) erano altamente correlati con il valore medio ottenuto per le misure dei 2 osservatori. In particolare, l'acquisizione di immagini ad un frame rate più elevato non produce sempre la migliore correlazione. L'analisi delle immagini a 1 fps generato risultati simili a quelli ottenuti da osservatori umani in eprova ach. Sono state esaminate le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati attraverso osservazioni umane e utilizzando ImageFZ in ciascuna condizione delle «criterio di congelamento (pixel)» (vale a dire 20, 30, e 40 pixel). Le percentuali di congelamento calcolate utilizzando ImageFZ al 'criterio di congelamento (pixel) »del 20, 30 e 40 pixel sono stati, in tutti i casi, altamente correlati con quelli ottenuti tramite osservazioni umane (Figura 5). Come illustrato nella figura 5D, quando il criterio di congelamento è impostato su un valore basso, il movimento sottile di un mouse, considerarsi 'congelamento' di osservatori umani, sarebbe considerato 'non-congelamento' utilizzando ImageFZ. Viceversa, se il criterio è impostato su un valore alto, il movimento di un mouse, segnato come 'non-congelamento' di osservatori umani, sarebbero considerati 'congelamento' utilizzando ImageFZ (figure 5C, 5F, e 5I). Così, per ottenere i risultati più affidabili, ogni parametro del programma ImageFZ deve essere calibrato noizione dei dati ottenuti tramite osservazioni umani in ogni ambiente di test.

Inoltre, abbiamo confrontato i risultati generati da un osservatore umano, utilizzando un sistema basato photobeam misurazione computer (sistema Fermo Monitor), con quelli ottenuti usando ImageFZ (vedere Figura 6). L'osservatore umano è stato accecato al gruppo di trattamento ed i risultati di ImageFZ punteggio. Per le impostazioni dei parametri del sistema di Fermo Monitor, abbiamo utilizzato tre misure della percentuale di congelamento da un sistema convalidato in precedenza 30. Brevemente, il numero di intervalli di 10 secondi in cui gli animali richiede più di 1 o 2 secondi per attraversare il primo nuovo fascio dell'intervallo (10sec e 1sec 2sec 10sec, rispettivamente) e la latenza tra l'inizio di ogni intervallo di 5 sec e la terza nuova interruzione del fascio all'interno di questo intervallo (Latency3) sono stati misurati. Le percentuali degli intervalli in cui il mouse è stato il congelamento o la percentuale della quantità totale di tempo r, facoltativo per rompere il terzo photobeam sono stati calcolati.

Le percentuali di congelamento misurati in ciascun sistema sono illustrati nella Figura 6. I gruppi sono stati confrontati utilizzando due vie misure ripetute ANOVA seguita da t-test (vedere Tabella 1). Le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ (Figura 6B) erano più simili a quelli ottenuto attraverso l'osservazione umana (Figura 6A) rispetto ai dati ottenuti utilizzando un sistema basato photobeam-(Figure 6C-E). Le percentuali di congelamento misurati utilizzando il programma ImageFZ in ciascuna prova sono stati altamente correlati con quelli ottenuto attraverso l'osservazione umana (condizionata, r = 0,947; prova contesto, r = 0.970; cued prova, r = 0,934), mentre le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurata utilizzando il sistema di misurazione computer basato photobeam-(1 sec 10sec, 2 sec 10sec, o Latency3) e l'osservatore umano sono stati inferiori (condizionata, r = 0,503, 0,593 e 0,761; contesto test, r = 0,772, 0,819 e 0,912) rispetto alle correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ e l'osservazione umana (Figure 7A e 7B). Inoltre, la Figura 7 mostra che le differenze tra le percentuali di congelamento ottenuti attraverso l'osservazione umana e utilizzando ImageFZ in ciascun topo sono le più piccole differenze. Questi risultati indicano che le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ erano simili a quelli ottenuti attraverso l'osservazione umana e che ImageFZ è estremamente preciso quando si misura la quantità di congelamento.

Figura 1
Figura 1. Apparecchi per la contestuale e attivati ​​i test di paura condizionata. (A) L'acrilico camera quadrata per il condizionamento e il contesto di prova, ( (C), un generatore di rumore / tono bianco e un generatore di shock, (D) una stanza insonorizzata, e (E) una camera triangolare acrilica con un pavimento piatto per la prova cued. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Rappresentazione schematica del protocollo. (A) Presentazione del contestuale e accodato paura di test condizionata, (B) condizionata, (C) cprova ONTESTO, e (D) cued test. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Analisi di immagine dal programma software ImageFZ. Per ogni coppia di immagini successive, la quantità di area (pixel) attraverso cui il mouse mosso è calcolato ImageFZ. Quando questa zona è al di sotto di una certa soglia (ad esempio 30 pixel), il comportamento è giudicato essere 'congelamento'. Quando la quantità di superficie pari o superiore alla soglia, il comportamento è considerato 'non-zero'. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Il confronto tra le percentuali di congelamento calcolate da immagini a differenti frame rate utilizzando ImageFZ con quelli misurati attraverso l'osservazione umana. Gli condizionata prove paura sono stati condotti utilizzando topi C57BL/6J maschi (n = 5). Durante le prove, due osservatori ha segnato il comportamento di congelamento. Contemporaneamente, le immagini in diretta sono state catturate a 4 fps utilizzando il programma ImageFZ. I file acquisiti a 4 fps sono stati ridimensionati dopo l'estrazione i fotogrammi corrispondere alle immagini catturate a 1 fps o 2 fps. I valori dei parametri di 'Rate (frame / sec)' sono stati fissati per 1, 2 o 4 fps, e le percentuali di congelamento in ogni 60 sec bin sono stati calcolati da file di immagine utilizzando ImageFZ analisi offline. Ogni punto rappresenta una percentuale congelamento di ogni 60 sec-bin. Coefficienti di correlazione di Pearson tra i dati ottenuti dall'osservazione umane e analisi ImageFZ sono stati calcolati.Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5
Figura 5. Le percentuali di congelamento calcolate dalle immagini a differenti valori criterio congelamento utilizzando ImageFZ e quelli misurati attraverso osservazioni umani sono stati confrontati. Condizionamento prove paura sono stati condotti utilizzando topi C57BL/6J maschi (n = 5). Durante le prove, due osservatori hanno registrato il comportamento di congelamento, e le immagini in diretta sono state catturate utilizzando il programma ImageFZ. Le percentuali di congelamento di ogni 60 sec bin sono stati calcolati dalle immagini (1 frame / sec) attraverso ImageFZ analisi offline, impostando i valori dei parametri di "criterio di congelamento (pixel) 'a 20, 30 o 40 pixel. Ogni punto rappresenta una percentuale congelamento di ogni 60 sec-bin. Correlazione co di Pearsoncoefficienti tra i dati ottenuti dall'osservazione dell'uomo e l'analisi ImageFZ sono stati calcolati in ciascuna prova. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 6
Figura 6. Le percentuali di congelamento sono stati misurati utilizzando sistemi automatizzati e di osservazione umana in gruppi incondizionati e condizionati di topi maschi C57BL/6J (n = 5, ogni gruppo). (A) l'osservazione umana, (B) ImageFZ, (C) Congelare sistema Monitor 1 (1 sec 10sec), (D) Congelare sistema Monitor 2 (2 sec 10sec) e (E) Congelare sistema Monitor 3 (Latency3). Confronti del Gruppo sono stati effettuati utilizzando due vie misure ripetute ANOVA seguita da t-test (unconditioned vs condizionata gruppo di gruppo, *, p <0.05; †, p <0.01). I dati ottenuti utilizzando ImageFZ erano simili a quelli ottenuto attraverso l'osservazione umana. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 7
Figura 7. Sono mostrati Correlazione e distribuzione di frequenza delle differenze tra le percentuali di congelamento, misurate utilizzando sistemi automatizzati e l'osservazione umana. (AB) diagrammi a dispersione e coefficienti di correlazione di Pearson tra le percentuali di congelamento ottenuti attraverso sistemi automatizzati e l'osservazione umana. Le percentuali di congelamento, calcolati utilizzando ImageFZ, erano altamente correlati con quelli ottenuti attraverso l'osservazione umana. (CF) occorrenze di meno di un dif 10%ferenza tra le percentuali di congelamento ottenuti da sistemi automatizzati vs osservazione umana fosse più alto quando i dati analizzati utilizzando ImageFZ sono stati confrontati con quelli analizzati attraverso l'osservazione umana. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

ANOVA
Condizione Tempo Condizione x Tempo
Giorno 1 (condizionata)
Umano F (1,8) = 28.53, p = 0,0007 F (7,56) = 20,79, p <0,0001 F (7,56) = 16.58, p <0,0001
ImageFZ F (1,8) = 13.97, p = 0,0057 F (7,56) = 21,40, p <0,0001 F (7,56) = 11,69, p <0,0001
Fermo Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 5.16, p = 0,0528 F (7,56) = 2.39, p = 0,0329 F (7,56) = 0,72, p = 0,6572
Fermo Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 4.07, p = 0,0782 F (7,56) = 3.44, p = 0,0039 F (7,56) = 1.52, p = 0,1803
Fermo Monitor (Latency3) F (1,8) = 4.44, p = 0,0682 F (7,56) = 9.94, p <0,0001 F (7,56) = 4.33, p = 0,0007
Day 2 (contesto)
Umano F (1,8) = 42.94, p = 0,0002 F (4,32) = 1.91, p = 0,1336 F (4,32) = 1.48, p = 0,2302
ImageFZ F (1,8) = 49.61, p = 0,0001 F (4,32) = 2.06, p = 0,1087 F (4,32) = 0.83, p = 0,5174
Fermo Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 20.28, p = 0,002 F (4,32) = 1.63, p = 0,1918 F (4,32) = 0.55, p = 0,6997
Fermo Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 40.20, p = 0,0002 F (4,32) = 2.66, p = 0,0504 F (4,32) = 1.20, p = 0,3306
Fermo Monitor (Latency3) F (1,8) = 35.30, p = 0,0003 F (4,32) = 2.49, p = 0,0626 F (4,32) = 1.09, p = 0,3793

Tabella 1. Confronti delle statistiche.

Discussion

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è uno dei paradigmi più utilizzati per valutare l'apprendimento e la memoria. Questo test è una forma di condizionamento pavloviano in cui viene effettuata un'associazione tra un contesto e / o uno stimolo condizionato (cue uditivo) e uno stimolo avversivo (footshock elettrico). Dopo anche un solo accoppiamento del contesto / cue uditivo e footshock, i topi mostrano il congelamento di lunga durata di fronte sia con il contesto o la stecca. In questo test, il comportamento di congelamento è utilizzato come un indice di memoria paura. Studi farmacologici e lesioni hanno rivelato che la formazione della memoria, consolidamento e recupero sono regolati da diverse regioni del cervello, come l'amigdala, ippocampo e corteccia prefrontale 3,33-35. Inoltre, studi di genetica molecolare hanno dimostrato il ruolo dei geni e delle molecole coinvolte nell'apprendimento e nella memoria in queste regioni del cervello utilizzando topi geneticamente ingegnerizzati 36 specifici. Pertanto, questo test è simple ed utili per esplorare la base neurobiologica sottostante apprendimento paura e la memoria. In questo articolo film, abbiamo introdotto il nostro protocollo di fornire sperimentatori con informazioni dettagliate per comprendere e facilmente eseguire il test.

Comportamento di congelamento è stata quantificata attraverso l'osservazione diretta da parte sperimentatori umani. Un sperimentatore ben addestrato si prevede di produrre risultati stabili affidabili in tutta osservazioni. Tuttavia, questo metodo comporta potenziali problemi, quali differenze nel metodo osservativo, pregiudizi osservatori, e di semplici errori di quantificazione, il che rende difficile confrontare direttamente i risultati di sperimentatori indipendenti e diversi laboratori. Un sistema automatizzato di misura computer basato photobeam-è stato anche utilizzato 26,30-32. Tuttavia, questo sistema presenta anche potenziali problemi nel misurare i comportamenti di congelamento. A causa della disposizione sensoriale, questo sistema potrebbe essere in grado di rilevare piccoli movimenti della testa che typically essere catalogato come 'attivo' attraverso l'osservazione umana. Inoltre, tremore durante il congelamento può essere considerato come nonfreezing perché quando un animale si blocca, interruzioni intermittenti del photobeam si osservano in conseguenza di tremore. Come metodo alternativo, automatizzati di immagini e video-analisi dei sistemi sono stati sviluppati 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 descritte alcuni sistemi con programmi software di analisi delle immagini che hanno una buona validità e ottengono il congelamento ben 17,20,37-38. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi e programmi di analisi devono essere ottenuti da fornitori commerciali e sono in genere costosi. Abbiamo sviluppato il software ImageFZ per l'analisi del comportamento di congelamento, e questo programma è distribuito come un programma di software libero. ImageFZ rileva il mouse come un corpo di pixel (una particella) e discrimina sottile movimento del mouse come 'congelamento' o 'incongelabile' a seconda della quantità diarea di regioni non sovrapposte tra particelle di ciascuna coppia di immagini consecutive. Come mostrato nei risultati rappresentativi, misurazioni utilizzando il programma ImageFZ siano coerenti ovvero più preciso di quelli ottenuti con altri metodi. Così, il programma ImageFZ misura automaticamente il comportamento osservatori umani giudicano congelamento utilizzando criteri definiti. Inoltre, il programma ImageFZ calcola la distanza percorsa (cm) prima, durante e dopo l'esposizione footshock, facilitando una valutazione della sensibilità shock e analisi del comportamento congelamento.

Esistono differenze metodologiche tra laboratori. Queste differenze possono causare difficoltà nel confrontare i dati tra i laboratori e di replicare i risultati in laboratori diversi. Per ottenere dati più stabili e comparabili, è necessario standardizzare il protocollo di prova più possibile. Il sistema di analisi con ImageFZ porta alla automazione delle procedure di prova, che può contribuire allala standardizzazione dei protocolli utilizzati in tutta laboratori.

Diverse risposte comportamentali devono essere considerati quando si analizza il comportamento di congelamento. In primo luogo, quando gli animali di fronte a una situazione spaventosa, possono fuggire, invece di congelamento 39. Fuga è una delle risposte di paura, e la sua presenza porterà a sottovalutare la memoria della paura. In secondo luogo, il congelamento può dipendere da un livello di attività generale, e il livello di attività in topi trattati e di controllo deve essere esaminato. Ad esempio, sebbene i topi privi del recettore dell'acetilcolina muscarinici M1 hanno mostrato livelli ridotti di congelamento rispetto ai topi wild-type, diversi test comportamentali hanno indicato che i risultati possono essere attribuiti a loro fenotipo iperattività invece del loro deterioramento della memoria 18. ImageFZ calcola la distanza (cm) percorsa dai soggetti. Sono a disposizione per esaminare se esistono differenze nei livelli di attività generali tra i soggetti ai quali i dati. Se vi è una differenza in gruppola distanza percorsa, un possibile approccio al problema è quella di considerare la distanza percorsa durante la prima 2 min di formazione come l'attività basale e utilizzare un rapporto di soppressione (rapporto di soppressione = (attività durante le prove) / (attività durante basale + attività durante testing)) come un indice secondario di paura 17,40. Infine, una differenza di sensibilità al dolore, inducendo i cambiamenti nella reattività a una scossa elettrica, se presente, può causare variazioni nel comportamento congelamento. ImageFZ calcola anche la distanza percorsa (cm) in dettaglio da 2 sec prima un'esposizione di 2 sec footshock per 2 secondi dopo l'esposizione (per 6 sec), che può essere utilizzato come indice di sensibilità footshock.

Sistemi di video-analisi dei sono stati sviluppati per misurare il comportamento congelamento dei albino, nero, agouti, e diluire i topi marroni. ImageFZ utilizza un vassoio pavimento nero e griglie nere di esaminare topi bianchi (vedere Figura 1B). Le griglie nere sono fatte di speci alleato metalli trattati con vernice nera patinata e avere una conducibilità elettrica simile a quella delle reti metalliche noncoated, che sono tipicamente utilizzati per topi neri. ImageFZ analizza anche il comportamento di congelamento in ratti e altri roditori attraverso aggiustamenti dei parametri del programma. Nella versione corrente di ImageFZ, il comportamento del soggetto è registrato con una videocamera dalla parete superiore analizzare congelamento. ImageFZ potrebbe essere utilizzato anche in un set-up in cui le immagini vengono catturate dal lato della camera. Inoltre, il ImageFZ controlla un massimo di 4 apparati. Questa caratteristica consente al ricercatore di esaminare contemporaneamente 4 topi, risparmiando tempo e riducendo le potenziali influenze differenze nel tempo di esecuzione di ciascun soggetto e l'ordine di prova sul comportamento. Così, ImageFZ semplifica la procedura di test e analisi del comportamento di congelamento, e questo programma facilita test con meno lavoro e senza alcuna formazione per gli esperimenti comportamentali.

e_content "> In laboratorio Miyakawa, abbiamo valutato più di 110 ceppi di topi geneticamente ingegnerizzati e topi di controllo di tipo selvatico nel timore prova condizionata contestuale e cued utilizzando il sistema di video analisi per chiarire gli effetti di un dato gene di apprendimento e memoria 41-42 Abbiamo ottenuto un grande insieme di dati grezzi per più di 5.000 topi I dati grezzi che è stato utilizzato per gli articoli di ricerca pubblicati 4-16 sono incluse nella 'Mouse fenotipo Database' come un database pubblico (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Il presente articolo film fornisce informazioni dettagliate per quanto riguarda i dettagli della nostra procedura sperimentale e promuove la comprensione della situazione testing.

Disclosures

Confermiamo che non ci siano conflitti noti di interesse associati a questa pubblicazione e non vi è stato alcun significativo supporto finanziario per questo lavoro che potrebbero aver influenzato l'esito.

Acknowledgements

Alcuni dei dati qui riportati sono stati ottenuti nel laboratorio del Dr. Jacqueline N. Crawley nella US National Institute of Mental Health e vorremmo ringraziarla per averci permesso di mostrare i dati della carta. Ringraziamo anche Kazuo Nakanishi per il suo aiuto nello sviluppo del programma ImageFZ per l'analisi comportamentale. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant-in-Aid per la Ricerca Scientifica (B) (21.300.121), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica in settori innovativi (Comprehensive Brain Science Network), dal Ministero della Pubblica Istruzione, Scienza, Sport e Cultura del Giappone , concedere da Neuroinformatica Japan Center (NIJC), e le sovvenzioni da CREST del Giappone Scienza e della Tecnologia Agency (JST).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageFZ program Developed by Tsuyoshi Miyakawa This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. 
Conditioning chamber O’Hara & Co., Japan CL-3002L For mouse.
Cued test chamber O’Hara & Co., Japan CLT-3002L For mouse.
Interface O’Hara & Co., Japan CL-1040 The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator O’Hara & Co., Japan SGA-2040 The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter) O’Hara & Co., Japan SG-T
USB video capture device XLR8 USB2IVOSX
Quad image splitter Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan 400AS
Soundproof room O’Hara & Co., Japan CL-4210
Freeze Monitor San Diego Instruments, Inc., CA, USA 16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)

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Comments

2 Comments

  1. Thanks for the article.
    I installed the FZ program for offline analysis but it does not seem to work. I wonder what format of images does the program recognize. Can it analyse a .WMV file or do I have to create a sequence of 8bit images from the .WMV for the program to recognize?
    Varda Lev-Ram

    Reply
    Posted by: Varda L.
    March 10, 2014 - 7:38 PM
  2. Thanks for your comment.
    ImageFZ can not analyze a WMV file but a sequence of 8-bit grayscale images (a multi TIFF). If you want to use the WMV file, you will have to convert it to an uncompressed AVI file (no audio) to import into ImageJ(FZ) and to change to 8-bit grayscale images. The 8-bit images should be "8 (inverting grayscale LUT)" (check the file infomation, Image > Show Info...). If not, select Image > Lookup Tables > Invert LUT, and click Edit > Invert. Finally, add a background image with no mouse to the last images, and save it as a multi TIFF.

    Reply
    Posted by: Hirotaka S.
    March 11, 2014 - 6:58 AM

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