A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

Chemistry
 

Summary

Este vídeo é ilustrar um método rápido, eficiente para metacrilato de poli (etileno-glicol), permitindo que as polimerizações de cadeia e síntese de hidrogel. Ele vai demonstrar como a introdução de funcionalidades semelhante metacrilamida em peptídeos, detalhe métodos analíticos comuns para avaliar a eficiência de funcionalização, fornecer sugestões para a solução de problemas e modificações avançadas, e demonstrar técnicas típicas de caracterização hidrogel.

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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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Abstract

Uma das principais vantagens de se utilizar poli (etileno glicol) (PEG) macrômeros na formação de hidrogel é a versatilidade sintética. A capacidade de desenhar a partir de uma grande variedade de pesos moleculares de PEG e configurações (número braço, comprimento do braço, e padrão de ramificação) proporciona pesquisadores controlo apertado sobre resultando estruturas de hidrogel e propriedades, incluindo o módulo de Young eo tamanho da malha. Este vídeo vai ilustrar um método rápido, eficiente, livre de solventes, assistida por microondas para metacrilato precursores PEG em poli (etileno glicol) dimetacrilato (PEGDM). Este método sintético fornece matérias-primas tão necessárias para aplicações na entrega da droga e da medicina regenerativa. O método demonstrado é superior aos métodos methacrylation tradicionais, uma vez que é significativamente mais rápida e mais simples, bem como mais económico e amigo do ambiente, usando menores quantidades de reagentes e solventes. Nós também irá demonstrar uma adaptação desta técnica para methacr on-resinafuncionalização ilamida de péptidos. Este método de resina permite que o N-terminal de péptidos a ser funcionalizado com grupos de metacrilamida antes da desprotecção e clivagem a partir da resina. Isto permite a adição selectiva de grupos metacrilamida para o terminal N dos péptidos, enquanto os aminoácidos com grupos reactivos secundários (por exemplo, amina primária de lisina, o álcool primário de serina, álcoois secundários da treonina e da tirosina) fenol permanecem protegidos, evitando funcionalização em múltiplos locais. Esse artigo vai detalhe métodos analíticos comuns (protões de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (H-NMR) e Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Tempo de Voo espectrometria de massa (MALDI-TOF)) para avaliar a eficiência das funcionalizações. Armadilhas comuns e sugere métodos de resolução de problemas serão abordados, como modificações da técnica que pode ser usada para mais funcionalidade sintonia macrômero e resultando hidrogel física e químicapropriedades. O uso de produtos sintetizados para a formação de hidrogéis para a entrega da droga e os estudos de interação de células material será demonstrado, com especial atenção para modificar a composição de hidrogel para afetar tamanho de malha, controlando rigidez hidrogel e liberação da droga.

Introduction

Poli (etileno glicol) (PEG) hidrogéis são biomateriais comuns usados ​​na medicina regenerativa e de distribuição de drogas aplicações 1-3. Estes hidrogéis oferecem vantagens significativas sobre outros biomateriais. Hidrogéis PEG são sintéticos, oferecendo um alto grau de controle sobre as propriedades de engenharia, tais como módulo de elasticidade e velocidade de degradação em comparação com os seus homólogos de biomateriais naturais 1. Como eles são derivados sinteticamente, o PEG tem significativamente menos variabilidade de lote para lote, em relação materiais naturais derivados 4. Devido à composição química do PEG, estes hidrogéis são altamente hidrofílico, resistente à adsorção das proteínas, e biocompatível 3. Esta resistência à adsorção de proteínas permite hidrogéis PEG a agir como um "lousa em branco", permitindo aos investigadores para interrogar e estudar fatores biológicos ou químicos específicos (fármacos, biomoléculas, peptídeos de adesão celular, etc) e os papéis específicos estes factors jogar no controlo de células e / ou o comportamento de tecidos.

Figura 1
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Figura 1: Exemplos de poli (etileno glicol) (PEG) arquitecturas A) linear PEG B) 4-braço de PEG com um núcleo de pentaeritritol C) de 8 braços de PEG com um núcleo de hexaglicerol D) 8-PEG com um braço.... tripentaeritritol núcleo. n é o número de PEG repete em cada braço. Cada repetição tem um peso molecular de 44 g / mol, por conseguinte, n pode ser calculado a partir do peso molecular total e a estrutura de braço / #.

Precursores de PEG estão disponíveis com uma variedade de arquitecturas e pesos moleculares (Figura 1 ). Variando a arquitectura (braço #) e repetições de etileno glicol (n) de PEG pode ser utilizado para controlar as propriedades de redes de hidrogel formadas a partir destes macrómeros. Unmodified PEG contém grupos hidroxila terminais que devem ser substituídos com uma funcionalidade alternativa para facilitar a reticulação covalente via polimerização, a estratégia de reticulação mais comumente empregado para hidrogéis PEG, antes da formação de redes de hidrogel. Há uma variedade de grupos químicos que podem ser incorporados em macrómeros de PEG para facilitar a polimerização e reticulação da rede (acrilato, metacrilato, vinil éter, norborneno, etc.) Apesar da variedade de funcionalidades terminais disponíveis para facilitar a reticulação, só há dois mecanismos pelos quais a polimerização pode ocorrer: passo-e-cadeia de crescimento (ou uma mistura dos dois, de modo misto).

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Figura 2:. Teórica. Hidrogel esquemática rede A) tradicional cadeia de crescimento de polimerização resulta em redes heterogêneas, contendo poli densa (metacrilato) regiões e aumento nonidealities rede, como loops, precursores que não reagiram, e embaraços permanentes reticulação B) Passo de crescimento de polimerização resulta em estruturas de rede significativamente mais homogêneos (sem escala).

As funcionalidades que reticulam por meio de polimerização em cadeia para o crescimento não exigem a presença de um agente de reticulação adicional. No entanto, os hidrogéis polimerizado de cadeia produzir estruturas de redes heterogéneas que contenham regiões densas de reticulação (Figura 2A) 1. Em contraste, o crescimento passo-polimerização requires a utilização de um agente de reticulação ou o co-monómero que é reactivo com os grupos funcionais terminais dos macrómeros de PEG. Como os grupos funcionais terminais do PEG só ​​podem reagir com o agente de reticulação e o agente de reticulação só pode reagir com os grupos funcionais terminais do PEG, o que resulta em uma maior homogeneidade estrutura da rede (Figura 2B) 1. Passo polimerizações de crescimento também normalmente levar a uma maior conversão de grupos funcionais, diminuindo a quantidade de precursores que não reagiram e potencial para respostas imunitárias / inflamatórias devidas a macrómeros solúveis, não incorporados 1. Os métodos de polimerização de modo misto têm também sido desenvolvidos para combinar os dois polimerização passo-e-cadeia de crescimento por meio do uso de macrómeros que ambos podem auto-reagir (cadeia-crescimento) e reagem com um agente de ligação cruzada (passo de crescimento). Isto produz os hidrogéis com as características de cada um dos mecanismos de polimerização, e pode ser usado para produzir, diversas estruturas de rede mais complexa do que querpasso ou só 1 redes de cadeia de crescimento.

Embora haja um grande número de grupos funcionais que podem ser utilizados para funcionalizar PEG e facilitar a formação de hidrogel, metacrilatos e norbornenos são algumas das porções de polimerização em cadeia e a etapa de crescimento mais comuns, respectivamente. Ambas as funcionalidades oferecer excelente controle espaço-temporal sobre a polimerização da rede, e, quando utilizado para encapsular células, estas redes de apoio de alta capacidade de sobrevivência das células em geral 5-7. Dimetacrilato de PEG funcionalizado (PEGDM) de ligações cruzadas através de polimerização em cadeia e permite a incorporação de biomoléculas ou de outros factores por meio de co-polimerização com acrilato, metacrilato de biomoléculas-, ou similar-funcionalizados 5,6. PEGDM hidrogéis têm vantagens significativas sobre os sistemas de polimerização em cadeia de crescimento alternativos, tais como o acrilato funcionalizado PEG (PEGDA). Utilizando métodos tradicionais, PEGDA pode ser sintetizado mais rapidamente do que PEGDM; hoWever, usando a síntese assistida por micro-ondas, a síntese PEGDM é ainda mais eficiente. PEGDA é frequentemente sintetizado em 8 ou durante a noite de 24 horas 9 reacções, mas também pode ser sintetizado em quatro horas a temperaturas elevadas 10. PEGDM também é sintetizado por reacção durante a noite, tradicionalmente, 11 ou 24 horas para 5, com alguns métodos que se prolonga o tempo de reacção 4 dias a 12. Usando o método do forno de microondas aqui demonstrado, PEGDM pode ser produzido em uma reacção de 5 min. Enquanto PEGDM tem cinética de reacção mais lenta do que PEGDA 13, a reacção de reticulação para PEGDM ainda é rápida, ocorrendo em minutos, e alcança uma maior conversão do que o macrómero PEGDA como o aumento da hidrofobicidade do grupo metacrilato aumentam a agregação de grupo funcional na solução, aumentando assim a probabilidade de transferência radical e conversão de metacrilato de 14. Hidrogéis PEGDM também estão associadas com o aumento da viabilidade celular e o crescimento comoem comparação com os hidrogéis PEGDA, provavelmente devido às diminuições na taxa de reação em qualquer momento dado, o que reduz a concentração de radicais e macrômeros não reagiram presentes 14. Polimerizações tiol-eno, tais como aqueles utilizando-norborneno funcionalizado PEG (PEGN) formam hidrogeles através da fase de polimerização para o crescimento, e requerem o uso de PEGN e um agente de reticulação que contêm uma média de mais do que dois grupos funcionais. Desde thiyl radicais reagem com títulos de norborneno carbono-carbono duplas, multi-tiol contendo agentes de reticulação são comumente usados ​​para reticular hidrogéis PEGN, permitindo a incorporação fácil de peptídeos com aminoácidos cisteína funcionalidades 7. Embora existam inúmeras outras químicas que reagem via polimerização passo de crescimento (Michael reações de adição, como tiol-acrilato 15 e sulfona tiol-vinil 16 ", clique em" reações como alcino-azida 17 etc), hidrogéis tiol-norbornene são muito comum, já que a tensão deo anel norbornene aumenta significativamente a velocidade de reação e diminui a chance de o norbornene polimerização em cadeia dupla ligação submetidos a 7.

A decisão entre o metacrilato, norbornene ou funcionalização alternativa para facilitar a formação de hidrogel é em grande parte baseada na abordagem. Por exemplo, a cadeia de crescimento redes polimerizado PEGDM foram demonstradas também adequado para controlar a localização de células no desenvolvimento de engenharia de tecidos, periósteo 18,19. Passo-crescimento polimerizado redes de PEG são mais adequados para a incorporação de sequências de péptido para facilitar a degradação do hidrogel enzimaticamente sensível, devido à facilidade de incorporação de sequências de substrato da enzima, utilizando tiol (cisteína) contendo peptídeos e norborneno macrómeros funcionalizados 20. Se a pergunta de pesquisa será melhor abordada pela utilização de hidrogéis passo de crescimento, Fairbanks et ai. Fornece uma descrição detalhada do norborestratégia funcionalização nene para PEG 7. Este detalhe papel vontade como PEG e sequências de peptídeos pode ser funcionalizada (com um metacrilato de PEG e um metacrilamida para peptídeos) para reações de polimerização em cadeia.

Tradicionalmente, PEGDM é produzido por reacção de PEG com cloreto de metacriloílo e trietilamina em diclorometano. A reacção é deixada progredir à temperatura ambiente durante a noite de 11 ou 24 horas para 5, com alguns métodos que se prolongam o tempo de reacção 4 dias 12 antes da filtração, precipitação em éter dietílico, e recolha. Embora existam muitas variações desta abordagem, todos são demorados, requerem uma grande variedade de equipamento de síntese química, e não são amigos do ambiente, uma vez que envolvem a utilização de quantidades relativamente grandes de reagentes de alta pureza e de solvente. Para contornar essas limitações, Lin-Gibson et al. Desenvolveram um método livre de solvente assistida por microondas para funcionalizar PEG com te grupos metacrilato rminal (Figura 3A) 12. Nesta reacção, os grupos terminais do PEG álcool reage com um dos átomos do carbonilo do anidrido metacrílico para formar um grupo carboxilo. Isto gera o produto PEGDM, com o ácido metacrílico como um produto secundário. Esta síntese tem muitas das vantagens característicos da síntese de micro-ondas, incluindo a redução do tempo de reacção e os métodos de síntese sem solventes, 21. A síntese de microondas é preferível que os métodos anteriormente discutidos, uma vez que é significativamente mais rápido, requer menos equipamento de grande síntese (por exemplo, material de vidro, placas de reacção), e utiliza menos reagente geral e quantidades de solventes como solventes são necessários apenas para a purificação do produto / recolha e não para síntese, tornando-o mais econômico e ambientalmente amigável.

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Figura 3:. Esquemas funcionalização A) Poli (etileno-glicol) é feito reagir com anidrido metacrílico 10x excesso molar para produzir poli (etileno glicol) metacrilato B) O mesmo método pode ser usado para funcionalizar o N-terminal de sequências de péptidos, formando um. metacrilamida peptídeo funcionalizada. Ao realizar este procedimento, antes de clivar o péptido da resina, a funcionalização selectiva do terminal-N pode ser realizada como grupos laterais de aminoácidos permanecem protegidos. n: número de PEG repete no macrómero (n = 45,5, 227 e 455, respectivamente, para a 2, 10, e 20 kDa PEG linear utilizado). R1 a RN: cadeias laterais de aminoácidos. PG1 para PGN: protecção da cadeia lateral grupos. TFA: ácido trifluoroacético. Dicas: triisopropilsilano. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H2O: a água.

O método methacrylation assistida por micro-ondas foi recentemente adaptado pelo nosso grupo para funcionalizar o N-terminal de péptidos com grupos de metacrilamida (Figura 3B), para facilitar a incorporação no péptido de uma variedade de polímeros e redes poliméricas. Nesta reacção, a amina primária do terminal-N do péptido reage com o átomo de carbono no anidrido metacrílico para formar uma amida. Isto gera o péptido funcionalizado metacrilamida, com o ácido metacrílico produzido como um produto secundário. Ao utilizar este processo para funcionalizar o N-terminal de sequências de péptidos, é importante que os aminoácidos contendo cadeias laterais reactivas (aminas primárias (lisina), álcoois (serina, treonina) e fenóis (tirosina)) estão protegidos durante a funcionalização, e Os grupos protectores são clivados apenas após incorporação metacrilamida.

Este artigo irá demonstrar ambos microwmétodos Ave-assistida para sintetizar PEGDM e funcionalizar sequências de peptídeos em resina, com destaque para as armadilhas comuns e sugerindo métodos de solução de problemas. Neste artigo, métodos para executar técnicas químicas analíticas comumente empregados para avaliar a funcionalização do produto serão detalhados e sugestões e recursos para a realização de modificações mais avançadas será dado. Os resultados típicos será demonstrado, que incluem a utilização do PEGDM sintetizado para formar redes de hidrogel, explorando os hidrogeles formados a controlar a libertação de um fármaco modelo e empregando péptidos funcionalizados para facilitar a interacção de células de hidrogel. Particular atenção será dada para caracterizar hidrogel malhagem e discutindo como composição de hidrogel pode ser ajustado para afetar essa propriedade física subjacente, que por sua vez controla as propriedades dos materiais a granel, como rigidez e perfil de liberação da droga.

Protocol

1. Síntese assistida por microondas de PEGDM

  1. Para evitar a contaminação com a água, pré-seco durante todo o material de vidro que está sendo usado numa estufa (> 60 º C) durante 1 hora.
    Nota: vidraria necessária inclui: dois copos de 100 ml, um copo de 250 ml, 3 espátulas, um frasco de Büchner de 250 ml, um funil de Büchner de 7 cm, um relógio de vidro de 10 cm.
  2. Pré-frio 100-150 ml de éter etílico anidro (74,12 g / mol), para a precipitação, subsequentemente realizada no passo 1.6, vertendo-a em uma taça, cobrindo o copo com um vidro de relógio, e colocando o recipiente em um prato de cristalização com gelo. Mova-ondas e vortexer em uma coifa química.
    Nota: O éter dietílico também podem ser pré-arrefecido colocando-se o recipiente num congelador química. Quanto mais baixa for a temperatura de éter dietílico conseguida por arrefecimento num congelador irá aumentar a taxa e eficiência de precipitação.
  3. Em um pequeno barco pesar, pesar 5 g de poli (etileno glicol) (PEG) do molecupeso lar de sua escolha (1,000-100,000 Da).
    1. Se estiver presente, remover o pedaço de plástico a partir da tampa do frasco de cintilação. Tarar o frasco, e dispensar 10 de excesso molar de anidrido metacrílico para dentro do frasco (MA, 154,16 g / mol) por uma equação na capa. Adicionar PEG para o frasco de cintilação.
      Equação 1 (1)
      onde Equação 1.1 é a massa de PEG, em g, Equação 1.2 é o peso molecular de PEG, em g / mol, Equação 1.3 é o número de grupos OH terminais do PEG, e Equação 1.4 é o molecupeso lar de mestrado em g / mol.
  4. Vagamente torcer a tampa no frasco de cintilação. Defina o microondas para 5 min em potência máxima. Usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do microondas a cada 30 seg.
    1. Aperte totalmente a tampa e vortex por 30 segundos. Repita até a solução foi microondas para o total de 5 min. A tampa pode precisar de ser substituído durante o procedimento devido a rachaduras.
  5. Com a tampa solta, deixe o PEGDM arrefecer à temperatura ambiente. Dissolve-se o PEGDM em uma pequena quantidade (10-15 ml) de diclorometano (DCM, 84,93 g / mol).
    Nota: É recomendado que o PEGDM ser deixada arrefecer de forma significativa (~ 5 minutos), antes de DCM disso, para evitar a ebulição do DCM (um cancerígeno), devido ao calor residual. O PEGDM pode ser quebrado em pequenos pedaços, utilizando uma espátula e centrifugadas para ajudar na dissolução.
  6. Precipitar o PEGDM em 10x excesso de éter etílico gelado por 20 min.
    Nota: Pode ser necessário para scRatch lado do copo com uma espátula para iniciar a formação de cristais para precipitar inferiores PEGs de peso molecular (2500 Da), no entanto, o PEG com um peso molecular inferior a 1000 Da não irá precipitar apesar de coçar.
  7. Utilizando um funil de Buchner e um balão de, recolher o PEGDM por filtração a vácuo. Não filtrar à secura total, pois isso irá promover a adsorção de água para o PEGDM.
    Nota: Se for necessário para que o sistema de vácuo específico a ser utilizado, uma armadilha de vácuo pode ser colocado entre a instalação de filtração e a fonte de vácuo para proteger a bomba de vácuo de danos causados ​​por vapores de solventes.
  8. Transfira a PEGDM filtrado para um tubo cônico de 50 ml com agulha de grosso calibre perfurou a tampa para ventilação. Armazenar durante a noite numa câmara de vácuo para secar.
  9. PEGDM redissolve em DCM e reprecipitar (como nos passos 1,5-1,7) como um passo final para remover MA que não reagiu. Seque novamente como no passo 1.8.

2. Caracterização de PEGDM Funcionalização

  1. Utilizando clorofórmio deuterado (120,38 g / mol) como solvente, para preparar as amostras de 1 H-RMN. Colocar uma pequena amostra do PEGDM (≈ 10 mg) num frasco de cintilação com uma pequena quantidade de solvente (≈ 1,0 ml). A concentração alvo é de 10 mg / ml.
    1. Uma vez que a amostra é dissolvida, transferi-lo para um tubo NMR limpo. A amostra deve preencher os 4-5 cm do fundo do tubo de RMN.
  2. Recolhe-se o espectro de RMN de protão. Nossos dados são coletados por meio de um espectrômetro de 400 MHz. Execute as amostras à temperatura ambiente por pelo menos 64 exames para obter a resolução de dados suficientes.
  3. Se a análise de RMN (Fig. 4) indica PEGDM funcionalização é inferior a 90%, o procedimento deve ser repetido methacrylation. Ajuste a massa de MA usado para contabilizar a quantidade reduzida de PEG não funcionalizados.

Nota: A porcentagem de PEG funcionalizada em PEGDM pode ser calculado a partir do observado: a relação teórica de methacr terminaisprotões ylate (a, b e c) para centrais de protões PEG (d) (Figura 4). Para o PEG linear, o número teórico de protões centrais PEG é calculada pela equação 2:

Equação 2 (2)
onde Equação 2.1 é o peso molecular do PEG, em g / mol e Equação 2.2 é o peso molecular de uma única repetição de PEG (44 g / mol). Por não-linear de PEG, esta equação deve ser modificada de modo a reflectir a estrutura de ramificação específica (Figura 1). A funcionalização por cento pode então ser calculada usando a equação 3:
Equação 3 (3)
onde Equação 3.1 é a área sob os picos observados metacrilato de protões (a, δ = 1,94 ppm, b e c, δ = 5,57 e 6,12 ppm), e Equação 3.3 é o número teórico de protões metacrilato (a = 3 * Equação 1.3 , B = 1 * Equação 1.3 e c = 1 * Equação 1.3 - 6, 2 e 2, respectivamente, para o PEG linear). A funcionalização por cento cálculo deve ser realizada utilizando os picos a, b e c separadamente, e, em seguida, averaged para obter um por cento funcionalização geral.

Nota: PEGDM suficientemente funcionalizado pode ser então dialisado (em água, contra a água) e recolhido por liofilização para remover o anidrido metacrílico residual e de ácido metacrílico. O produto final deverá ser misturado com uma pequena quantidade (0,01% em peso) de inibidor, tal como ácido cítrico ou de vitamina C e armazenado com dessecante a -20 ° C até à sua utilização. O produto final PEGDM podem ser utilizados para produzir hidrogeles, como detalhado no artigo JoVE por Khetan Burdick e 22.

3. Funcionalização assistida por microondas de péptidos em-resina

Nota: Os peptídeos são sintetizados utilizando uma resina de Fmoc-Gly-Wang, usando um sintetizador de péptidos automatizado com monitorização UV, e soluções de 0,2 M de aminoácidos no N-metilpirrolidona (NMP, 99,1 g / mol). 5% de piperazina (86,1 g / mol) em dimetilformamida (DMF, 73,1 g / mol) é utilizado para a desprotecção, 0,5 M O-Benzotriazol-N, N, N ', N'-tetrametil-urónio-hexaflUORO-fosfato (HBTU, 379,3 g / mol) em DMF é utilizado como activador, e 2 M de di-isopropiletilamina (DIEA, 129,3 g / mol) em NMP é usado como a base de activador. Os péptidos também podem ser obtidas a partir de um fornecedor comercial de péptidos. Quando o uso de fontes comerciais, é crítico que os péptidos são adquiridos em-resina com grupos intactos em vez de totalmente clivado da cadeia lateral do aminoácido de protecção, como é normal.

Nota: É importante que os amino ácidos com cadeias laterais reactivas são protegidas para assegurar que a funcionalização metacrilamida só ocorre na amina primária do terminal-N da sequência. Ver Tabela 1 para os aminoácidos com grupos laterais reactivos, e os grupos protectores típicos. Aminoácidos com grupos protectores são incorporados na sequência durante a síntese de péptidos na mesma maneira como os aminoácidos não protegidos, e muitas vezes estão disponíveis a partir dos mesmos fornecedores de aminoácidos.

Aminoácidos Grupo reativo Grupo de protecção
Lisina Amina Primária terc-butiloxicarbonilo (Boc)
Serina Álcool Primário terc-butil (tBu)
Treonina O álcool secundário tBu
A tirosina Fenol tBu

Tabela 1: aminoácidos reagentes e grupos protectores típicos.

  1. Sintetizar péptidos utilizando síntese de péptidos em fase sólida padrão, e armazenar a resina a 4 ° C em DMF até que esteja pronto para uso.
  2. Utilizando um funil de Buchner de 7 centímetros, com papel de filtro e balão de 250 ml, recolher a resina de peptídeo a partir da DMF por via da filtração.
  3. Se presente remover a peça de plástico da tampa do frasco de cintilação. Transferir a resina para o frasco de cintilação. Usando uma pipeta descartável, MA adicionar apenas o suficiente para cobrir a resina no frasco de cintilações.
  4. Genericamente colocar a tampa no frasco de cintilações. Defina o microondas para 3 min em potência máxima. Usando luvas resistentes ao calor, remova o frasco do microondas a cada 15-20 segundos.
    1. Aperte totalmente a tampa e vortex por 15 s. Repita até a solução foi microondas durante o full 3 min.
  5. Com a tampa solta, deixe a solução de peptídeo arrefecer à temperatura ambiente. Com uma pequena quantidade de DMF e um funil de Buchner com papel de filtro e frasco, recolher a resina de péptido a partir do frasco.
  6. Transferir a resina de peptídeo a um frasco de cintilação de fresco e clivar e desproteger o péptido.
    1. Por 0,25 mmol de resina, usamos uma reacção à temperatura ambiente 2 horas, com rotação, utilizando um cocktail de clivagem de 18,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA, 114,02 g / mol) com 0,5 ml de cada um de triisopropilsilano (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) e água desionizada (18,02 g / mol).
      Nota: Este cocktail é suficiente para a maioria dos péptidos, mas não vai desproteger 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonil aminoácidos (Pbf)-protegidos (vulgarmente utilizados para proteger as cadeias laterais de arginina). Se a sequência contém quaisquer grupos protegidos-Pbf, 0,5 ml de TFA deve ser substituído com 0,5 ml de tioanisole (124.20 g / mol) e clivagem de tempo aumentou para 4 h.
      Nota: Se um nublado, formas substância cristalina do coquetel clivagem, o peptídeo é provável cair fora da solução eo volume do coquetel clivagem deve ser duplicada.
  7. Relaxar 400 ml de éter dietílico anidro em gelo num copo de vidro coberto com relógio.
  8. Precipitar o péptido em 10x excesso de éter dietílico, e divida a solução uniformemente entre quatro tubos de 50 mL cónicos. Centrifugar a 3.200 xg durante 10 min para recolher o péptido.
    1. Decantar o éter, e ressuspender o peptídeo em 100 ml de éter dietílico fresco divididas entre dois tubos cónicos de 50 m. Repetir o processo de centrifugação, ressuspensão em 50 ml de éter fresco duas vezes para um total de 4 lavagens de éter.
      Nota: Isto remove os produtos químicos usados ​​no cocktail de clivagem e clivada grupos protectores a partir do péptido sólido.
  9. Após a última etapa de centrifugação, decantar o et resíduosela e secar o péptido durante a noite sob vácuo.

4. Caracterização do Péptido Funcionalização

  1. Use 50:50 H 2 O: acetonitrilo (41,05 g / mol) + 0,1% de TFA como o solvente para a análise de MALDI-TOF de amostras de péptidos. Colocar uma pequena quantidade de amostra (1-2 mg) do péptido em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e dissolve-se a amostra em 1 ml de solvente de MALDI.
  2. Preparar a solução matriz. Uma matriz de ácido vulgarmente utilizado é α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA, 189,2 g / mol) como matriz. Dissolver 10 matriz mg / ml num solvente de MALDI, formando uma solução matriz de estoque.
    Nota: A solução-mãe de matriz pode ser armazenada à temperatura ambiente durante até uma semana para análises adicionais.
  3. Combina-se o péptido e solução de matriz na proporção de 1:1. Detectar esta solução combinada em três locais distintos na chapa de amostra, MALDI, adicionando 1 ul / local.
    1. Seque as manchas, quer por secagem ao ar ou usando uma pistola de calor. Respot e seco cadaamostra.
      Nota: Respotting produz uma amostra peptídeo / matriz mais uniforme, e auxilia na obtenção de um sinal claro. Uma mistura de péptido de referência deve também ser combinado com a solução de matriz, em uma proporção de 1:1 e manchados (apenas uma vez) para a placa de MALDI.
  4. Coletar os dados de MALDI-TOF. Devido à adição do grupo metacrilamida para a N-terminal do péptido, deveria haver um aumento de 68 g / mole de peso molecular acima do que o peso molecular de péptido sozinho.
    Nota: Ao contrário da síntese PEGDM, péptidos não podem ser refunctionalized, como por clivagem os grupos de protecção de amino ácidos com cadeias laterais reactivas são removidos, e já não pode ser garantida a funcionalização selectiva do N-terminais.
    1. Se a análise de MALDI (Figura 5) indica o peptídeo foi correctamente funcionalizado e todos os grupos protectores apropriadamente clivado, o péptido pode ser dialisada (em água, contra a água) e recolhido por liofilização para remove contaminantes residuais (cocktail de clivagem, éter, clivado grupos protectores, etc.) O péptido sólido deve ser transferida para um pequeno tubo de Eppendorf e armazenou-se a -20 ° C até à sua utilização.

Representative Results

Resonância magnética nuclear é um dos mais comuns técnicas analíticas para avaliar a eficiência de uma reacção química, tal como a área sob cada pico de espectros é proporcional aos níveis relativos de protões que na amostra, permitindo a determinação das razões de reagente e de produtos na amostra. Para esta reacção, uma análise da 'H-RMN (Figura 4) pode ser utilizado para calcular a funcionalização% do observado: proporção teórica de protões de metacrilato terminais (a, b e c) para protões centrais PEG (d). O PEGDM mostrado na Figura 4 foi de 2.000 Da antes da funcionalização, portanto n = 2.000 Da / (44 Da / PEG repetição) = 45,5, então d = 4 * (n-1) = 178, fazendo com que o protão: proporção unidade RMN 178 / 102,16 = 1,74. Neste caso, o pico um não pode ser utilizado para avaliar% funcionalização, como a presença de água na amostra artificialmente aumenta a área sob o pico. Usando pico b, a funcionalização é de 1,00% 1,74 * / 2 * 100% = 87,1%; using de pico c, a funcionalização% é 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Portanto, a funcionalização total% é 91% e este é PEGDM adequadamente funcionalizado para utilização na síntese de hidrogel. Tipicamente, aproximadamente 90% de funcionalização é conseguida após um único ciclo de methacrylation.

Devido ao grande número de picos de prótons que surgem em uma análise de H-RMN de peptídeos, peptídeos funcionalização é mais facilmente investigados usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Isto é demonstrado na Figura 5, onde o GKRGDSG péptido foi sintetizado e submetido a metacrilamida funcionalização. Uma pequena fracção do péptido foi clivado para prefunctionalization avaliação do peso molecular (Figura 5A), que mostrou o pico de peso molecular observada ocorrendo em 676 g / mol, o peso molecular esperado de péptido, indicando a síntese correcta da sequência peptídica. O resto do péptido foram submetidos a metacrilamida funcionalzação antes da clivagem. Como este péptido contém Pbf aminoácidos protegidos por R, a clivagem foi realizada em um coquetel contendo tioanisole, durante 4 h. Após a funcionalização a metacrilamida, o pico observado peso molecular ocorre em 744 g / mol (Figura 5B), o peso esperado de metacrilamida funcionalizado péptido (68 676 g / mol) e não com o peso molecular esperado do péptido não funcionalizados, indicando correcta funcionalização.

Para demonstrar a funcionalidade do PEG e a metacrilamida funcionalizado péptido, hidrogéis PEGDM foram produzidos com e sem 0,5 mM metacrilamida funcionalizado GKRGDSG (Figura 6). Os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso linear de 10 kDa PEGDM em PBS, com 0,05% em peso de lítio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como fotoiniciador. A solução de hidrogel precursor foi injetada entre duas lâminas de vidro separadas por um espaçador lâmina de vidro e realizada em conjunto com grampos da pasta. Solução precursora foi então exposto à luz UV de 365 nm a 2 mW / cm 2, durante 10 min para induzir a reticulação, após o que géis 8 mm de diâmetro foram recolhidos utilizando um punção cilíndrico. Os géis foram lavados em PBS e deixou-se inchar durante 2 dias para assegurar condições de inchamento de equilíbrio foram obtidos 16,20. MSCs humanas (passagem 3) foram cultivadas até 80% de confluência e semeadas em hidrogéis de 15.000 células / cm 2. As células foram deixadas aderir durante 48 h antes de ser transferido para meio fresco contendo 0,5 ul / ml de calceina AM e 2 ul / ml de homodímero de etídio (VIVO kit Viabilidade / MORTOS de Invitrogen) e visualizados sob contraste de fase e fluorescência a 10x de ampliação utilizando um Nikon Eclipse Ti 2000. MSCs foram incapazes de aderir aos hidrogeles de PEG não funcionalizados (Figura 6A), mas quando da inclusão do péptido RGD, a adesão das células que foram capazes de aderir e se espalhar sobre a superfície do hidrogel (Figura 6B). As imagens AO VIVO / MORTOapresentada não representam a viabilidade da população semeado MSC, como MSCs são células dependentes de aderência que se desprendem da superfície da gel após a morte e serão removidas durante o processo de transferência do material, resultando no aumento artificial da viabilidade das células semeadas. Pelo contrário, as imagens fluorescentes são destinados a delimitar entre as células aderentes e as pequenas variações na topologia de hidrogel, o que pode ser difícil sob contraste de fase sozinho. Interessantemente, as células semeadas em nonspread os PEG-somente os géis coloração positiva para ambas calceina AM e homodimero de etidio, indicando que as células estavam a morrer no momento da imagiologia.

Uma das muitas vantagens para a hidrogeles de PEG é a sua natureza altamente sintonizável. Modificando a composição específica do hidrogel de PEG proporciona investigadores um elevado grau de controlo sobre as propriedades, tais como o módulo de elasticidade. Tal como ilustrado na Figura 7, tanto o peso molecular de PEG (Figura 7A) e percentagem de peso ( (Figura 8). Todos os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso PEGDM linear em PBS, com 0,05% em peso de LAP como fotoiniciador. 40 ul de solução precursora foi hidrogel em seringas de 1 ml, com as pontas cortadas e expostas a 365 nm de luz UV a 2 mW / cm 2, durante 10 min para formar hidrogéis, produzindo geometrias cilíndricas cerca de 5 mm de diâmetro e 2 mm de altura . Os géis foram deixadas inchar em PBS durante 2 dias antes do teste mecânico. Hidrogel módulo foi determinado usando um MTS QT / 5 com uma célula de carga de 5 N, enquanto comprimindo entre 5 e 10% da altura inicial do hidrogel a uma velocidade de 0,1 mm / seg. Após o teste mecânico foi completada, o tamanho da malha foi determinada pela medição de hidrogel mass pré-(M s) e pós-(M D) 24 horas de liofilização através da equação de Flory-Rehner conforme detalhado na seção de discussão, com cálculos realizados em MATLAB. Como esperado, o aumento do peso molecular do PEG macrómero causou um aumento no tamanho da malha do hidrogel (Figura 8A) e uma diminuição na rigidez do hidrogel (Figura 8B). Hidrogel de tamanho de malha e a rigidez de gel resultante também pode ser controlada através da alteração percentual de peso de PEG. Os hidrogéis foram produzidas com diferentes% em peso de linear de 10 kDa PEGDM, e rigidez do hidrogel e tamanho da malha foram determinadas como anteriormente descrito (Figura 9). Como foi ilustrado na Figura 7B, aumentando% em peso de PEG provoca uma diminuição significativa no tamanho de malha (Figura 9A) e aumento da rigidez do hidrogel (Figura 9B).

Os hidrogeles que contêm encapsulado de albumina de soro bovino (BSA) foram formadas utilizando molecula variandor PEG de massa (2, 10, e 20 kDa). Todos os hidrogéis foram produzidas com 10% em peso PEGDM em PBS contendo 50 ug / ml de BSA, como descrito para a Figura 6. Os géis foram incubados em 1 ml de PBS a 37 ° C, e transferidos para PBS fresco em cada ponto de tempo. BSA liberada foi quantificada usando o Ensaio de Bradford da Thermo Scientific. Hidrogel malhagem foi determinada como descrito para a Figura 8. Como ilustrado na Figura 7A, a libertação de BSA ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados usando PEGDM maior peso molecular, como um resultado do maior tamanho de malha no interior do hidrogel (Figura 10).

Figura 4
Figura 4. Representante 1 H-RMN de 2 kDa linear PEGDM funcionalizado usando o método assistido por microondas. Funcionalização por cento pode ser calculated baseado na observou:. relação teórica de prótons de metacrilato de terminais (a, b e c) para centrais prótons PEG (d) Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 5
Figura 5. Representante de MALDI-TOF de péptido GKRGDSG (A) antes e (B), após a funcionalização usando o método assistido por microondas. Note-se que o pico de peso molecular observado após a funcionalização ocorre a 744 g / mol, o peso esperado de metacrilamida funcionalizado péptido (676 68 g / mol) e não com o peso molecular esperado do peptídeo funcionalizada-un (676 g / mol). Clique aqui para ver a imagem ampliada .


Figura 6. Representante de contraste de fase (à esquerda) e Live / DEAD (verde / vermelho) imagens fluorescentes (direita) de MSCs cultivadas em A) PEG géis sozinho e B) géis PEG contendo 0,5 mM metacrilamida GKRGDSG funcionalizada. MSCs são incapazes de aderir e espalhar sobre os géis PEGDA sozinho, mas aquando da constituição do peptídeo RGD adesão celular, são capazes de aderir e espalhar sobre a superfície do hidrogel. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 7
Figura 7. A) peso molecular PEG e B) porcentagem de peso PEG usado para formar redes de hidrogel afeta hidrogel tamanho da malha (_8 ;) ea rigidez resultante hidrogel e taxa de drogas encapsuladas liberar. A) O aumento do peso molecular PEG (esquerda para direita) em porcentagem de peso constante aumenta o tamanho da malha de hidrogel, diminuindo a rigidez hidrogel e aumentar a taxa de liberação da droga. B) A diminuição do peso porcentagem de PEG (esquerda para direita) usados ​​para formar hidrogéis aumenta o tamanho da malha de hidrogel, diminuindo a rigidez semelhante hidrogel e aumentar a taxa de liberação da droga (sem escala). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 8
Figura 8. A) aumenta malhagem e B) rigidez hidrogel diminui com o aumento do peso molecular do PEG macrômero. N = 10, barras de erro = SEM, *** p &º 60; 0,001 por ANOVA com teste post-hoc HSD de Tukey. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism 5. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 9
Figura 9. A) Malha diminui e B de tamanho) de hidrogel de rigidez aumenta com o aumento da% em peso PEG. N = 9-10, barras de erro = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 por ANOVA de uma via com HSD de Tukey pós- teste hoc. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 10
Figura 10. Lançamento de encalibertação de BSA modelo psulated soro albumina bovina droga (BSA) a partir de hidrogéis formados utilizando 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa, o peso molecular do PEG. ocorre mais rapidamente a partir de hidrogéis formados com maior peso molecular PEGDM, como um resultado do tamanho de malha maior dentro do hidrogel . n = 6, as barras de erro = EPM. A BSA% liberado é significativamente diferente (p <0,0001) entre os três grupos em cada ponto de tempo, exceto t = 1 e 2,5 horas quando a libertação das 2 e 10 kDa géis são equivalentes, por duas vias repetir-medidas ANOVA com Bonferroni post-hoc teste. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Os métodos anteriormente ilustrados são inestimáveis ​​para a síntese de PEGDM e metacrilamida funcionalização de péptidos ou outros compostos contendo amina. Estes materiais podem então ser usadas para a medicina regenerativa e aplicações de entrega de drogas. Devido à natureza hidrófila do PEG, os hidrogeles formados a partir de macrómeros de PEG tem um elevado teor de água semelhante à de muitos tecidos no corpo 2. Isto faz com que a qualidade de PEG muito resistente à adsorção de proteínas e, por conseguinte, inerte no corpo 3. No entanto, a natureza higroscópica de PEG pode ser um incômodo durante a funcionalização. Se a água está presente na amostra de PEG durante o processo de methacrylation, o anidrido metacrílico vai reagir preferencialmente com água para produzir o ácido metacrílico, e pobre funcionalização de PEG vai resultar.

Por isso, um dos mais importantes passos que podem ser tomados para garantir methacrylation bem sucedida do PEG ou péptido é manter anidroAs condições de reacção muito rigorosos. A etapa recomendada de secar todos os vidros antes do uso se destina a evitar a contaminação da água. A presença de água na amostra pode ser vista na análise de RMN, como um pico largo a 1,7 ppm (Figura 4). Se pobre methacrylation é observada mesmo após secagem o material de vidro, produtos químicos pode ser seca sobre sulfato de sódio ou outros agentes de secagem (peneiras moleculares, etc) antes de usar. A destilação também pode ser usado para remover a água e purificar o anidrido metacrílico, antes da utilização, e a destilação azeotrópica pode ser usado para secar o PEG 23. Em casos extremos, a síntese pode ser realizada em uma caixa de luvas para garantir ainda mais adequadamente as condições anidras. Uma segunda ronda de methacrylation, seguindo o mesmo procedimento, podem também ser realizadas para aumentar a funcionalização. Porque há sempre uma chance de que rodadas adicionais de funcionalização serão necessários, cuidados devem ser tomados no passo 1.7 e 1.9 para coletar rapidamente PEGDM por filtração a vácuo. Filtração a vácuo por mais tempo do que é a exposição aumenta absolutamente necessárias de PEG de ar, aumentando a oportunidade para a adsorção de água.

Mesmo que o excesso de anidrido metacrílico por cento para os grupos funcionais hidroxilo permanece inalterada, aumentando a funcionalização de PEG (por exemplo, braço #) sobre o precursor de PEG está geralmente associada a uma diminuição da percentagem de funcionalização obtidos (resultados não publicados), Benoit laboratório. Para abordar preventivamente esta redução na eficiência de funcionalização, ou se dificuldades particulares são encontradas alcançar suficientemente elevada funcionalização, a duração da reacção pode ser aumentada de microondas, desde que o intervalo de microondas é mantida a 30 seg. Enquanto um excesso molar de 10 é tipicamente suficiente, a quantidade de anidrido metacrílico usado na reacção pode também ser aumentada para aumentar a percentagem de funcionalização alcançado 12.

É importante que opasso de precipitação adicional (1,9) ser realizada para alcançar bons sinais de RMN. Enquanto é tentador realizar a segunda precipitação no mesmo dia que a síntese, a secagem da amostra durante a noite antes de reprecipitação foi encontrado para auxiliar a remoção do excesso de anidrido metacrílico e ácido metacrílico. A preparação da amostra é também importante para a obtenção de espectros de RMN de limpeza, e, por conseguinte, as amostras devem ser preparadas utilizando as condições recomendadas. Figura 4 demonstra resultados representativos 1 H-RMN para o correctamente funcionalizado PEGDM. Ao analisar a relação entre prótons metacrilato terminais de prótons centrais PEG, o PEGDM estava determinado a ser adequadamente funcionalizados. Preparação de amostras MALDI é igualmente importante para alcançar uma leitura clara. MALDI é particularmente sensível à presença de sais e de elevadas concentrações de amostra. Se uma leitura MALDI claro (uma intensidade superior a 50 unidades arbitrárias (ua) com um sinal de alta: ruído) não pode ser obtido, a amostra slução deve ser diluído de 1:100 em MALDI solvente antes de ser combinado com a solução de matriz e novamente analisadas. Figura 5 mostra resultados representativos de MALDI-TOF, após a funcionalização correcta péptido, de clivagem, e a preparação da amostra. A clivagem de uma pequena amostra de resina antes da funcionalização (Figura 5A) mostra a síntese correcta das GKRGDSG péptido, com correcta funcionalização metacrilamida do péptido representado na Figura 5B.

Enquanto funcionalização dos péptidos sobre a resina é um processo relativamente robusto, as condições necessárias para a clivagem de cada sequência, muitas vezes requer ajuste. Para as seqüências longas onde muitos aminoácidos têm protegido cadeias laterais (> 30 aminoácidos de comprimento, ou> 15 aminoácidos com proteção de grupos), a duração da clivagem deve ser aumentada por uma hora. No entanto, se o tempo de clivagem é muito alargada, a clivagem da ligação peptídica pode resultar, devido a exposição ácida a longo prazo. MALDI ana lise pode ser muito útil em revelar todos os erros que ocorreram em síntese de peptídeos ou clivagem. Um decréscimo observado abaixo os pesos moleculares esperados podem indicar que o ácido (s) amino não devidamente pares, ou que ocorreu fraccionamento péptido (ver Tabela 2 para as fontes de alterações comumente observados em peso molecular). Se o peso molecular observado é maior do que o esperado com o peso de um grupo de protecção utilizado, é provável que a clivagem e desprotecção foi insuficiente e o péptido deve ser recleaved de tempo adicional.

x; "> mudança MW (g / mol) <estilo td = "width: 64px;"> 24 dth: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" height: 20px; width: 103px; "> Tyr
Aminoácidos Supressão Mudança MW (g / mol) Uncleaved Grupos Proteger Os íons comumente presentes Mudança MW (g / mol)
Ala -71 Acetil 42 Cl - 35
Arg -158 Allyl +40 K + +39
Asn -114 Alocação +85 Mg 2 +
Áspide -115 Boc 100 Na + +23
Cys -103 Fmoc 223
Gln -128 OtBu +56
Glu -129 Pbf 252
Gli -57 tBu +56
Seu -137 Trt 242
Ile -113
Leu
Lys -128
Met -131
Phe -147
-97
Ser -87
Tre -101
Trp -186
-147
Val -99

Tabela 2. Comumente observadas alterações no peso molecular de peptídeos.

Macrómeros produzidos usando métodos methacrylation assistida por micro-ondas pode ser utilizado num número de medicina regenerativa ou aplicações de entrega de drogas. Os péptidos funcionalizados e PEGDM sintetizados aqui também podem ser incorporados em polímeros utilizando Nitróxido-Mediated Polymerization (NMP), de transferência do átomo Radical Polymerization (ATRP) ou reversível Addição-Fragmentação Transfer (RAFT) métodos 24. Redes de hidrogel também pode ser produzido na presença de células, como demonstrado anteriormente no artigo JoVE por Khetan Burdick e 22. Isso muitas vezes requer a incorporação de péptidos de adesão celular, tais como RGD ou moléculas da matriz extracelular, como só o PEG não proporciona as interacções célula-prima críticos para a sobrevivência e função de alguns tipos de células 25. Péptidos, por exemplo, pode ser sintetizado utilizando-fase sólida de síntese de péptidos tradicionais e funcionalizadas como descrito aqui para permitir a incorporação de redes de hidrogel. Como pode ser visto na Figura 6, a inclusão da adesão celular de péptidos funcionalizados-metacrilamida GK RGDS G em hidrogéis (0,5 mM), facilita a adesão de células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) para as superfícies de hidrogel de PEG, o aumento do número de células de ligado e de espalhamento (Figura 6B ), em comparação com PEG hidrogeles sem o péptido de adesão celular ( 26. Para incorporar este espaçador PEG e evitar interacções não específicas, os péptidos podem ser conjugados com PEG monofunctionalized via N-hidroxissuccinimidilo activado-ésteres, tal como descrito por Hern e Hubbell 26.

Aplicações de redes de hidrogel requerem um controlo apertado sobre as propriedades do material. Uma vantagem significativa para os hidrogeles de PEG é um elevado grau de controle sobre essas propriedades. Por exemplo, o peso molecular, o número de braço, e a% em peso de PEG utilizado na formação de redes de hidrogel pode ser alterada a fina-tunpropriedades e para aplicações específicas. Isto permite um controlo apertado sobre o tamanho da malha do hidrogel (ξ), que controla a razão de inchamento do hidrogel (Q) e a rigidez (módulo de elasticidade, E). Isto é ilustrado na Figura 7A e quantificados na Figura 8, onde o aumento de PEG resultados macrómeros de peso molecular em um aumento no tamanho da malha do hidrogel (Figura 8A) e uma diminuição na rigidez do hidrogel (Figura 8B).

A característica física subjacente que controla o comportamento em massa nestas redes de hidrogel, malhagem, é calculada usando a equação de Flory-Rehner 16. Para efectuar este cálculo, o rácio de dilatação volumétrica (Q) é calculada primeiro a partir da equação 4:
Equação 4 (4)

onde ρ s é a densidade da água (1 g / ml), ρ p é a densidade de PEG (1,12 g / mL), M é a massa s inchados do hidrogel e M D é a massa seca do hidrogel (medido frequentemente após a congelação e liofilização de hidrogéis). O peso molecular entre ligações cruzadas (H c, em g / mol) é então calculado a partir da equação 5:
Equação 5 (5)

em que M N é o PM médio em número de PEG (em g / mol), Equação 5.05 é o volume específico do polímero Equação 5.1 , V 1 é o volume molar da água (18 ml / mol), V 2 é a fracção em volume do polímero de equilíbrio do hidrogel
( Equação 5.2 ), E X 1 16. O número de ligações entre as reticulações (n) é então calculado a partir da equação 6:
Equação 6 (6)

N onde b é o número de ligações na repetição de PEG (3) e M r é o PM do PEG de repetição (44 g / mol) 27. Isso permite que a distância da cadeia polimérica raiz quadrada média end-to-end Equação 6.1 (Em nm) ser calculado a partir da equação 7:
Equação 7 (7)

onde L é o comprimento médio de ligação (0,146 nm, calculado com base em CC e comprimentos de ligação CO) e C que n é a razão de característica do polímero (4.0 para PEG) 28. Finalmente, o tamanho da malha do hidrogel pode ser calculado a partir da equação 8:
Equação 8 (8)

Propriedades de hidrogel pode similarmente ser ajustado, ajustando a quantidade de PEG utilizado na formação de hidrogéis. A diminuição da percentagem de peso de macrómero resultados PEG em um aumento no tamanho de malha do hidrogel, a qual, posteriormente, reduz a rigidez do hidrogel. Figura 7B ilustra a Figura 9 e quantifica a percentagem em peso de PEG utilizado na formação de hidrogel podem ser utilizadas para controlar o tamanho de malha (Figura 9A) e rigidez hidrogel resultante (Figura 9B). Como a rigidez do substrato tenha sido demonstrado que afectam os comportamentos de células, tais como a diferenciação de células estaminais 29, a capacidade de controlar rigorosamente a rigidez é uma característica importante para a fabricação de hidrogel.

Os hidrogeles também podem ser usadas para contrentrega da droga ol. Como ilustrado na Figura 7A e demonstrado na Figura 10, o aumento do peso molecular dos macrómeros de PEG aumenta o tamanho da malha da rede de hidrogel, aumentando subsequentemente a libertação do fármaco modelo encapsulado, albumina de soro bovino (BSA). Embora as amostras de hidrogel neste estudo foram destruídos em t = 195 horas para permitir a medição de hidrogel massas secas e molhadas para cálculos de tamanho de malha, é nossa experiência que continuou liberação BSA ocorreria as amostras foram incubadas por períodos de tempo mais longos. A libertação de BSA incompleta observada na Figura 10 não é inesperado, já que outros grupos também têm relatado que a BSA é resistente à difusão dentro das redes de hidrogel de PEG 30. Libertação incompleta da proteína encapsulada pode ocorrer devido a pontes de hidrogénio entre as proteínas e os macrómeros de PEG, ou de ligação entre o grupo de metacrilato de PEG e grupos de aminas primárias dos resíduos de lisina na BSA 31 covalente (Figura 2A), é também possível que uma fracção da BSA encapsulada está contido nas regiões do hidrogel que tem malha significativamente menores tamanho do que a média geral dentro do gel, evitando sua liberação. Embora incompleta, libertação nonFickian (dados não mostrados) de BSA encapsulada foi observado neste caso, a libertação controlada de Fickiana numerosas outras drogas modelo, incluindo insulina e ovalbumina, foi demonstrada utilizando PEGDM semelhante hidrogéis 30. Além disso, Watkins e Anseth usaram microscopia confocal a laser para demonstrar que a liberação de moléculas fluorescentes de hidrogéis semelhantes é modelado agradavelmente, com difusão Fickiana methods 32.

Embora os hidrogeles formados neste estudo são degradáveis, degradação da rede é um outro parâmetro que pode ser incorporada e sintonizada dentro destas redes. Proporcionando por degradação hidrogel controlada pode resultar em alterações no comportamento da célula 33, a promoção do crescimento de tecido ou o crescimento interno de tecido do hospedeiro, ou a eliminação da necessidade de explante 34. Hidrogéis degradáveis ​​PEG são vulgarmente sintetizadas por abertura de anel de d hidroliticamente degradável, l-lactido, glicolido, ou grupos ε-caprolactona para grupos hidroxilo no PEG antes methacrylation 35. Estes três grupos de degradar-se por hidrólise de funcionalidades de éster, com os ésteres de glicolido que tem a maior susceptibilidade à degradação, seguido de lactido, caprolactona e éster, devido à sua hidrofobicidade variável. Após a incorporação de grupos hidroliticamente degradável, PEG pode ser adicionalmente funcionalizada utilizando o procedimento detaile methacrylationd neste artigo, permitindo a formação de redes de hidrogel através subseqüente polimerização em cadeia radical iniciado 36,37. A taxa de degradação das redes de hidrogel pode ser controlada pela variação da identidade do grupo hidroliticamente degradável (glicólido, láctido, etc), e através da variação do número de repetições degradáveis ​​incorporadas na estrutura 35,38.

Teoricamente, os métodos demonstrados aqui pode ser utilizado para acrylation de PEG e peptídeos substituindo o anidrido metacrílico, anidrido acrílico nas etapas 1.3 e 3.3, respectivamente. No entanto, o anidrido acrílico é mais de 20 vezes o custo de anidrido metacrílico 39,40, tornando acrylation assistida por microondas significativamente menos atraente do que methacrylation assistida por microondas.

Nós demonstramos um método simples, rápido para funcionalizar PEG e peptídeos, como avaliar a eficiência deste procedimento, e dispor de recursos para ucantar os materiais sintetizados para formar redes de hidrogel. Estas ferramentas sintéticas são altamente versátil em suas aplicações, e deve provar um grampo em qualquer número de entrega de drogas e materiais laboratórios de pesquisa.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa Howard Hughes Med-em-Grad (AVH), por fundos start-up previsto para o Dr. Danielle Benoit, da Universidade de Rochester e de Pesquisa e Educação da Fundação Ortopédica / Transplante Musculoskeletal Foundation (FIA / MTF). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James L. McGrath para o uso de seu equipamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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