Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

Chemistry
 

Summary

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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Abstract

Uno de los principales beneficios al uso de poli (etilenglicol) (PEG) macrómeros en la formación del hidrogel es versatilidad sintética. La capacidad de extraer de una gran variedad de pesos moleculares de PEG y configuraciones de brazo (número, longitud del brazo, y el patrón de ramificación) proporciona un control estricto sobre los investigadores resultante estructuras de hidrogel y propiedades, incluyendo el módulo de Young y el tamaño de malla. Este video ilustra un método rápido, eficiente, libre de solventes, asistida por microondas de metacrilato precursores de PEG en poli (etilenglicol) dimetacrilato (PEGDM). Este método sintético proporciona materiales de partida muy necesarios para su aplicación en la administración de fármacos y la medicina regenerativa. El método demostrado es superior a los métodos tradicionales metacrilación ya que es significativamente más rápido y sencillo, así como más económico y respetuoso con el medio ambiente, el uso de cantidades más pequeñas de reactivos y disolventes. También vamos a demostrar una adaptación de esta técnica para el metacrilato de resinafuncionalización ilamida de péptidos. Este método en-resina permite que el extremo N-terminal de péptidos a estar funcionalizado con grupos de metacrilamida antes de la desprotección y escisión de la resina. Esto permite la adición selectiva de grupos de metacrilamida a la N-terminales de los péptidos mientras que los aminoácidos con grupos reactivos secundarios (por ejemplo, amina primaria de la lisina, alcohol primario de la serina, treonina de alcoholes secundarios, y fenol de tirosina) permanecen protegidos, la prevención de funcionalización en múltiples sitios. Este artículo detallará métodos analíticos comunes (espectroscopia de resonancia magnética nuclear protónica (, H-RMN) y láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF)) para evaluar la eficiencia de las funcionalizaciones. Errores comunes y sugiere métodos para solucionar problemas se abordarán, como modificaciones de la técnica que se puede utilizar a una mayor funcionalidad macrómero sintonizar e hidrogel resultante física y químicapropiedades. El uso de productos de síntesis para la formación de hidrogeles para administración de fármacos y estudios de interacción célula-material se demostró, con especial atención a la modificación de la composición de hidrogel para afectar al tamaño de malla, el control de la rigidez de hidrogel y la liberación del fármaco.

Introduction

El poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles son biomateriales comunes utilizados en la medicina regenerativa y la administración de fármacos 1-3 aplicaciones. Estos hidrogeles ofrecen ventajas significativas sobre otros biomateriales. Los hidrogeles de PEG son sintéticos, que ofrece un alto grado de control sobre las propiedades de ingeniería tales como el módulo de elasticidad y la velocidad de degradación en comparación con sus homólogos de biomateriales naturales 1. A medida que se derivan sintéticamente, PEG tiene significativamente menos variabilidad lote a lote frente a los materiales de origen natural-4. Debido a la composición química de PEG, estos hidrogeles son altamente hidrófilos, resistentes a la adsorción de proteínas, y biocompatible 3. Esta resistencia a la absorción de proteínas permite hidrogeles de PEG para actuar como un "pizarra en blanco", que permite a los investigadores a interrogar y estudiar los factores biológicos o químicos específicos (medicamentos, biomoléculas, péptidos de adhesión celular, etc) y los roles específicos estos factoRS juegan en el control de la célula y / o comportamiento de los tejidos.

Figura 1
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Figura 1: Ejemplos de poli (etilenglicol) (PEG) arquitecturas A) PEG lineal B) de PEG de 4 brazos con un núcleo de pentaeritritol C) de PEG de 8 brazos con un núcleo de hexaglicerol D) de 8 brazos de PEG con un.... tripentaeritritol núcleo. n es el número de PEG repite en cada brazo. Cada repetición tiene un peso molecular de 44 g / mol, por lo tanto, n se puede calcular a partir del peso molecular total y la estructura / brazo #.

Precursores de PEG están disponibles con una variedad de arquitecturas y pesos moleculares (Figura 1 ). La variación de la arquitectura (brazo #) y repeticiones de glicol de etileno (n) de PEG puede ser utilizado para controlar las propiedades de las redes de hidrogel formadas a partir de estos macrómeros. Sin modificar PEG contiene grupos hidroxilo terminales que deben reponerse con una funcionalidad alternativa para facilitar la reticulación covalente mediante polimerizaciones, la estrategia de reticulación más comúnmente empleado para los hidrogeles de PEG, antes de la formación de las redes de hidrogel. Hay una variedad de grupos químicos que se pueden incorporar en macrómeros de PEG para facilitar la polimerización y la reticulación de la red (acrilato, metacrilato, vinil éter, norborneno, etc). A pesar de la variedad de funcionalidades terminales disponibles para facilitar la reticulación, sólo hay dos mecanismos por los que puede ocurrir la polimerización:-y paso de crecimiento en cadena (o una mezcla de los dos, de modo mixto).

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Figura 2:.. Teórica esquemática red hidrogel A) de la cadena de crecimiento tradicionales resultados de la polimerización en redes heterogéneas que contienen poli denso (metacrilato) regiones y el aumento no idealidades de red, tales como bucles, precursores sin reaccionar, y los enredos permanentes reticulación B) por crecimiento en etapas polimerización da como resultado estructuras de red significativamente más homogéneas (no a escala).

Funcionalidades que se reticulan a través de la polimerización de crecimiento en cadena no requieren la presencia de un agente de reticulación adicional. Sin embargo, los hidrogeles cadena polimerizada producen estructuras de redes heterogéneas que contienen regiones de reticulación densos (Figura 2A) 1. En contraste, por crecimiento en etapas de polimerización Requires el uso de un agente de reticulación o co-monómero que es reactivo con los grupos funcionales terminales de los macrómeros de PEG. Como los grupos funcionales terminales en el PEG sólo pueden reaccionar con el agente de reticulación y el agente de reticulación sólo pueden reaccionar con los grupos funcionales terminales en la clavija, esto resulta en una mayor estructura de la red homogeneidad (Figura 2B) 1. Polimerizaciones por crecimiento en etapas también típicamente conducen a una mayor conversión de los grupos funcionales, disminuyendo la cantidad de precursores sin reaccionar y el potencial para las respuestas inmunes / inflamatorias debido a solubles, macrómeros no incorporadas 1. Métodos de polimerización de modo mixto también se han desarrollado que combinan tanto la polimerización paso-y de crecimiento en cadena a través del uso de macrómeros que pueden tanto auto-reaccionar (de crecimiento en cadena) y reaccionar con un agente de reticulación (por crecimiento en etapas). Esto produce hidrogeles con características de cada mecanismo de polimerización, y se puede utilizar para producir, diversas estructuras de red más complejas que cualquierapaso o redes de cadena de crecimiento solamente 1.

Mientras que hay una gran cantidad de grupos funcionales que se pueden usar para funcionalizar PEG y facilitar la formación del hidrogel, metacrilatos y norbornenos son algunos de los restos más comunes de polimerización en cadena y por crecimiento en etapas, respectivamente. Ambas funcionalidades ofrecen un excelente control espacio-temporal durante la polimerización de la red, y cuando se usan para encapsular las células, estas redes de apoyo de alta capacidad de supervivencia global de la célula 5-7. Dimetacrilato de PEG funcionalizado (PEGDM) de reticulación a través de la polimerización de la cadena y permite la incorporación de biomoléculas u otros factores través de la co-polimerización con acrilato-, biomoléculas de metacrilato-, o de manera similar funcionalizados-5,6. Hidrogeles PEGDM tienen ventajas significativas sobre los sistemas de polimerización en cadena-alternos de crecimiento tales como acrilato de PEG funcionalizado (PEGDA). El uso de métodos tradicionales, PEGDA puede sintetizarse más rápidamente que PEGDM; hoWever, usando la síntesis asistida por microondas, la síntesis de PEGDM es aún más eficiente. PEGDA a menudo se sintetiza en 8 durante la noche o 24-hr 9 reacciones, pero también se puede sintetizar en cuatro horas a temperaturas elevadas 10. PEGDM también es tradicionalmente sintetizó por reacción de 11 durante toda la noche o durante 24 horas 5, con algunos de los métodos que se extiende el tiempo de reacción 4 días a 12. Utilizando el método asistida por microondas se ha demostrado aquí, PEGDM puede ser producido en una reacción de 5 min. Mientras PEGDM tiene una cinética de reacción más lentas que PEGDA 13, la reacción de reticulación para PEGDM sigue siendo rápida, que ocurre en minutos, y consigue una mayor conversión de macrómero de PEGDA como el aumento de la hidrofobicidad del grupo de metacrilato aumenta la agregación de grupo funcional en solución, lo que aumenta la probabilidad de la transferencia y la conversión radical metacrilato 14. Hidrogeles PEGDM también se asocian con el aumento de la viabilidad celular y el crecimiento comoen comparación con hidrogeles PEGDA, probablemente debido a la disminución de la velocidad de reacción en un momento dado, lo que reduce la concentración de radical y macrómeros sin reaccionar presentes 14. Polimerizaciones-tiol-eno como los que emplean PEG (PEGN) forman hidrogeles norborneno funcionalizado mediante polimerización por crecimiento en etapas, y requieren el uso de PEGN y un agente de reticulación que contiene un promedio de más de dos grupos funcionales. Desde tiilo radicales reaccionan con uniones norborneno carbono-carbono dobles, multi-tiol que contiene agentes de reticulación se utilizan comúnmente para reticular hidrogeles PEGN, lo que permite fácil incorporación de péptidos con aminoácidos cisteína funcionalidades 7. Si bien existen numerosas otras químicas que reaccionan por polimerización por crecimiento en etapas (reacciones de adición de Michael como tiol-acrilato 15 y sulfona tiol vinilo 16 "clic" reacciones como alquino-azida 17, etc), los hidrogeles tiol norborneno son muy común, como la cepa deel anillo de norborneno aumenta significativamente la velocidad de reacción y disminuye la probabilidad de la polimerización de doble cadena que experimenta enlace norborneno 7.

La decisión entre el metacrilato, norborneno, o funcionalización alternativo para facilitar la formación de hidrogel se basa en gran medida en el enfoque. Por ejemplo, la cadena-de crecimiento redes PEGDM polimerizado se han demostrado como muy adecuado para controlar la localización de células en el desarrollo de una ingeniería de tejidos periostio 18,19. Por crecimiento en etapas polimerizado redes de PEG son más adecuados para la incorporación de secuencias de péptidos para facilitar la degradación de hidrogel enzimáticamente-sensible, debido a la facilidad de incorporación de las secuencias de sustrato de la enzima utilizando tiol (cisteína) que contiene péptidos y norborneno macrómeros funcionalizados 20. Si la pregunta de investigación se aborda mejor mediante el uso de hidrogeles paso de crecimiento, Fairbanks et al. Proporciona una descripción detallada de la norborestrategia de funcionalización nene para PEG 7. Este detalle voluntad de papel cómo PEG y secuencias de péptidos se pueden funcionalizar (con un metacrilato de PEG, y una metacrilamida de péptidos) para reacciones de polimerización en cadena.

Tradicionalmente, PEGDM se produce haciendo reaccionar PEG con cloruro de metacriloilo y trietilamina en diclorometano. La reacción se deja avanzar durante la noche a temperatura ambiente 11 durante 24 horas o 5, con algunos de los métodos que se extienden tiempo de reacción 4 días a 12 antes de la filtración, la precipitación en éter dietílico, y la recolección. Aunque existen muchas variaciones de este enfoque, todos son mucho tiempo, requieren una amplia gama de equipos de síntesis química, y no son el medio ambiente, ya que implican el uso de cantidades relativamente grandes de reactivos de alta pureza y solvente. Para sortear estas limitaciones, Lin-Gibson et al. Desarrollaron un método libre de solventes asistida por microondas para funcionalizar PEG con te grupos metacrilato rminal (Figura 3A) 12. En esta reacción, los grupos alcohol terminales del PEG reaccionan con uno de los átomos de carbonilo del anhídrido metacrílico para formar un carboxilo. Esto genera el producto PEGDM, con ácido metacrílico como producto secundario. Esta síntesis tiene muchas de las ventajas características de la síntesis de microondas, incluida la reducción del tiempo de reacción y métodos de síntesis sin disolventes 21. La síntesis de microondas es preferible a los métodos discutidos anteriormente, ya que es significativamente más rápido, requiere un equipo menos extensa de síntesis (por ejemplo, material de vidrio, placas de reacción), y utiliza menos reactivo global y cantidades de disolventes como disolventes sólo son necesarios para la purificación del producto / colección y no para síntesis, lo que es más económica y respetuosa con el medio ambiente.

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Figura 3:. Esquemas de funcionalización A) de poli (etilenglicol) se hace reaccionar con un exceso molar de 10 veces de anhídrido metacrílico para producir poli (etilenglicol) metacrilato B) Este mismo método se puede usar para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, formando una. metacrilamida péptido funcionalizado. Mediante la realización de este procedimiento antes de escindir el péptido de la resina, la funcionalización selectiva de la N-terminal se puede realizar como grupos laterales de aminoácidos permanecen protegidos. n: número de PEG repite en el macrómero (n = 45,5, 227 y 455, respectivamente, para el 2, 10, y 20 kDa PEG lineal se utiliza). R1 a RN: cadenas laterales de aminoácidos. PG1 a PGN: protectores de cadena lateral grupos. TFA: ácido trifluoroacético. Consejos: triisopropilsilano. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H 2 O: agua.

El método de metacrilación asistida por microondas se ha adaptado recientemente por nuestro grupo para funcionalizar el extremo N-terminal de péptidos con grupos de metacrilamida (Figura 3B) para facilitar la incorporación del péptido en una variedad de polímeros y redes poliméricas. En esta reacción, la amina primaria de la N-terminal del péptido reacciona con el átomo de carbonilo en el anhídrido metacrílico para formar una amida. Esto genera el péptido funcionalizado metacrilamida, con ácido metacrílico producido como un producto secundario. Cuando se utiliza este procedimiento para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, es importante que los aminoácidos que contienen cadenas laterales reactivas (aminas primarios (lisina), alcoholes (serina, treonina), y fenoles (tirosina)) están protegidos durante la funcionalización, y grupos protectores sólo se escinden después de la incorporación metacrilamida.

Este artículo demostrará ambos microondmétodos de ave con ayuda de sintetizar PEGDM y funcionalizar secuencias de péptidos sobre resina, destacando las dificultades comunes y sugiriendo métodos de solución de problemas. En este artículo, los métodos para la realización de técnicas químicas analíticas empleadas comúnmente para evaluar la funcionalización de productos se detallarán, y se les dará sugerencias y recursos para realizar modificaciones más avanzadas. Los resultados típicos se demostraron, que incluyen el uso de la PEGDM sintetizada para formar redes de hidrogel, la explotación de los hidrogeles formados para controlar la liberación de un fármaco modelo, y el empleo de péptidos funcionalizados para facilitar las interacciones célula-hidrogel. Se prestará especial atención a la caracterización de hidrogel de tamaño de malla y discutir cómo la composición de hidrogel se puede ajustar para afectar a esta propiedad física subyacente, que a su vez controla las propiedades del material a granel, tales como la rigidez y el perfil de liberación del fármaco.

Protocol

1. Síntesis asistida por microondas de PEGDM

  1. Para evitar la contaminación con agua, presecar el material de vidrio se utiliza en un horno (> 60 º C) durante 1 hora.
    Nota: la cristalería requerida incluye: dos vasos de precipitados de 100 ml, un vaso de 250 ml, 3 espátulas, un frasco de 250 ml Büchner, un embudo Büchner de 7 cm, un vidrio de reloj de 10 cm.
  2. Pre enfriamiento 100-150 ml de éter dietílico anhidro (74,12 g / mol) para la precipitación posteriormente realizado en el paso 1.6 vertiéndola en un vaso de precipitados, que cubre el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, y colocando el vaso de precipitados en una placa de recristalización lleno de hielo. Mueva microondas y vórtice en una campana química.
    Nota: éter de dietilo también puede preenfriar colocando el vaso de precipitados en un congelador química. La temperatura éter dietílico inferior logrado por enfriamiento en un congelador aumentará la tasa y eficiencia de precipitación.
  3. En un pequeño barco pesar, pesar 5 g de poli (etilenglicol) (PEG) de la molecular el peso de su elección (1.000-100.000 Da).
    1. Si está presente, retire la pieza de plástico de la tapa del vial de centelleo. Tarar el vial, y dispensar 10 exceso molar de anhídrido metacrílico en el vial (MA, 154,16 g / mol) por la ecuación 1 en la campana. Añadir PEG al vial de centelleo.
      Ecuación 1 (1)
      donde Ecuación 1.1 es la masa de PEG en g, Ecuación 1.2 es el peso molecular de PEG en g / mol, Ecuación 1.3 es el número de grupos OH terminales en el PEG, y Ecuación 1.4 es el molecular el peso de MA en g / mol.
  4. Sin apretar girar la tapa en el vial de centelleo. Ajuste el horno de microondas para 5 min en la máxima potencia. El uso de guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 30 segundos.
    1. Apriete completamente la tapa y agitar durante 30 segundos. Repita hasta que la solución ha sido calentados para el total de 5 min. La tapa puede necesitar ser reemplazado durante el procedimiento debido a la fisuración.
  5. Con la tapa aflojada, deje que el PEGDM enfriar a temperatura ambiente. Disolver el PEGDM en una pequeña cantidad (10-15 ml) de diclorometano (DCM, 84,93 g / mol).
    Nota: Se recomienda que el PEGDM se dejó enfriar de manera significativa (~ 5 minutos) antes de la adición de DCM, para evitar la ebullición de la DCM (un carcinógeno sospechoso) debido al calor residual. El PEGDM puede romperse en pequeños trozos utilizando una espátula y se agitó en vórtex para ayudar a la disolución.
  6. Precipitar el PEGDM en 10 veces el exceso de éter dietílico enfriado en hielo durante 20 min.
    Nota: Puede ser necesario scRatch el lado vaso de precipitados con una espátula para iniciar la formación de cristales para precipitar los PEG de bajo peso molecular (2.500 Da), sin embargo, el PEG con un peso molecular por debajo de 1000 Da no precipitará a pesar de rascado.
  7. El uso de un embudo Buchner y un matraz, recoger el PEGDM por filtración al vacío. No filtrar hasta desecación completa, ya que esto promoverá la adsorción de agua a la PEGDM.
    Nota: Si es necesario para el sistema de vacío específico en uso, una trampa de vacío se puede colocar entre la configuración de la filtración y la fuente de vacío para proteger la bomba de vacío del daño causado por los vapores de disolvente.
  8. Transferir el PEGDM filtrada a un tubo cónico de 50 ml con una aguja de calibre grande perforado a través de la tapa para la ventilación. Almacenar durante la noche en una cámara de vacío para secar.
  9. Se vuelve a disolver en DCM y PEGDM precipitara de nuevo (como en los pasos 1.5 a 1.7) como una etapa final para eliminar MA sin reaccionar. Secar de nuevo como en el paso 1.8.

2. Caracterización de PEGDM Funcionalización

  1. Utilizando cloroformo deuterado (120,38 g / mol) como disolvente, para preparar muestras 1 H-RMN. Colocar una pequeña muestra de la PEGDM (≈ 10 mg) en un vial de centelleo con una pequeña cantidad de disolvente (≈ 1,0 ml). La concentración objetivo es 10 mg / ml.
    1. Una vez que se disolvió la muestra, transferirlo a un tubo de RMN limpio. La muestra debe llenar la parte inferior de 4-5 cm del tubo de RMN.
  2. Recoger los espectros de RMN de protón. Nuestros datos se recogieron usando un espectrómetro de 400 MHz. Ejecutar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 64 exploraciones para obtener suficiente resolución de datos.
  3. Si el análisis de RMN (Figura 4) indica PEGDM funcionalización es menos de 90%, el procedimiento de metacrilación se debe repetir. Ajuste de la masa de MA usa para dar cuenta de la cantidad reducida de PEG no funcionalizado.

Nota: El por ciento de PEG funcionalizado en PEGDM puede calcularse a partir de la observada: relación teórica de metacrilato terminal deprotones ylate (a, byc) a centrales protones PEG (d) (Figura 4). Para el PEG lineal, el número teórico de centrales protones de PEG se calcula por la ecuación 2:

Ecuación 2 (2)
donde Ecuación 2.1 es el peso molecular del PEG en g / mol y Ecuación 2.2 es el peso molecular de una única repetición de PEG (44 g / mol). Para no lineal de PEG, esta ecuación debe ser modificado para reflejar la estructura de ramificación específica (Figura 1). El porcentaje de funcionalización se puede calcular utilizando la ecuación 3:
Ecuación 3 (3)
donde Ecuación 3.1 es el área observada bajo los picos de protones metacrilato (A, δ = 1,94 ppm, b y c, δ = 5,57 y 6,12 ppm), y Ecuación 3.3 es el número teórico de protones de metacrilato (A = 3 * Ecuación 1.3 , B = 1 * Ecuación 1.3 y c = 1 * Ecuación 1.3 - 6, 2 y 2, respectivamente, para PEG lineal). El cálculo de funcionalización por ciento se debe realizar utilizando picos a, b y c por separado, y luego averaged para obtener un ciento funcionalización en general.

Nota: PEGDM suficientemente funcionalizado puede entonces ser dializó (en agua, contra el agua) y se recogió por liofilización para eliminar el anhídrido metacrílico residual y ácido metacrílico. El producto final debe ser mezclado con una pequeña cantidad (0,01% en peso) de inhibidor, tal como ácido cítrico o vitamina C y se almacenó con desecante a -20 ° C hasta su uso. El producto PEGDM final puede ser utilizado para producir hidrogeles, como se detalla en el artículo JoVe por Khetan y Burdick 22.

3. Funcionalización asistida por microondas de los péptidos sobre resina-

Nota: Nuestros péptidos se sintetizaron usando resina Fmoc-Gly-Wang, utilizando un sintetizador de péptidos automatizado con control UV, y soluciones 0,2 M de aminoácidos en N-metilpirrolidona (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazina (86,1 g / mol) en dimetilformamida (DMF, 73,1 g / mol) se utiliza para la desprotección, 0,5 M de O-benzotriazol-N, N, N ', N'-tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 379,3 g / mol) en DMF se utiliza como el activador, y 2 M de diisopropiletilamina (DIEA, 129,3 g / mol) en NMP se utiliza como la base del activador. Los péptidos también se pueden obtener de un proveedor comercial péptido. Al utilizar fuentes comerciales es crítico que los péptidos se efectúen en-resina con la cadena lateral de grupos protectores de aminoácidos intactos en lugar de completamente escindido, como es estándar.

Nota: Es importante que cualquiera de los aminoácidos con cadenas laterales reactivas están protegidos para asegurar que funcionalización metacrilamida sólo se produce en la amina primaria de la N-terminal de la secuencia. Ver la Tabla 1 para los aminoácidos con grupos laterales reactivos, y grupos protectores típicos. Los aminoácidos con grupos protectores se incorporan en la secuencia durante la síntesis de péptido de la misma manera como los aminoácidos no protegidos, y a menudo están disponibles a partir de los mismos proveedores de aminoácidos.

Aminoácido Grupo reactivo Grupo protector
Lisina Amina primaria terc-butiloxicarbonilo (Boc)
Serina Alcohol primario terc-butilo (tBu)
Treonina Alcohol secundario tBu
Tirosina Fenol tBu

Tabla 1: aminoácidos reactivos y grupos protectores típicos.

  1. Sintetizar péptidos usando síntesis de péptidos en fase sólida estándar, y almacenar en la resina a 4 ° C en DMF hasta que esté listo para su uso.
  2. Usando un embudo Büchner 7 cm con papel de filtro y matraz de 250 ml, recoger la resina de péptido de la DMF a través de filtración.
  3. Si está presente quitar la pieza de plástico de la tapa del vial de centelleo. Transferir la resina para el vial de centelleo. Utilizando una pipeta desechable, añadir suficiente MA para cubrir la resina en el vial de centelleo.
  4. Sin apretar colocar la tapa en el vial de centelleo. Ajuste el microondas a 3 minutos a máxima potencia. El uso de guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 15-20 segundos.
    1. Apriete completamente la tapa y agitar durante 15 segundos. Repita hasta que la solución ha sido calentados para el full 3 min.
  5. Con la tapa aflojada, deje que la solución de péptido se enfríe a temperatura ambiente. El uso de una pequeña cantidad de DMF y un embudo Buchner con papel de filtro y el frasco, recoger la resina de péptido del vial.
  6. Transferir la resina péptido a un vial de centelleo fresco y escindir y desproteger el péptido.
    1. Por 0,25 mmol de resina, se utiliza una reacción a temperatura ambiente 2 horas con rotación, usando un cóctel de escisión de 18,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA, 114,02 g / mol) con 0,5 ml de cada uno de triisopropilsilano (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanoditiol (Dodt, 182,30 g / mol) y agua desionizada (18,02 g / mol).
      Nota: Este cóctel es suficiente para la mayoría de los péptidos, pero no desproteger 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonil aminoácidos (Pbf)-protegidas (comúnmente usados ​​para proteger las cadenas laterales de arginina). Si la secuencia contiene grupos protegidos-Pbf, deben reemplazarse 0,5 ml de TFA con 0,5 ml de tioanisol (124.20 g / mol) y la escisión tiempo aumentó a 4 horas.
      Nota: Si un nublado, forma una sustancia cristalina en el cóctel de escisión, el péptido es probable que el juego fuera de la solución y el volumen del cóctel de escisión debe ser del doble.
  7. Chill 400 ml de éter dietílico anhidro en el hielo en un vaso de precipitados cubierto con vidrio de reloj.
  8. Precipitar el péptido en 10 veces el exceso de éter dietílico, y dividir la solución de manera uniforme entre los cuatro tubos de 50 ml cónicos. Se centrifuga a 3200 × g durante 10 min para recoger el péptido.
    1. Decantar el éter, y resuspender el péptido en 100 ml de éter dietílico fresco dividido entre dos tubos cónicos de 50 m. Repetir el proceso de centrifugación, resuspensión en 50 ml de éter fresco dos veces para un total de 4 lavados de éter.
      Nota: Esto elimina los productos químicos utilizados en el cóctel de escisión y se escinde los grupos protectores del péptido sólido.
  9. Después de la última etapa de centrifugación, se decanta el et de residuosella y secar el péptido durante la noche bajo vacío.

4. Caracterización del péptido Funcionalización

  1. Utilice 50:50 H2O: acetonitrilo (41.05 g / mol) + 0,1% de TFA como disolvente para el análisis MALDI-TOF de muestras de péptidos. Colocar una pequeña muestra (1 - 2 mg) del péptido en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y disolver la muestra en 1 ml de disolvente de MALDI.
  2. Preparar la solución de matriz. Una matriz de ácido empleado comúnmente se α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA, 189,2 g / mol) como la matriz. Disolver 10 matriz mg / ml en MALDI disolvente, formando una solución matriz de valores.
    Nota: La solución de la matriz se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de una semana para análisis adicionales.
  3. Combinar el péptido y solución de matriz en una relación de 01:01. Spot Esta solución combinada en tres lugares separados en la placa de muestra de MALDI, la adición de 1 l / spot.
    1. Secar las manchas, ya sea por secado al aire o con una pistola de calor. Puntos por resistencia y seca cadamuestra.
      Nota: Respotting produce una muestra más uniforme péptido / matriz, y ayuda a obtener una señal clara. Una mezcla de péptidos estándar también se debe combinar con la solución de matriz en una relación de 01:01 y manchado (sólo una vez) en la placa de MALDI.
  4. Recoge los datos de MALDI-TOF. Debido a la adición del grupo de metacrilamida a la N-terminal del péptido, no debería haber un incremento de 68 g / mol en peso molecular por encima de que el peso molecular del péptido solo.
    Nota: A diferencia de la síntesis PEGDM, péptidos no pueden ser refunctionalized, como tras la escisión se eliminan los grupos protectores en los aminoácidos con cadenas laterales reactivas, y la funcionalización selectiva de los extremos N ya no pueden garantizarse.
    1. Si el análisis de MALDI (Figura 5) indica el péptido se funcionaliza correctamente y todos los grupos protectores escinde apropiadamente, el péptido se puede dializó (en agua, contra el agua) y se recogió mediante liofilización para Remove contaminantes residuales (cóctel de escisión, éter, escinden los grupos protectores, etc.) El péptido sólido debe ser transferido a un pequeño tubo Eppendorf y se almacenó a -20 ° C hasta su uso.

Representative Results

Resonancia magnética nuclear de protones es una de las técnicas analíticas más comunes para evaluar la eficiencia de una reacción química, como el área bajo cada pico de espectros es proporcional a los niveles relativos de que de protones en la muestra, lo que permite la determinación de las proporciones de producto y reactante en la muestra. Para esta reacción, el análisis por 1H-RMN (Figura 4) se puede utilizar para calcular la funcionalización% de lo observado: relación teórica de protones de metacrilato de terminales (A, B y C) para centrales protones de PEG (d). El PEGDM se muestra en la Figura 4 era 2000 Da antes de la funcionalización, por lo tanto n = 2000 Da / (44 Da / PEG de repetición) = 45.5, por lo que d = 4 * (n-1) = 178, por lo que el protón: proporción de la unidad de RMN 178 / 102,16 = 1,74. En este caso, el pico A no se puede utilizar en la evaluación de% de funcionalización, como la presencia de agua en la muestra aumenta artificialmente el área bajo el pico. Usando pico b, la funcionalización% es 1.00 * 1.74 / 2 * 100% = 87,1%; using pico c, la funcionalización% es de 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Por lo tanto, la funcionalización% global es 91% y esto PEGDM está funcionalizado adecuadamente para su uso en la síntesis de hidrogel. Típicamente, aproximadamente el 90% de funcionalización se consigue después de una sola ronda de metacrilación.

Debido a la gran cantidad de picos de protones que se plantean en el análisis de 1H-RMN de péptidos, funcionalización péptido se investigó con mayor facilidad utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas. Esto se demuestra en la Figura 5, donde se sintetizó el péptido GKRGDSG y se sometió a metacrilamida funcionalización. Una pequeña fracción del péptido se escindió para prefunctionalization evaluación peso molecular (Figura 5A), que mostró el pico observado de peso molecular que se encuentra en 676 g / mol, el peso molecular esperado del péptido, indicando correcta síntesis de la secuencia del péptido. El resto del péptido se sometió a metacrilamida funcionalción antes de la escisión. Como este péptido contiene Pbf aminoácidos protegidos R, la escisión se llevó a cabo en un cóctel que contiene tioanisol durante 4 horas. Después de funcionalización metacrilamida, el pico observado de peso molecular se produce a 744 g / mol (Figura 5B), el peso esperado de la metacrilamida funcionalizado péptido (676 68 g / mol) y no en el peso molecular esperado del péptido sin funcionalizar, lo que indica correcta funcionalización.

Para demostrar la funcionalidad tanto de la PEG y el péptido metacrilamida funcionalizado, hidrogeles PEGDM fueron producidos con y sin 0,5 mM metacrilamida funcionalizado GKRGDSG (Figura 6). Los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso lineal de 10 kDa PEGDM en PBS, con 0,05% en peso de litio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como fotoiniciador. La solución de precursor de hidrogel se inyecta entre dos portaobjetos de vidrio separados por un espaciador portaobjetos de vidrio y se mantienen unidas con clips de la carpeta. Entonces disolución precursora se expone a la luz UV 365 nm a 2 mW / cm 2 durante 10 minutos para inducir la reticulación, después de lo cual los geles de 8 mm de diámetro se recogieron utilizando un punzón cilíndrico. Los geles se lavaron en PBS y se dejaron hinchar durante 2 días para asegurar las condiciones de equilibrio de hinchamiento se lograron 16,20. MSC humanas (paso 3) se hicieron crecer hasta 80% de confluencia y se sembraron en hidrogeles a 15.000 células / cm 2. Las células se dejaron adherir durante 48 horas antes de ser transferidos a medio fresco que contenía 0,5 l / ml de calceína AM y 2 l / ml de homodímero de etidio (kit de Viabilidad vivas / muertas de Invitrogen) y fotografiado bajo contraste de fase y fluorescencia a un aumento de 10X utilizando una Nikon Eclipse Ti 2000. MSC fueron incapaces de adherirse a los hidrogeles de PEG no funcionalizados (Figura 6A), sino sobre la inclusión de péptido RGD de adhesión de células que eran capaces de adherirse a y se extendió sobre la superficie del hidrogel (Figura 6B). Las imágenes vivas / muertaspresentado no representan la viabilidad de la población sin semillas MSC, como MSC son células de adhesión dependiente que se desprenden de la superficie del gel después de la muerte y que se eliminan durante el proceso de transferencia de los medios de comunicación, lo que resulta en la inflación artificial de la viabilidad celular se sembró. Más bien, las imágenes fluorescentes están destinados a delimitar entre las células adherentes y las pequeñas variaciones en la topología de hidrogel, que puede ser difícil bajo contraste de fase solo. Curiosamente, las células nonspread sembraron en el PEG-sólo geles de tinción positiva tanto para el AM de calceína y homodímero de etidio, lo que indica que las células estaban muriendo en el momento de formación de imágenes.

Una de las muchas ventajas de hidrogeles de PEG es su naturaleza altamente sintonizable. Modificación de la composición específica del hidrogel de PEG proporciona a los investigadores un alto grado de control sobre propiedades tales como el módulo de elasticidad. Como se ilustra en la Figura 7, tanto el peso molecular de PEG (Figura 7A) y porcentaje en peso ( (Figura 8). Todos los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso PEGDM lineal en PBS, con 0,05% en peso LAP como fotoiniciador. 40 l de solución de precursor de hidrogel fue de 1 ml en jeringas con las puntas cortadas, y se expusieron a 365 nm de luz UV a 2 mW / cm 2 durante 10 min para formar hidrogeles, la producción de geometrías cilíndricas de aproximadamente 5 mm de diámetro y 2 mm de altura . Los geles se dejaron hinchar en PBS durante 2 días antes de la prueba mecánica. Módulo de hidrogel se determinó utilizando un MTS QT / 5 con una célula de carga de 5 N mientras la compresión de entre 5 y 10% de la altura inicial de hidrogel a una velocidad de 0,1 mm / seg. Después de que se completó el ensayo mecánico, tamaño de malla se determinó mediante la medición de hidrogel Mass antes de la (s M) y post-(M D) 24 horas de liofilización a través de la ecuación de Flory-Rehner como se detalla en la sección de discusión, con los cálculos realizados en MATLAB. Como hipótesis, aumentar el peso molecular del PEG macrómero provocó un aumento de tamaño de malla de hidrogel (Figura 8A) y una disminución en la rigidez de hidrogel (Figura 8B). Hidrogel tamaño de malla y la rigidez del gel resultante también se pueden controlar mediante la alteración de porcentaje en peso de PEG. Los hidrogeles fueron producidos con diferentes% en peso de lineal de 10 kDa PEGDM, y la rigidez de hidrogel y el tamaño de malla se determinaron como se ha descrito anteriormente (Figura 9). Como se ilustra en la Figura 7B, el aumento de% en peso de PEG causa una disminución significativa en el tamaño de malla (Figura 9A) y aumento en la rigidez de hidrogel (Figura 9B).

Los hidrogeles que contienen albúmina de suero bovino encapsulado (BSA) se forman usando diferentes moleculaR PEG de peso (2, 10, y 20 kDa). Todos los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso PEGDM en PBS que contenía 50 mg / ml de BSA, tal como se describe para la Figura 6. Los geles se incubaron en 1 ml de PBS a 37 º C, y se transfirieron a PBS fresca en cada punto de tiempo. BSA liberado se cuantificó usando el ensayo de Bradford de Thermo Scientific. Hidrogel tamaño de la malla se determinó como se describe para la Figura 8. Como se ilustra en la Figura 7A, la liberación de BSA se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados usando PEGDM mayor peso molecular, como un resultado del tamaño de malla más grande en el hidrogel (Figura 10).

Figura 4
Figura 4. Representante 1 H-RMN de 2 kDa lineal PEGDM funcionalizado usando el método asistida por microondas. Funcionalización por ciento puede ser CAlculated basado en la observación:. relación teórica de protones metacrilato terminales (a, byc) a centrales protones PEG (d) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 5
Figura 5. Representante de MALDI-TOF de GKRGDSG péptido (a) antes y (b) después de funcionalización usando el método asistida por microondas. Tenga en cuenta que el pico de peso molecular observada después de la funcionalización se produce a 744 g / mol, el peso esperado del péptido metacrilamida funcionalizado (676 68 g / mol) y no en el peso molecular esperado del péptido anti-funcionalizado (676 g / mol). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .


Figura 6. Contraste de fase Representante (izquierda) y vivas / muertas (verde / rojo) imágenes fluorescentes (derecha) de las MSC cultivadas en geles A) PEG solos y B) geles de PEG que contienen 0,5 mM metacrilamida GKRGDSG funcionalizado. MSCs son capaces de adherirse y difundir el los geles PEGDA solos, pero después de la incorporación del péptido RGD de adhesión celular, son capaces de adherirse a y se extendió sobre la superficie del hidrogel. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 7
Figura 7. A) PEG de peso molecular y B) PEG porcentaje de peso utilizada para formar redes de hidrogel afecta hidrogel tamaño de malla (_8 ;) y la rigidez de hidrogel resultante y la tasa de fármacos encapsulados liberar. A) Aumento de peso molecular de PEG (de izquierda a derecha) en porcentaje en peso constante aumenta el tamaño de malla del hidrogel, la disminución de la rigidez de hidrogel y el aumento de la tasa de liberación del fármaco. B) disminuyendo el peso porcentaje de PEG (izquierda a derecha) que se utiliza para formar hidrogeles aumenta el tamaño de malla de hidrogel, de manera similar disminuir la rigidez de hidrogel y el aumento de la tasa de liberación del fármaco (no a escala). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 8
Figura 8. A) y B aumenta de tamaño de malla) rigidez hidrogel disminuye al aumentar el peso molecular del macrómero PEG. N = 10, las barras de error = SEM, *** p &# 60; 0,001 por ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey HSD. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 5. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 9
La Figura 9. A) Malla disminuye y B de tamaño) rigidez aumenta con el aumento de hidrogel% en peso de PEG. N = 9-10, barras de error = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 por ANOVA de una vía con HSD de Tukey post- hoc test. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 10
Figura 10. La liberación de encamodelo psulated bovina drogas albúmina de suero (BSA) a partir de hidrogeles formados usando 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa de peso molecular de PEG. liberación de BSA se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados usando mayor peso molecular PEGDM, como un resultado del tamaño de malla más grande en el hidrogel . n = 6, las barras de error = SEM. La BSA% liberado es significativamente diferente (p <0,0001) entre los tres grupos en cada punto de tiempo, excepto t = 1 y 2,5 horas cuando la liberación de los geles 2 y 10 kDa son equivalentes, por dos vías de repetición-medidas ANOVA con Bonferroni post-hoc test. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Los métodos ilustrados anteriormente son de gran valor para la síntesis de PEGDM y metacrilamida funcionalización de péptidos u otros compuestos que contienen amina. Estos materiales se pueden utilizar para la medicina regenerativa y aplicaciones de administración de fármacos. Debido a la naturaleza hidrofílica de PEG, los hidrogeles formados a partir de macrómeros de PEG tienen un alto contenido de agua similar a muchos tejidos en el cuerpo 2. Esta cualidad hace PEG muy resistentes a la adsorción de proteínas y, por tanto, inerte en el cuerpo 3. Sin embargo, la naturaleza higroscópica de PEG puede resultar problemático durante funcionalización. Si el agua está presente en la muestra de PEG durante el procedimiento de metacrilación, el anhídrido metacrílico reaccionará preferentemente con agua para producir ácido metacrílico, y pobres funcionalización de PEG resultará.

Por lo tanto, uno de los pasos más importantes que se pueden tomar para asegurar metacrilación exitosa del PEG o péptido es mantener anhidrocondiciones de reacción de Rous. El paso recomendado de secar el material de vidrio antes de su uso se destina a prevenir la contaminación del agua. La presencia de agua en la muestra se puede ver en el análisis de RMN, como un pico ancho a 1,7 ppm (Figura 4). Si se observa pobres metacrilación incluso después de secar el material de vidrio, los productos químicos se pueden secar sobre sulfato de sodio u otros agentes de secado (tamices moleculares, etc) antes de su uso. La destilación también se puede utilizar para eliminar el agua y purificar anhídrido metacrílico antes de su uso, y la destilación azeotrópica se puede utilizar para secar PEG 23. En casos extremos, la síntesis puede llevarse a cabo en una caja de guantes para garantizar más adecuadamente las condiciones anhidras. Una segunda ronda de metacrilación, siguiendo el mismo procedimiento, también se puede realizar para aumentar funcionalización. Porque siempre hay una posibilidad de que se requerirán rondas adicionales de funcionalización, se debe tener cuidado en el paso 1.7 y 1.9 para recoger rápidamente PEGDM por filtración al vacío. La filtración al vacío durante más tiempo del absolutamente necesario aumenta la exposición de PEG al aire, lo que aumenta la posibilidad de que la absorción de agua.

A pesar de que el porcentaje de exceso de anhídrido metacrílico a los grupos funcionales hidroxilo se mantiene sin cambios, el aumento de la funcionalización de PEG (por ejemplo, el brazo #) en el precursor de PEG se asocia generalmente con una disminución en el porcentaje de funcionalización obtenidos (resultados no publicados, de laboratorio Benoit). Para abordar preventivamente esta reducción en la eficiencia de funcionalización, o si se encuentran dificultades particulares lograr suficientemente alta funcionalización, la duración de la reacción de microondas se puede aumentar, a condición de que el intervalo de microondas se mantiene a 30 seg. Mientras exceso molar de 10 es típicamente suficiente, la cantidad de anhídrido metacrílico utilizado en la reacción también se puede aumentar para aumentar el porcentaje de funcionalización alcanzado 12.

Es importante que eletapa de precipitación adicional (1.9) puede realizar para lograr buenos señales de RMN. Si bien es tentador para llevar a cabo la segunda precipitación el mismo día que la síntesis, el secado de la muestra durante la noche antes se ha encontrado reprecipitación para ayudar a la eliminación del exceso de anhídrido metacrílico y ácido metacrílico. Preparación de la muestra también es importante para el logro de los espectros de RMN limpio, y por lo tanto, las muestras deben prepararse utilizando las condiciones recomendadas. Figura 4 demuestra representativos 1 resultados H-RMN para funcionalizado correctamente PEGDM. Mediante el análisis de la relación de protones metacrilato terminales a centrales protones PEG, el PEGDM estaba decidido a ser funcionalizado adecuadamente. Preparación de la muestra MALDI es igualmente importante para lograr una lectura clara. MALDI es particularmente sensible a la presencia de sales y las altas concentraciones de la muestra. Si un MALDI clara lectura (una intensidad por encima de 50 unidades arbitrarias (UA) con una señal de alta: ruido) no se puede conseguir, la muestra slución debe ser diluido 1:100 en MALDI disolvente antes de combinarse con la solución de matriz y volverse a analizar. La Figura 5 muestra los resultados de MALDI-TOF representativos después de funcionalización correcta péptido, la escisión, y preparación de la muestra. La escisión de una pequeña muestra de resina antes de la funcionalización (Figura 5A) muestra correcta síntesis de la GKRGDSG péptido, con funcionalización metacrilamida correcta del péptido se muestra en la Figura 5B.

Mientras que la funcionalización de los péptidos sobre resina es un procedimiento relativamente robusta, las condiciones de escisión requeridas para cada secuencia a menudo requiere la sintonización. Para las secuencias largas en las que muchos aminoácidos han protegido las cadenas laterales (> 30 aminoácidos de longitud, o> 15 aminoácidos con grupos de protección), la duración de la escisión se debe aumentar en una hora. Sin embargo, si el tiempo de escisión se extiende demasiado, la escisión del enlace péptido puede resultar debido a la exposición ácida a largo plazo. MALDI ana lisis puede ser muy útil para revelar los errores que se produjeron en la síntesis de péptidos o escote. Una disminución observada por debajo de los pesos moleculares esperados puede indicar que el ácido (s) amino no lo hizo correctamente pareja, o que el fraccionamiento péptido producido (ver Tabla 2 para las fuentes de los cambios observados comúnmente en el peso molecular). Si el peso molecular observado es mayor de lo esperado por el peso de un grupo protector utilizado, es probable que la escisión y desprotección eran insuficientes y el péptido se deben recleaved de tiempo adicional.

x; "> Cambio MW (g / mol) <td style = "width: 64px;"> 24 dth: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" altura: 20px; ancho: 103px; "> Tyr
Aminoácidos borrado Cambio MW (g / mol) Protecting Groups no escindido Los iones comúnmente presentes Cambio MW (g / mol)
Ala -71 Acetilo 42 Cl - 35
Arg -158 Alilo 40 K + 39
Asn -114 Alloc 85 Mg 2 +
Áspid -115 Boc 100 De Na + 23
Cys -103 Fmoc 223
Gln -128 OtBu 56
Glu -129 Pbf 252
Gly -57 tBu 56
Su -137 Trt 242
Ile -113
Leu
Lys -128
Met -131
Phe -147
-97
Ser -87
Thr -101
Trp -186
-147
Val -99

Tabla 2. Observa con frecuencia cambios en el péptido de peso molecular.

Los macrómeros producidos utilizando métodos metacrilación asistidas por microondas se pueden utilizar en un número de la medicina regenerativa o aplicaciones de administración de fármacos. Los péptidos funcionalizados y PEGDM sintetizados aquí también se pueden incorporar en polímeros utilizando nitróxido mediada por polimerización (NMP), Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) o reversible AddiTransferencia ción-fragmentación (RAFT) métodos 24. Redes de hidrogel también se pueden producir en presencia de las células, como se ha demostrado previamente en el artículo JoVe por Khetan y Burdick 22. Esto a menudo requiere la incorporación de péptidos de adhesión celular tales como RGD o moléculas de la matriz extracelular, como PEG solo no proporciona las interacciones célula-material crítico para la supervivencia y la función de algunos tipos de células 25. Los péptidos, por ejemplo, se pueden sintetizar utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida tradicional y funcionalizados como se describe aquí para permitir la incorporación en redes de hidrogel. Como se ve en la Figura 6, la inclusión de la adhesión celular péptido metacrilamida-funcionalizado GK RGDS G en hidrogeles (0,5 mM) facilita la adhesión de las células madre mesenquimales humanas (MSCs) a las superficies de hidrogel de PEG, el aumento del número de células adjunto y propagación (Figura 6B ), en comparación con PEG hidrogeles sin el péptido de adhesión celular ( 26. Para incorporar este espaciador de PEG y evitar interacciones no específicas, los péptidos pueden conjugarse con monofuncionalizado de PEG a través de N-hidroxisuccinimidilo activado ésteres, tal como se describe por Hern y Hubbell 26.

Aplicaciones de las redes de hidrogel requieren un estricto control sobre las propiedades del material. Una ventaja significativa de hidrogeles de PEG es un alto grado de control sobre estas propiedades. Por ejemplo, el peso molecular, el brazo número, y el% en peso de PEG utilizado en la formación de redes de hidrogel se puede alterar para ajustar con Tunpropiedades electrónicas para aplicaciones específicas. Esto permite un estricto control sobre hidrogel tamaño de malla (ξ), que controla hidrogel relación de hinchamiento (Q) y la rigidez (módulo de elasticidad, E). Esto se ilustra en la Figura 7A y se cuantifica en la Figura 8, donde el aumento de PEG resultados macrómeros de peso molecular en un aumento de tamaño de malla de hidrogel (Figura 8A) y una disminución en la rigidez de hidrogel (Figura 8B).

La característica física subyacente que controla el comportamiento mayor en estas redes de hidrogel, tamaño de malla, se calcula utilizando la ecuación de Flory-Rehner 16. Para realizar este cálculo, la relación de hinchamiento volumétrico (Q) se calcula primero a partir de la ecuación 4:
Ecuación 4 (4)

donde ρ s es la densidad del agua (1 g / ml), ρ es la densidad p de PEG (1,12 g / ml), H s es masa hinchada del hidrogel y M D es la masa seca del hidrogel (a menudo se mide después de la congelación y liofilización de los hidrogeles). El peso molecular entre reticulaciones (M C, en g / mol) se calcula entonces a partir de la ecuación 5:
Ecuación 5 (5)

donde M N es el promedio en número MW de PEG (en g / mol), Ecuación 5.05 es el volumen específico del polímero Ecuación 5.1 , V 1 es el volumen molar del agua (18 ml / mol), V 2 es la fracción de volumen de polímero de equilibrio del hidrogel
( Ecuación 5.2 ), Y X 1 16. El número de enlaces entre entrecruzamientos (n) se calcula a partir de la ecuación 6:
Ecuación 6 (6)

donde N b es el número de enlaces en la repetición de PEG (3) y M r es el MW de la repetición de PEG (44 g / mol) 27. Esto permite que la distancia de la raíz cuadrada media de extremo a extremo de la cadena polimérica Ecuación 6.1 (En nm) que se calcula a partir de la ecuación 7:
Ecuación 7 (7)

donde l es la longitud media de enlace (0.146 nm, calculado sobre la base de CC y CO longitudes de enlace) y C n es la relación característica del polímero (4.0 para PEG) 28. FiFinalmente, el tamaño de malla del hidrogel se puede calcular de la ecuación 8:
Ecuación 8 (8)

Propiedades de hidrogel de manera similar se pueden ajustar mediante el ajuste de la cantidad de PEG utilizado en la formación de hidrogeles. Disminuyendo el porcentaje en peso de los resultados de macrómeros de PEG en un aumento en el tamaño de malla de hidrogel, lo que reduce posteriormente la rigidez de hidrogel. Figura 7B ilustra y la Figura 9 cuantifica como el porcentaje en peso de PEG utilizado en la formación del hidrogel se puede utilizar para controlar el tamaño de malla (Figura 9A) y la rigidez de hidrogel resultante (Figura 9B). Como la rigidez sustrato se ha demostrado que afectan a los comportamientos celulares, tales como diferenciación de células madre 29, la capacidad de controlar estrechamente la rigidez es una característica importante en la fabricación de hidrogel.

Los hidrogeles también se pueden utilizar para CONTRla administración de fármacos ol. Como se ilustra en la Figura 7A y demostrado en la Figura 10, el aumento del peso molecular de los macrómeros de PEG aumenta el tamaño de malla de la red de hidrogel, aumentando posteriormente la liberación de fármaco modelo encapsulado, albúmina de suero bovino (BSA). Mientras que las muestras de hidrogel en este estudio fueron destruidos en t = 195 horas para permitir la medición de hidrogel de masas húmedas y secas para los cálculos del tamaño de malla, es nuestra experiencia que siguió la liberación de BSA ocurriría habían incubado las muestras durante períodos de tiempo más largos. La liberación incompleta de BSA al observado en la Figura 10 no es inesperado, como otros grupos también han informado de que la BSA es resistente a la difusión dentro de las redes de hidrogel de PEG 30. Liberación incompleta de la proteína encapsulada puede ocurrir debido a enlaces de hidrógeno entre las proteínas y los macrómeros de PEG, o la unión entre el grupo metacrilato en el PEG y los grupos amino primarios en los residuos de lisina en BSA al 31 covalente (Figura 2A), también es posible que una fracción de la de BSA encapsulado está contenido en las regiones del hidrogel que tiene malla significativamente más pequeños tamaño que el promedio general dentro del gel, evitando su liberación. Mientras que se observó, de liberación nonFickian incompleta (datos no mostrados) de encapsulado de BSA en este caso, la liberación controlada de Fick de numerosos otros fármacos modelo, incluyendo la insulina y la ovoalbúmina, se ha demostrado usando PEGDM similares hidrogeles 30. Además, Watkins y Anseth han utilizado microscopía confocal de barrido láser para demostrar que la liberación de moléculas fluorescentes de hidrogeles similares se modela aceptablemente con la difusión de Fick míthods 32.

Mientras que los hidrogeles formados en este estudio no son degradables, la degradación de la red es otro parámetro que puede ser incorporado en y afinado dentro de estas redes. Proporcionar para la degradación controlada de hidrogel puede dar lugar a alteraciones en el comportamiento celular 33, la promoción de crecimiento de tejido o huésped crecimiento de tejido, o la eliminación de la necesidad de explantación 34. Hidrogeles de PEG degradables son comúnmente sintetizados por apertura de anillo d hidrolíticamente degradable, l-láctico, glicólico o grupos ε-caprolactona en grupos hidroxilo dentro PEG antes de metacrilación 35. Estos tres grupos se degradan por hidrólisis de funcionalidades de éster, con los ésteres de glicólido que tiene la mayor susceptibilidad a la degradación, seguido de lactida, y éster de caprolactona, debido a su variación de la hidrofobicidad. Después de la incorporación de grupos hidrolíticamente degradables, el PEG se puede funcionalizar adicionalmente usando el procedimiento metacrilación detaileD en este artículo, lo que permite la formación de redes de hidrogel a través de la polimerización en cadena iniciada por radicales posterior 36,37. La tasa de degradación de las redes de hidrogel se puede controlar mediante la variación de la identidad del grupo hidrolíticamente degradable (glicolida, lactida, etc) y variando el número de repeticiones degradables incorporados a la estructura 35,38.

Teóricamente, los métodos demostrados aquí se podrían utilizar para la acrilación de PEG y péptidos mediante la sustitución del anhídrido metacrílico con anhídrido acrílico en los pasos 1.3 y 3.3, respectivamente. Sin embargo, anhídrido acrílico es más de 20 veces el coste de anhídrido metacrílico 39,40, haciendo acrilación asistida por microondas significativamente menos atractiva que metacrilación asistida por microondas.

Hemos demostrado un método simple y rápido para funcionalizar PEG y péptidos, la forma de evaluar la eficacia de este procedimiento, y teniendo en cuenta los recursos para ucantan los materiales sintetizados para formar redes de hidrogel. Estas herramientas sintéticos son muy versátiles en sus aplicaciones, y deben demostrar un elemento básico en cualquier número de laboratorios de investigación de entrega de materiales y medicamentos.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado en parte por una beca Howard Hughes Med-en-Grad (AVH), con fondos iniciales proporcionados a la Dra. Danielle Benoit de la Universidad de Rochester y la Fundación de Investigación y Educación Ortopédica / Trasplantes Musculoesqueléticos Foundation (OREF / MTF). Los autores desean agradecer al Dr. James L. McGrath para el uso de su equipo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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References

  1. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
  2. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
  3. Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
  4. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
  5. Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
  6. Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
  7. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  8. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
  9. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
  10. Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
  11. Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
  12. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
  13. Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35, (94), 3243-3250 (1994).
  14. Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
  15. Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
  16. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
  17. Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. 2774-2776 (2006).
  18. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. (2012).
  19. Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. (2013).
  20. Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
  21. Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis - a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
  22. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
  23. Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. (2012).
  24. Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
  25. Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
  26. Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
  27. Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
  28. Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
  29. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  30. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
  31. Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
  32. Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
  33. Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
  34. Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
  35. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
  36. Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
  37. Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. (2013).
  38. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
  39. Methacrylic Anhydride [Internet]. Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013).
  40. Acrylic Anhydride [Internet]. Available from: http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/ (2013).

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