In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Neuroblast migrasjon er en grunnleggende hendelse i postnatal neurogenesis. Vi beskriver en protokoll for effektiv merking av neuroblasts ved in vivo postnatal elektroporering og påfølgende visualisering av deres migrasjon ved hjelp av time-lapse avbildning av akutte hjernen skiver. Vi inkluderer en beskrivelse for kvantitativ analyse av neuroblast dynamikk av video sporing.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (81), e50905, doi:10.3791/50905 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Subventricular sone (SVZ) er en av de viktigste nevrogene nisjer i barsel hjernen. Her, nevrale stamceller spre seg og gi opphav til neuroblasts stand til å bevege seg langs rostral migrasjonsstrømmen (RMS) mot luktelappen (OB). Dette langdistanse migrasjon er nødvendig for etterfølgende modning av nyfødte nerveceller i OB, men de molekylære mekanismene som regulerer denne prosessen er fortsatt uklart. Gransker signalveier kontrollerende neuroblast motilitet kan ikke bare bidra til å forstå en grunnleggende trinn i neurogenesis, men også ha terapeutisk regenerativ potensial, får muligheten til disse neuroblasts å målrette hjernen områder rammet av skader, hjerneslag, eller degenerasjon.

I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert protokoll for in vivo postnatal elektroporering og påfølgende time-lapse avbildning av neuroblast migrasjon i muse RMS. Postnatal elektroporering kan effektivt transfektere SVZ stamfarceller, som i sin tur genererer neuroblasts migrere langs RMS. Bruke konfokalmikroskoper spinne disk time-lapse mikroskopi på akutte hjerne skive kulturer, kan neuroblast migrasjon overvåkes i et miljø tett ligner in vivo tilstand. Videre kan neuroblast motilitet spores og kvantitativt analysert. Som et eksempel, beskriver vi hvordan du bruker in vivo postnatal elektroporering av en GFP-uttrykke plasmid å merke og visualisere neuroblasts trekkende langs RMS. Electroporation av shRNA eller CRE rekombinase-uttrykke plasmider i betingede knockout mus som anvender LoxP systemet kan også brukes til å målrette gener av interesse. Farmakologisk manipulering av akutte hjernen skive kulturer kan utføres for å undersøke hvilken rolle ulike signalmolekyler i neuroblast migrasjon. Ved kopling in vivo electroporation med time-lapse bildebehandling, håper vi å forstå de molekylære mekanismene som styrer neuroblast motilitet og bidra til å utvikleling av nye tilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.

Introduction

I pattedyrhjernen, oppstår generering av nye nerveceller (neurogenesis) etter fødselen hovedsakelig i to regioner, subventricular sone (SVZ) av den laterale ventriklene og subgranular sone i dentate gyrus av hippocampus en. Betydelig bevis samlet i de siste årene støtter en avgjørende rolle for postnatal neurogenesis i hippocampus og luktelappen minnefunksjoner 1-3. Viktigere, har postnatal neurogenesis også terapeutisk potensial på grunn av sitt forhold til degenerative nevrologiske lidelser, og evnen til neuroblasts å migrere til skadde områder i hjernen 4-6.

Subventricular sone (SVZ) har nylig dukket opp som en avgjørende nevrogen nisje. SVZ-avledet neuroblasts migrere mot luktelappen (OB) via rostral migrasjonsstrømmen (RMS), noe som gjør dette den lengste migreringsprosessen i postnatal hjernen 1,7,8. Pattedyr SVZ / RMS / OB-systemet har blitt ennyttig modell for å studere forskjellige trinnene i neurogenesis, for eksempel proliferasjon, migrering og differensiering 1,8. Mange vekstfaktorer og ekstracellulære signaler regulerer SVZ neurogenesis og migrasjon langs RMS, men den intracellulære molekylære mekanismene er langt fra å være fullt ut forstått 1,9. Riktig migrasjon langs RMS er avgjørende for den videre modning av nyfødte nerveceller 10. I tillegg har noen studier vist at SVZ-avledet neuroblasts kan migrere ut av RMS til hjerneskade sider 4-6,11-13. Således undersøkte signalmekanismer regulerings neuroblast migrasjon er grunnleggende ikke bare å forstå neurogenesis men også for potensielle terapeutiske applikasjoner.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å merke SVZ nevrale stamceller ved in vivo postnatal elektroporering og overvåke deres migrasjon langs RMS i akutte hjernen skive kulturer ved hjelp av time-lapse roterende disk confocal mikroskoppy. Electroporation er mye brukt i utviklingsstudier fra embryonale til voksne stadier 14-18. Det er et kraftig verktøy for å målrette og manipulere SVZ nevrale stamceller og representerer et billigere og betydelig raskere alternativ til stereotaktisk injeksjon av virale vektorer eller generering av transgene modeller 1,15,19,20. Det er en relativt enkel fremgangsmåte som ikke krever kirurgi, og har høy overlevelse. Electroporation av shRNA eller CRE rekombinase-uttrykke plasmider i muse genetiske modeller anvender LoxP systemet kan brukes til å målrette gener av interesse eller for å oppnå permanent merking av SVZ stamfedre, og dermed representerer et nyttig verktøy for voksne neurogenesis studier 21,22.

Imaging RMS neuroblast migrasjon i intakt hjernen er fortsatt utfordrende på grunn av tekniske begrensinger. Imidlertid kan denne prosessen overvåkes ved hjelp confocal roterende disk time-lapse mikroskopi av akutte hjernen skiver, som gir en passende system tett ligner in vivo tilstanden også mottagelig for farmakologisk manipulasjon 23,24. Coupling in vivo postnatal elektroporering med time-lapse bildebehandling vil lette forståelsen av de molekylære mekanismer som styrer neuroblast motilitet og bidra til utvikling av nye tilnærminger for å fremme hjernen reparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne fremgangsmåten er i samsvar med de britiske hjemmekontoret Regulations (Animal vitenskapelige prosedyrer Loven, 1986). Forskere skal følge de retningslinjer som er fastsatt og godkjent av deres institusjonelle og nasjonale dyre regulatoriske organisasjoner.

En. Postnatal Electroporation

1.1. Utarbeidelse av Glass Kapillærer, DNA Solution og Electroporator

  1. Forbered trukket glass kapillærer (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) for DNA-injeksjon. (Veiledende innstillinger for en Sutter P-97 kapillær avtrekker er: Heat 283, Pull 50, Velocity 90; Tid 50). Lag et merke på kapillær svarende til et volum på omtrent 2 pl.
  2. Still spenningen til electroporator til fem kvadrat pulser, 50 msek / puls på 100 V, med 850 msek intervaller (100 V, ON 50 msek puls, puls OFF 850 ​​msek, puls 5).
  3. Fortynn med høy renhet (OD 260/280> 1.80) endotoxin-fritt plasmid DNA til en endelig konsentrasjon på 1-2 pg / mLmed endotoksiner Tris-EDTA buffer eller PBS. Det anbefales å legge 0,1% Fast Grønn til DNA-løsningen (fargestoff bør spres i ventrikkelen når vellykket injisert).
  4. Forbered 5-7 mm elektroder, elektrode gel og varme opp varmeputen.

1.2. Electroporation

  1. Fjern en postnatal dag to mus valp fra buret og bedøve den ved isofluran innånding (til en strøm av ~ 0,6 l / min).
  2. Etter omtrent 1 min, bestemmer tilstanden til anesthetization ved hjelp av foten klemme respons. Hvis ingen bevegelse oppstår, fortsett med intraventrikulær injeksjon.
  3. Load kapillær nål med 1-2 pl av DNA ved hjelp av en aspirator rør som er koblet til kapillarrøret.
  4. Under en kald lyskilde, holder hodet på valpen mellom tommelen og pekefingeren på den mindre dominerende hånd. Litt trekke huden bak på hodet for å hjelpe identifiseringen av den rette injeksjonspunktet.
  5. Betrakt en virtuell linje mellom øyet og than craniometric landemerke lambda (figur 1A). Sett kapillær nålen på omtrent en tredjedel av lengden av denne linje fra lambda (ca. 1 mm fra linjen midtpunkt) 15. Sett kapillær om 2 mm dype, og pass på å unngå dyp penetrasjon i hjernen.
  6. Injiser plasmid ved å blåse langsomt gjennom munnen (en sprøyte koblet til kapillær kan også brukes). Under denne prosedyren, pass på at fingrene ikke bruke for mye press på hjernen, da dette kan hindre vellykket plasmid injeksjon.
  7. Stopp injeksjon når en minimal mengde av DNA-løsningen som er igjen i kapillarrøret. Det er tilrådelig å injisere mindre enn 1 mL å unngå skadelig økning av intrakranialt trykk.
  8. Coat begge elektroder med gel og plassere dem med den positive siden på den laterale side av halvkulen hvor DNA ble injisert (figur 1A). For DNA inkorporert i rostral SVZ, sted elektroder litt rostral tilinjeksjonspunktet. Varierende elektrode posisjon kan oppnå regional spesifisitet av elektroporering i ulike områder av SVZ 22,25.
  9. Initiere strømovergang ved å trykke på pulsen fotbryterpedalen. Når elektroporering er fullført, sjekk spenningen på electroporator skjerm (spenningsverdier bør ikke være under 90 V, ettersom lavere spenningsverdier korrelerer med dårlig electroporation effektivitet).
  10. Reanimate valpen etter oksygen på varmepute for noen få minutter, og returnere det til buret, plassere den vekk fra moren. Pass på at mor henter valpen og gjenforener den med resten av kullet. Etter elektroporering, la unger med sin mor for 4-7 dager før neste trinn.

2. Utarbeidelse av Akutt Brain skive kulturer

2.1. Utarbeidelse av løsninger og verktøy

  1. Følgende løsninger er nødvendig (det er også mulig å bruke høy-glucose DMEM for å dissekere og avbildning17):
    Disseksjon Medium (500 ml)
    Gey balanserte media - 500ml
    45% Glukose - 5ml
    Film Medium (10 ml)
    45% Glukose - 0.110 ml
    HEPES en M - 0,100 ml
    Pen / Strep - 0,100 ml
    FCS - 0,500 ml
    B27 - 0,100 ml
    Glutamin - 0,200 ml
    Dulbeccos Modified Eagle Medium (fenol rød-fri) - 8,89 ml
  2. Varm opp film medium ved 37 ° C.
  3. Plasser Millicell setter inn en 35 mm glassbunn kultur fatet inneholder en ml av filmmediet, og plasser i en fuktet inkubator ved 37 ° C / 5% CO 2.
  4. Forbered vibratome tilbehør (skrutrekker, kammer, barberblader, lim).
  5. Forbered Disseksjonsverktøyer: saks, liten slikkepott, rette tang.
  6. Forbered verktøy for håndtering av skiver: liten pensel eller myk inoculating sløyfe (størrelse: 10 mL), plast Pasteur pipetter, en isboks og flere 6 cm plast retter.
  7. Precool disseksjon medium2-4 ° C.

2.2. Utarbeidelse av hjernen skiver

  1. Fyll en 6 cm tallerken med forkjølt disseksjon medium og legg det på is (for å holde nyklipt skiver).
  2. Etter halshugging, bruke saks til å halshogge musen valp. Ta av hodebunnen med en skalpell, skjære skallen langs midten av sagittal suturen fra OB til lillehjernen og forsiktig fjerne kranie klaffer med tang. Sørg for at hele hjernen er utsatt og nøye dissekere den ut med en slikkepott, og legg spesielt vare for ikke å skade vevet. Disseksjonen må gjøres forsiktig, men på samme tid meget hurtig (mindre enn ett minutt hvis mulig). Livmorhals forvridning er vår foretrukne metoden fordi terminal anestesi med legemidler / gassanestesimidler kan påvirke trekk egenskapene til neuroblasts og sunn tilstand av hjernen skive kulturer, som trenger å bli fotografert relativt raskt etter dyreofringer.
  3. Hemisect hjernen med et razeller bladet (fig. 2). Kast uninjected halvkule eller bruke til andre eksperimenter.
  4. Plasser en liten tapebit på vibratome holderen og bruker minimalt med nødvendig mengde lim til å feste hjernen halvkule på toppen av det (figur 2). Dette hindrer skade på holderen overflaten på grunn av gjentatte lim anvendelser.
  5. La limet tørke i noen sekunder.
  6. Plasser holderen i vibratome brett fylt med forkjølt disseksjon løsning. Pek luktelappen mot bladet (figur 2).
  7. Begynne å skjære i hjernen halvkule ved hjelp av egnede innstillinger. Følgende parametere anbefales: slice tykkelse 300 mikrometer, fart ~ 3-5; frekvens ~ 9. Høy frekvens og lav hastighet er anbefalt for å forhindre skade på skive.
  8. Samle skivene ved hjelp av en liten pensel eller en myk inoculating loop. Bare holde skiver med synlig OB (vanligvis 2-3 skiver / hjerne). Typisk ca stykket som inneholder det meste av RMSn finnes på ~ 300 mikrometer fra bunnflaten.
  9. Sjekk skiver under en standard fluorescerende mikroskop for GFP signal (og pass på å snu dem over til å sjekke fluorescens på begge sider), og velge de som viser lyse fluorescens langs det meste av RMS.

2.3. Dyrking Brain Slices

  1. I en cellekultur hette, skjære bort de mest caudal tredjedel av hjernen skive og fjern eventuelle lim spor med fint rette pinsett eller en microdissection skalpell.
  2. Delikat aspirer stykke ved hjelp av en plast Pasteur pipette (kutte spissen av pipetten for å lage en større åpning, vil dette unngå skade på skive) og plassere den på midten av en forvarmet Millicell innsats.
  3. Pass på at siden med den lyseste fluorescerende signal er plassert i kontakt med Millicell sette inn (for bildebehandling med en invertert mikroskop).
  4. Fjern overskudd disseksjon løsningen på toppen av innsatsen med en pipette.
  5. La skive kulturer tilslå seg ned i en 37 ° C / 5% CO2-inkubator i det minste i 1 time før avbildning.

Tre. Time-lapse Imaging av neuroblast Migration

  1. Minst to timer før bildebehandling, slå på Perkin Elmer UltraViewVoX confocal roterende disk system, invertert Nikon Ti-E mikroskop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) avkjølt digital CCD kamera, og varmesystem (Solent Scientific) innstilt på konstant temperatur på 37 ° C.
  2. Åpne Volocity programvare Acquisition modul og klikk på "Viz"-knappen og velg laser (s) for bildebehandling.
  3. Innen to timer av hjernen skive forberedelse, plassere glassbunn fatet inneholder hjernen skive i bildekammeret på mikroskopet scenen.
  4. Bruk en Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 Målet etter passende fluorescerende lys til å velge og fokusere området av stykket som skal avbildes (f.eks den første synkende del av RMS like etter injeksjonsstedet, eller Elbow region av RMS, eller like etter albuen før neuroblasts inn OB).
  5. Sett opp time-lapse bildebehandling med følgende tiltak:
    1. På mikroskopet, klikk på L100-knappen for å tillate laserskanning av prøven.
    2. I Volocity, åpne Ultra Laser Changer ved å velge riktig laser (f.eks 488 nm laser for GFP).
    3. Sett eksponeringstiden (vanligvis mellom 100 til 500 msek), og laserintensiteten (som regel 20-30%), avhengig av intensiteten av fluorescenssignalet.
    4. Juster bilde digital gevinst å forbedre celle visualisering.
    5. Velg z-stack intervallet til bildet inne i hjernen skive (vanligvis over en 100-120 mikrometer intervall). Velg et intervall med et passende antall isolerte celler for å unngå mulig overlapper så mye som mulig, (dette vil lette den etterfølgende relativ-analyse).
    6. Velg avstanden mellom hver z-stabel bilde (vanligvis 2-4 um).
    7. Velge tid interval mellom hver z-stack fangst (f.eks 3 min) og den totale bildebehandling varighet (f.eks 3 timer).
    8. Klikk på "lagre"-ikonet for å lagre endringene i bildeparametere.
    9. Trykk på opptaksknappen for å starte bilde.
  6. Alternativt avbilding av kontroll-og forsøksprøver (for eksempel kjøretøy / medikamentbehandling eller forskjellige electroporated plasmider) gjennom den samme dagen.

4. Analysere neuroblast Migrasjon

  1. I Volocity Kvanitifisering modul, åpner det ønskede bibliotek opprettet etter å ha fullført en time-lapse eksperiment. Velg "Extended Focus" fra øverst til venstre (Figur 4A, trinn 1).
  2. Klikk på "Mål"-kategorien for å vise målingen vindu (Figur 4A, trinn 2).
  3. En liste over oppgaver er synlig nederst til venstre på skjermen. Dra "Track" (til stede under "Diverse" overskriften på bunnen avlisten) på plassen over. Dette vil be åpningen av et nytt vindu som heter "Spor" øverst til venstre delen av skjermen (Figur 4A, trinn 3).
  4. Velg "Points" fra "Input"-fanen i Track vinduet (Figur 4A, trinn 4).
  5. Klikk på Point Tool (Figur 4A, trinn 5).
  6. Begynne å spore den utvandrende neuroblast ved å klikke med musen på de sentrale delene av cellen kroppen og holde sporing cellen bevegelsen til siste tidspunkt for time-lapse er nådd (for eksempel punkt nummer 61 for en tre timers lang film) .
  7. For å få data velg "Make Måling Item" fra Målinger Meny (Figur 4B, trinn 6-7). Et vindu vil dukke opp på midten av skjermen.
  8. I dette vinduet velger du "En ny måling element kalt:" og skriv et navn (Figur 4C, trinn 8). Husk å velge "Alle tidspunkter" alternativet før prEssing OK (Figur 4C, trinn 9). En måling element fil vil vises under time-lapse-fil og vil inneholde parametere for kvantitativ analyse (f.eks migrasjon avstand, hastighet, fortrengning, og forskyvning rente).
  9. Dobbeltklikk på målingen element filen for å åpne den som et vindu (Figur 4D, trinn 10).
  10. For å visualisere enkeltspor av analyserte celler, velg "Belte Point" fra "Vis" alternativene (Figur 4D, trinn 11).
  11. Høyreklikk på målingen Element-filen og eksportere den som en tekstfil, som deretter kan importeres i programmer som Excel til å analysere migrasjons parametere.
  12. For å måle bevegelser mellom påfølgende rammer og pauser laget av hver celle under filmingen periode, for Oppmåling Element fil velger fra "Vis" alternativer "Point" eller "pasientgrupper" og klikk på ID (hvert spor har en unik ID). Eksportere den resulterende filen ved å fortsetteing som beskrevet i trinn 4.10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Merking av SVZ-avledet trekkende neuroblasts kan observeres langs RMS, vanligvis 4-8 dager etter en vellykket electroporation (Figur 1B). Lengre tidspunkter kan også velges, men færre celler vil bli funnet i RMS siden de fleste av dem vil ha kommet inn i OB. Neuroblasts begynne å anskaffe typiske morfologi og funksjoner av modne granule celler i OB rundt 2-3 uker etter elektroporering (ikke vist). Etter dyrkning for ~ 1 hr, kan hjernen skiver fra electroporated museunger bli pålitelig avbildes i opptil 3-4 timer. Som tidligere rapportert 23,26, kan neuroblasts vise komplekse migrasjons dynamikk (figur 3 og Video 1), som kan være kvantitativt analysert ved hjelp av cellesporing (figur 4).

Figur 1
Figur 1. Postna tal in vivo electroporation. (A) Skjematisk tegning av in vivo electroporation av en postnatal dag to muse valp. En stiplet linje (rød) som forbinder øyet til craniometrical landemerke lambda fungerer som en posisjonsmarkør for kapillær innsetting. Injeksjonspunktet er indisert som en grønn prikk. Grå ovale former indikerer elektrode posisjon som beskrevet i Boutin et al. 15 (B) Sagittal mus forhjerne skive immunostained for GFP fem dager etter elektroporering av en GFP-uttrykke plasmid. SVZ-avledet trekkende neuroblasts er synlige langs RMS, og noen av dem har begynt å komme til OB. CTX: cortex; SVZ: subventricular sone, RMS: rostral vandrende stream; OB: luktelappen. Bar, 400 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>

Figur 2. Skjematiske skritt i utarbeidelsen av akutte hjernen skive kulturer for bildebehandling. (A) Kaudal og intrahemispheric kutt (stiplede linjer) blir utført på en fersk dissekert hjernen. (B) Den electroporated hjernen halvkule er plassert på en vibratome holderen. (C) sagittal skiver innhentes med vibratome og observert under et standard fluorescerende mikroskop . skiver (D) med det beste signal GFP dyrkes i minst 1 time i en Millicell sette inne en glass-bunn fatet, og (E) deretter plasseres i et miljøkammer for avbildning av en invertert konfokal spinne disksystem. klikk her å se større bilde .

les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Time-lapse avbildning av trekkende neuroblasts. (A) Spinning disk tid-lapse bilder av neuroblasts tatt fra et muse sagittal hjernen skive fem dager etter elektroporering av en GFP-uttrykke plasmid. Bildene er en time fra hverandre. Hvert panel er en z-stack projeksjon av 28 etterfølgende bilder 4 mikrometer fra hverandre. Pilspisser indikerer fire representative neuroblasts trekkende langs RMS mot luktelappen (plassert ut av bildet nederst i høyre hjørne). (B) Representative trekkveier hentet fra time-lapse avbildning av de fire neuroblasts uthevet i (A). (C) Graf som viser avstanden migrert med tid ved to representative neuroblasts. Cellene vise en typisk saltatory bevegelige atferd. Bar, 70 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .


Figur 4. Sporing analyse av trekkende neuroblasts. Sekvensiell trinnene som brukes til å spore trekkende neuroblasts hjelp Volocity programvare. Vennligst se tekst for detaljert beskrivelse. Klikk her for å se større bilde .

Video 1:. Time-lapse avbildning av trekkende neuroblasts Filmen viser en del av muse RMS med GFP-merket trekkende neuroblasts innhentet fem dager etter elektroporering av en GFP-uttrykke plasmid. OB ligger ute av syne mot høyre hjørne. Confocal z-stabler ble tatt til fange på en roterende disk confocal med en 20X objektiv hver 3 min i 3 timer over en 120 mikrometer intervall. Spillehastighet: 10 bilder / sek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektiv migrasjon av nevrale stamceller langs RMS sikrer deres påfølgende modning i funksjonelle nerveceller 10. Prominent strømmer av nevrale stamceller rettet mot OB er synlige i menneskets barndom og vil trolig spille en viktig rolle i tidlig postnatal menneskelige hjernens utvikling 27. Dessuten, disse celler er i stand til å målrette områder av hjernen som påvirkes av skade og neurodegenerering 4,28. Å kunne overvåke i sanntid effekten av genmanipulering på neuroblast dynamikk blir viktig å fullt ut forstå hvordan neuroblast bevegelse er styrt og regulert.

Her har vi beskrevet en protokoll for å overvåke SVZ-avledet neuroblast migrasjon ved å koble in vivo postnatal elektroporering med time-lapse confocal roterende disk mikroskopi av akutte hjernen skive kulturer. Konkret har vi vist hvordan migrere nevrale stamceller kan merkes ved electroporating i SVZ et plasmid ENCoding GFP. Avhengig av formålet med undersøkelsen, kan flere typer plasmider som benyttes (f.eks tillater ekspresjon av andre fluorescerende proteiner eller ko-ekspresjon av villtype / mutante proteiner som er av interesse, CRE rekombinase, eller shRNA sammen med fluorescerende proteiner). Vi anbefaler på det sterkeste å bruke plasmider som inneholder kylling beta aktin CAG promoter 29 for in vivo uttrykk. Avbilding av hjernen skiver oppnådd fra electroporated dyr kan også brukes til å overvåke radial vandring av neural stamceller i OB ved lengre tidspunkter (7-10 dager) etter elektroporering 30.

Etter en innledende periode med praksis, blir in vivo postnatal elektroporering en svært pålitelig metode, slik robust neuroblast merking for både time-lapse bildebehandling og immunfluorescens analyse. Videre tilbyr denne teknikken en fundamental fordel over transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i henhold neuroblast spesifikke arrangører,der flertallet av neuroblasts er merket. Faktisk gjør elektroporering sparsom merking av neuroblasts, og dermed gir detaljert analyse av deres morfologi og migrasjonsdynamikken. Sammenlignet med den stereo levering av virale vektorer 31, er denne teknikken billigere, raskere og er svært godt tolerert av museunger. Den største ulempe består i det faktum at den er begrenset til tidlige postnatale stadier. Ja, vi anbefaler på det sterkeste å bruke postnatal dag to museunger, siden vi observert en betydelig nedgang i merking effektivitet på senere tidspunkt, når viral levering metoder blir mer egnet 31. Imidlertid kan strategier som elektroporering av CRE-uttrykke plasmider i passende mus genetiske modeller brukes til å studere neurogenesis i voksen stadier 22.

To-foton, kan standard confocal, roterende disk confocal, og bredt felt fluorescens mikros alle brukes til å visualisere neuroblast migrasjon 17,23,24. Spinning disk confocal mikroskopi er et billigere alternativ til to-foton mikroskopi. Den lar 3D avbildning ved høyere hastighet gjennom flere z flyene, noe som begrenser photobleaching sammenlignet med standard konfokalmikroskopi og tilbyr en høyere oppløsning enn bredt felt fluorescens bildebehandling 31-33. Flertallet av trekkende neuroblasts ha en klart synlig soma og et svært dynamisk ledende prosess tippet med en vekst kjegle.

Som beskrevet av andre 17, ville ha en perfusjon kammer tillater å vurdere virkningene av kontroll og medikamentelle behandlinger på samme hjernen skive direkte. Mens vi vurdere dette en viktig fordel, protokollen beskrevet her viser at det ikke er absolutt nødvendig for celle levedyktighet å perfuse skiver med oksygenrikt kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) eller høy glukose DMEM 17,33. Videre bruker en invertert mikroskop gir lettere objektiv manipulasjon i forhold til stående mikroskoper utstyrt med vann nedsenking mål.Vi fant at bruk av en 20X langdistanse målet er en optimal kompromiss, slik at sporing av et godt antall celler (vanligvis 25-40 per skive) og produsere gode oppløsning (Video 1). Automatisk sporing er også mulig, men det er ikke alltid pålitelige. Av denne grunn anbefales det visuelle og, om nødvendig, manuell bekreftelse av automatiske sporingsdata. Høyere forstørrelse avbildning av enkelt neuroblasts kan utføres ved hjelp av et Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W mål. Den fritt tilgjengelig ImageJ plugin MTrackJ kan også brukes til å måle grunnleggende spor statistikk 33, men noen rå datainnsamling filer kan være uforenlig med denne programvaren og kan trenge å bli konvertert til egnede formater for analyse, som i visse tilfeller kan være tidkrevende . Kombinasjonen av bilde oppkjøp og analyse moduler levert av Volocity programvaren tillater en umiddelbar overgang fra bilde tatt / behandling til kvantitativ analyse av trekkende parametermeterne (hastighet, fortrengning, osv.), som lett kan visualiseres i en rekke grafer (f.eks viser vandringsmønster / avstand / retningen / hastighet / utholdenhet / tidsbruk immobile, etc.).

Neuroblasts vise en saltatory bevegelse, alternerende trekkfugl til stasjonære faser 34,35 (Figur 3C). I lys av det faktum at stasjonære faser kan være mellom 4-10 min 32, mener vi at å ta bilder hver 3 min representerer et godt kompromiss for å følge migrere neuroblasts med minimum belysning og photodamage. Vi ser sjelden celler stopper for mer enn 6 min, og finner ut at, over en tre-timers periode, de vanligvis bruker i gjennomsnitt 30 min immobile. Ifølge tidligere rapporter, neuroblasts har en gjennomsnittlig hastighet på 60-100 mikrometer / t og en gjennomsnittlig meandrerende indeks (faktiske forskyvning over migrert avstand), litt over 0,6 23,36, noe som er i tråd med våre observasjoner. Typicalliert, ca 60% av cellene vise en "vandrende" atferd (for eksempel etter nesten lineære migrasjonsveier, med en buktende indeks mellom 0,6-1) og 20-25% er "utforskende" (med en buktende indeks mellom 0 til 0,4), mens de resterende ~ 20% kan klassifiseres som "middels" (alternerende trekkende og utforskende faser, med en buktende indeks mellom 0,4-0,6).

Vi erkjenner at det fortsatt begrensninger i denne teknikken, siden vi ikke kan filme neuroblasts for mer enn 3-4 timer uten å observere vesentlige endringer i deres bevegelighet. Film-varighet kan økes ved å senke avbildningsfrekvensen (men dette vil påvirke nøyaktigheten av migreringsanalyse), så vel som ved å anvende en perfusjon kammer for å optimalisere miljømessige forhold for avbildning. Imidlertid protokollen beskrevet her, inkludert en 3-4 timers periode avbildning representerer et passende kompromiss som muliggjør innsamling av tilstrekkelig data for kvantitativ analyse avmigrasjon. Faktisk, så langt vi har klart å oppdage de virkninger på migrasjon av protein overekspresjon / nedregulering 37 eller ved farmakologisk manipulasjon etter sammenligning med passende kontroller (Sonego og Zhou, upubliserte resultater).

I konklusjonen, kombinasjonen av in vivo postnatal elektroporering med spinning disk avbildning av hjernen skive kulturer representerer et kraftig verktøy for å overvåke dynamikken i neuroblast migrasjon i et system tett ligner in vivo miljøet, og tilbyr muligheten til å undersøke i dybden de molekylære mekanismer som styrer neuroblast motilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

MS og YZ støttes av KCL og KCL-Kina Doktorgradsstipend. MO ble finansiert av en Bioteknologi og Biological Sciences Research Council PhD student. Vi takker Masaru Okabe og Jun-ichi Miyazaki for PCX-EGFP plasmid og Alain Chedotal og Athena Ypsilanti for verdifulle råd om elektroporering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Millicell Millipore PICM0RG50
35 mm Glass bottom culture dish MatTek P35G-0-14-C
Gey's Balanced media Sigma G9779-500ML
Glucose, 45% Sigma G8769-100ML
HEPES Sigma H3375-25G
Pen/Strep GIBCO 15140-122
FCS GIBCO 10109-163
B27 supplement Invitrogen Life Technologies 17504044
L-Glutamine Invitrogen Life Technologies 25030-081
DMEM (phenol red-free) GIBCO 31053-028
Fast Green Sigma F7252-5G
Glass capillaries for injection Harvard Apparatus 30-0057
Aspirator tube Sigma A5177
Sutter P-97 capillary puller Sutter Instrument P-97
ECM830 Square Wave Electroporator Harvard Apparatus 45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mm Harvard Apparatus 45-0488
Footswitch Model 1250F Harvard Apparatus 45-0211
Gel for electrodes Cefar Compex 6602048
Isoflurane Merial AP/DRUGS/220/96
Vibratome Leica VT1000S
Glue Roti coll Roti coll 1
UltraViEW VoX spinning disk system Perkin Elmer Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera
Volocity software Perkin Elmer Acquisition, Quantitation, Visualization Modules
Environmental chamber for microscopy Solent Scientific Custom-made
Ti-E inverted microscope Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
  6. Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
  7. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
  8. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  9. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  10. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  11. Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
  12. Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
  13. Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  15. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
  16. Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
  17. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  18. Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
  19. dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
  20. Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
  21. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
  22. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
  23. Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  24. James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
  25. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
  26. Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
  27. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  28. Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
  29. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  30. Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  31. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
  32. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  33. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  34. Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
  35. Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
  36. Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
  37. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics