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Eterotopica ausiliario Ratto trapianto di fegato con flusso regolato Portal Vein arterialization in acuta insufficienza epatica

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Summary

Trapianto di fegato ausiliario fornisce un supporto temporaneo in insufficienza epatica acuta, fino a quando la rigenerazione del fegato fallire. Il trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) con arterialization vena porta (PVA) rende del fegato è sufficiente. Abbiamo sviluppato una tecnica analoga nel ratto, di esaminare l'influenza del arterialization vena porta sulla morfologia e la funzione del trapianto.

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Schleimer, K., Kalder, J., Grommes, J., Jalaie, H., Tawadros, S., Greiner, A., Jacobs, M., Kokozidou, M. Heterotopic Auxiliary Rat Liver Transplantation With Flow-regulated Portal Vein Arterialization in Acute Hepatic Failure. J. Vis. Exp. (91), e51115, doi:10.3791/51115 (2014).

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Abstract

Nel trapianto di fegato ausiliario insufficienza epatica acuta è un approccio alternativo interessante. L'obiettivo è quello di fornire un supporto temporaneo fino alla mancanza fegato nativo ha rigenerato. 1-3 Il APOLT-metodo, l'impianto ortotopico di segments- ausiliario evita la maggior parte dei problemi tecnici. Tuttavia, questo metodo richiede ampie resezioni sia del fegato nativo e l'innesto. 4 Nel 1998, Erhard ha sviluppato il trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) utilizzando arterialization vena porta (PVA) (Figura 1). Questa tecnica ha mostrato promettenti risultati clinici iniziali. 5-6 Abbiamo sviluppato un HALT-tecnica con PVA-flusso regolato nel ratto per esaminare l'influenza di PVA-flusso regolato sulla morfologia e funzione (Figura 2) trapianto.

Un trapianto di fegato ridotto al 30% della sua dimensione originale, è stato heterotopically impiantato nella regione renale destra del destinatario dopo espianto del rene destro.60; La vena cava infra-epatica dell'innesto è stata anastomizzata con la vena cava infraepatica del destinatario. La arterialization della vena porta del donatore è stata effettuata attraverso l'arteria renale destra del destinatario con la tecnica dello stent. La regolazione del flusso sanguigno della vena porta arterializzato è stato ottenuto con l'uso di uno stent con un diametro interno di 0,3 mm. Il tronco celiaco dell'innesto era end-to-side anastomizzato con aorta del destinatario e il dotto biliare è stato impiantato nel duodeno. Una resezione subtotale del fegato nativo è stata eseguita per indurre insufficienza epatica acuta. 7

In questo modo sono stati eseguiti 112 trapianti. Il tasso di sopravvivenza perioperatoria è stata del 90% e il tasso di sopravvivenza di 6 settimane è stata dell'80%. Sei settimane dopo l'intervento, il fegato nativo rigenerato, mostrando un aumento di peso da 2,3 ± 0,8 g di 9,8 ± 1 g. In questo momento, il peso del graft è diminuito da 3,3 ± 0,8 g di 2,3 ± 0,8 g. Siamo stati in grado di ottenere risultati promettenti a lungo termine in termini di morfologia e funzione del trapianto. HALT-PVA con flusso regolato colma affidabile insufficienza epatica acuta fino a quando il fegato nativo rigenera.

Introduction

Insufficienza epatica acuta pone un problema grave in medicina clinica che porta a un tasso di mortalità del 60-80%. 8 In caso di insufficienza epatica acuta, trapianto di fegato ausiliario è una terapia alternativa promettente per colmare la fase acuta. Il fegato nativo è lasciato per rigenerare e segue alla rigenerazione dei farmaci immunosoppressione possono essere sospesi. Come conseguenza l'innesto diventerà atrofica. Tuttavia, la tecnica operatoria per il trapianto di fegato ausiliario è ancora discussa. 1-3 In questo contesto, Terpstra ha segnalato la mancanza di spazio per il trapianto, il sangue portale rubare fenomeno e il problema della congestione venosa e il drenaggio. 9-10 vena porta del donatore è stato anastomizzato end-to-side alla vena porta del destinatario. Ciò ha provocato una concorrenza portale flusso tra l'innesto e il fegato nativo e trombosi della vena porta. La maggior parte di questi problemi tecnici possono essere evitati con l'uso del metodo APOLT-(orthotopic impianto di segmenti ausiliari). 4 Tuttavia, questo metodo richiede ampie resezioni sia del fegato nativo e l'innesto. 4 Nel 1998, Erhard e il suo team hanno sviluppato il trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) utilizzando arterialization vena porta (PVA) (Figura 1 ). L'ilo e la vena porta del fegato nativo sono rispettati con l'uso di questo metodo. Che non risparmia il destinatario da effetti collaterali indesiderati come la trombosi della vena porta e sangue portale rubare fenomeno, che potrebbe disturbare il recupero del fegato nativo. Inoltre, non estese resezioni epatiche del fegato nativo e l'innesto sono necessari per questo metodo, con conseguente minor sanguinamento e più restante massa totale del parenchima epatico per colmare (trapianto) e rigenerazione (fegato nativo). Questa tecnica ha mostrato promettenti risultati clinici iniziali. 5-6 L'obiettivo di questo lavoro sperimentale è stato lo sviluppo di una tecnica di HALT con arterialization vena porta inratto per la ricerca (Figura 2). Negli esperimenti preliminari non abbiamo preso in considerazione la regolazione del flusso sanguigno del portale arterializzato vena, che ha provocato la congestione del graft trapiantato dopo riperfusione e sanguinamento massiccio dalla capsula epatica. 11 Da allora il flusso di sangue nella vena porta arterializzato è regolata da uno stent con un diametro interno di 0,3 mm e una lunghezza di 8 mm. Esperimenti pilota hanno dimostrato che un diametro stent di 0,3 mm produce un flusso medio di sangue nella vena porta arterializzato che è all'interno del range fisiologico superiore (1,7 +/- 0,4 ml / min / g di peso del fegato). 12 I nostri risultati senza regolazione del flusso sanguigno correlare con i risultati di Hong, che ha eseguito HALT con PVA attraverso l'arteria iliaca del destinatario. 13 Nei suoi esperimenti senza regolazione del flusso sanguigno massiccio portale e si è verificato congestioni sinusoide.

Lo scopo del nostro video è quello demonstrate passo passo questa Ne.w tecnica chirurgica sperimentale nel ratto. A lungo termine la tecnica proposta può essere utilizzata negli studi sulla rigenerazione del fegato e la concorrenza tra fegato e arterialization vena porta, iperperfusione vena porta e la regolazione del flusso sanguigno portale.

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Protocol

1. Gli animali sperimentali

  1. Ottenere l'approvazione Comitato Etico Locale per tutti gli esperimenti che verranno eseguite, in conformità con le linee guida di protezione degli animali FELASA (K 40, 17/99).
  2. Utilizzare i ratti Lewis maschi disponibili per l'acquisto da qualsiasi allevatore commerciale (ad esempio, Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, Germania). Qui, 224 animali (112 donatori, 112 destinatari) sono stati utilizzati per eseguire 112 trapianti. I destinatari sono stati sacrificati a 6 settimane dopo l'intervento. Al momento dell'operazione, gli animali dovrebbero pesare 250-350 g.
  3. Tenere gli animali in ambienti climatizzati con libero accesso a cibo e acqua.

2 Anestesia e preparazione operativa

  1. Posizionare il ratto in una scatola di plexiglas collegato alla macchina per anestesia con un tasso di flusso di ossigeno di 1 L / min, e un vaporizzatore isofluorane con il 5% di gas anestetico per indurre l'anestesia. Mantenere l'anestesia al 1,5% isofluorane.
  2. Mettere i topi inposizione supina su una piastra riscaldante.
  3. Rimuovere il pelo del ventre con una crema depilazione.
  4. Preparare un campo chirurgico sterile come segue: Utilizzare un disinfettante per pulire il banco. Per la disinfezione del sito di incisione uso Clorexidina prima, seconda alcool e, infine, una soluzione scrub (ad esempio, clorexidina e il 70% di alcool isopropilico). Indossare un camice chirurgico monouso e guanti chirurgici.
  5. Utilizzare strumenti di microchirurgia sterili.
  6. Utilizzare un microscopio funzionamento in 12-20 volte di ingrandimento.

3 Procedura chirurgica

  1. Funzionamento dei donatori

    Preparazione
    1. Eseguire una laparotomia mediana e resecare il lobo laterale sinistro e il lobo mediano del trapianto, come descritto da Higgins. 14
    2. Poi preparare il legamento epatoduodenale. Prima legare il dotto biliare per indurre congestione e dilatazione del piccolo dotto biliare. Poi legare e transetto la gastroduodenale vena e arteria. Successivamente, isolare il tronco celiaco e l'arteria epatica comune e transetto l'arteria gastrica sinistra e l'arteria splenica. Incidere il dotto biliare congestionato, e di introdurre uno stent 20-G in esso. Il posizionamento dello stent deve garantire il drenaggio dell'intero sistema biliare ilare. Transetto il dotto biliare distalmente allo stent.
    3. Isolare il segmento infraepatica della vena cava proprio sopra la vena renale destra.

      Perfusione
    4. Dopo legatura dell'aorta sopra il tronco celiaco, bloccare la vena porta e incidere esso. Introdurre il catetere perfusione (14 G) nella vena porta, ed eseguire la perfusione con 30 ml di istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK) -solution (12 cm H2O, 4 ° C).
    5. Tagliare il diaframma e la vena cava sovraepatica per consentire al perfusato di fuoriuscire.
    6. Accise il tronco celiaco con una patch aortica e sciacquare con soluzione istidina-triptofano-chetoglutarato.

      Espianto
    7. Transetto la vena cava infraepatica proprio sopra la vena renale destra.
    8. Quindi, collocare uno stent con un diametro di 0,3 mm nella vena porta e fissarlo con una legatura. Durante la seguente operazione, la vena porta viene arterializzato attraverso l'arteria renale destra. Transetto la vena porta distalmente allo stent.
    9. Dopo la legatura della vena cava sovraepatica, transetto insieme con un polsino di diaframma.
    10. Espiantare l'innesto e conservarla in istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK) -solution a 4 ° C in un sacchetto di plastica sul ghiaccio. Suture Luogo d'angolo (8-0 Ethilon) nella vena cava infraepatica.
  2. Funzionamento del destinatario
    1. Eseguire una laparotomia mediana e preparare la vena cava infraepatica. Quindi isolare l'arteria renale destra e l'uretere, legare l'uretere e transetto esso. Bloccare l'arteria renale destra alla sua origine, quindi legare la vena renale destra. Poi, dopo la recisione di entrambi rivasi nali, eseguire la nefrectomia. Successivamente, ridurre l'arteria renale destra, sciacquare con soluzione salina eparina (soluzione salina di eparina 40 UI / ml).
    2. Transetto della vena renale destra prossimale alla legatura dopo il bloccaggio prossimale e distale della vena cava infraepatica per creare un ovale lume della vena cava infraepatica. Sciacquare la vena cava con una soluzione salina eparina. Impianto del trapianto nella regione renale destra dell'addome del destinatario.
    3. Anastomose end-to-side vena cava infraepatica del donatore al recipient`s vena cava con un 8-0 Ethilon sutura continua.
    4. Dopo il risciacquo con soluzione di eparina / salina, introdurre lo stent nella vena porta in arteria renale destra (Figura 3). Collegare la vena porta e l'arteria renale con 2 punti (8-0 Ethilon). Fissare lo stent collegati dell'arteria renale con una legatura (intrecciato di seta nera 7-0).
    5. Per consentire la riperfusione, prima rimuovere la pinza arteriosa, allora entrambimorsetti venosi (Figura 4).
    6. Preparare l'aorta sottorenale, quindi inserire un prossimale e distale microclamp e incidere l'aorta destra tra i due morsetti. Eseguire una anastomosi termino-laterale tra l'aorta e il tronco celiaco del donatore, utilizzando una patch aortica, con un 10-0 Ethilon sutura continua.
    7. Inserire il dotto biliare nel duodeno: Applicare una sutura a borsa nella parete duodenale, fare una piccola incisione nella parete duodenale proprio nel mezzo della a borsa. Introdurre il dotto biliare stent nel duodeno, e stringere la sutura a borsa. Infine, tenere premuto il duodeno e il dotto biliare strettamente insieme con due punti (Ethilon 8-0) (Figura 5).
    8. Quindi eseguire una resezione subtotale del fegato nativo, prima descritto da Emond et al. per imitare insufficienza epatica acuta. 7
    9. Fissare la vena cava sovraepatica dell'innesto, con un polsino di diaframma, alla parete addominale laterale del recipient con 4-0 Vicryl sutura. Risciacquare l'addome con soluzione salina (Figura 6).
    10. Per lo strato muscolare utilizzare una sutura continua 4-0 Vicryl e per la sutura cutanea una esecuzione 3-0 Vicryl.

4 Recupero e gestione postoperatoria

  1. Lasciate che gli animali recuperare da anestesia sotto una lampada di riscaldamento a raggi infrarossi.
  2. Iniettare Buprenorfina alla dose di 0,03-0,05 mg / kg di peso corporeo sc ogni 8-12 ore per 2 giorni.
  3. Esaminare gli animali concernenti la condizione generale e segni di malattia o di infezioni.

5 Calcolo del peso iniziale Native Fegato

Calcolare il peso iniziale fegato nativo nel seguente modo: sottrarre il peso dei lobi epatici asportati dal peso del fegato completa (2,66% del peso corporeo (questo valore con una deviazione standard di +/- 0,49% è stata determinata in esperimenti precedenti con n = 80 animali dello stesso ceppo ege)). 15

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Representative Results

La durata media del trapianto era di circa 150 min. Il tempo di ischemia fredda era 64 +/- 7 minuti, il tempo di ischemia calda era a meno di 25 min.

Il tasso di sopravvivenza perioperatoria è stata del 90% e il tasso di sopravvivenza di 6 settimane è stata dell'80%. La perdita del 20% è dovuto a peritonite a causa della dislocazione dello stent e la perdita biliare (quattro animali) durante la prima settimana postoperatoria e causa di polmonite, ascesso intra-addominale e ileo (sette animali) durante i seguenti cinque settimane. Gli animali sopravvissuti erano in ottime condizioni generali.

I parametri del fegato-sintesi (valore di rapida: 110 +/- 7,8%, AT III: 104 +/- 6%) erano entro il range normale sei settimane dopo il funzionamento.

A questo punto il tempo, il fegato nativo aveva rigenerato, mostrando un aumento di peso da 2,3 ± 0,8 g di 9,8 ± 1 g (P: 0,0065). Il peso del graft è scesa dal 3,3 ± 0,8 g di 2,3 ± 0,8 g (P: 0,06). The peso totale di entrambi i fegati era nel rapporto fisiologico del peso del fegato / peso corporeo (Figura 7).

Nella macchia istologica degli innesti con ematossilina-eosina a 6 settimane dopo HALT, epatociti normali sono stati osservati né con edema né degenerazione grassa (Figura 8). Tutti gli innesti hanno mostrato una leggera proliferazione di bile ductuli e colangite a causa della formazione di fanghi (Figura 8). Low-grade intra-parenchimatosa necrosi epatocellulari possono essere osservati solo in due innesti. Dopo sei settimane l'istologia del fegato nativo non ha rivelato alterazioni.

Figura 1
Figura 1 Rappresentazione schematica del trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) con arterialization vena porta (PVA) in umano. L'porTal vena (3) è arterializzato tramite una biforcazione iliaca interposizione innesto (5) che è anche l'alimentatore nave dell'arteria epatica (6).

Figura 2
Figura 2 Rappresentazione schematica del trapianto eterotopico ausiliario di fegato (HALT) con arterialization vena porta (PVA) nel ratto. La vena porta (a) è arterializzato attraverso l'arteria renale destra (e) da uno stent.

Figura 3
Figura 3 arterialization Portale vena durante HALT con PVA nel ratto. (A) Lo stent nella vena porta viene introdotto nell'arteria renale destra. (B) Il por Tal vena e l'arteria renale destra sono collegati con due punti di sutura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Situs dopo la riperfusione trapianto attraverso la vena porta arterializzato nel ratto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 coledoco-duodenostomia durante HALT nel ratto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6 Situs dopo HALT con PVA nel ratto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7 Rappresentazione grafica del peso del fegato (gr) del nativo fegato, trapianto efegato totale, al punto di tempo di funzionamento e dopo sei settimane.

Figura 8
Figura 8 Sezione istologica del graft dopo sei settimane, colorate con ematossilina-eosina (HE) (ingrandimento x100 (A) e X400 (B)). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il primo trapianto di fegato di ratto ausiliario eterotopico è stato descritto da Lee et al., 16 nel 1966, seguita da Hess. 17 La vena porta del graft è stato anastomizzata con la vena porta del destinatario. Durante questa procedura, il portale afflusso di sangue venoso al fegato nativo è compromessa.

Nel 1991 Hong eseguito HALT con PVA attraverso l'arteria iliaca del destinatario. 13 senza regolazione del flusso sanguigno massiccio portale e si è verificato congestioni sinusoide.

Inoltre Aguirrezabalaga et al., HALT eseguita con PVA, tuttavia senza prestare la necessaria attenzione per la regolazione del flusso di sangue nella vena porta arterializzato. 18

L'uso di uno stent avente un diametro interno di 0,3 mm e una lunghezza di 8 mm produce un flusso medio sangue portale dopo riperfusione della vena porta arterializzato che è all'interno del squillato fisiologica superioree. 12

Il drenaggio biliare è il tallone d'Achille di trapianto di fegato. Gli animali riceventi sono in pericolo di morire a causa di perdite biliari e peritonite. A questo scopo abbiamo utilizzato uno stent per eseguire il coledoco-duodenostomia. Inoltre abbiamo applicato una sutura a borsa con un paio di punti di sutura supplementari per evitare perdite e disconnessione. Di conseguenza, le complicanze biliari sono stati ridotti al 4%.

In questo studio, una resezione subtotale del fegato nativo è stata eseguita per indurre insufficienza epatica acuta. Questa tecnica è stata descritta la prima volta da Emond, è standardizzato e non mostra effetti collaterali su altri organi o sul trapianto. 7

Nel 2002, Palmes ha pubblicato la tecnica APOLT nel ratto con un tasso di sopravvivenza del 70-80%, gli animali sono stati sacrificati dopo due settimane. 19 In questo modello il lobo sinistro del trapianto è stato trapiantato dopo la resezione del lobo sinistro del natfegato ive. Vena porta del graft stato anastomizzato end-to-end a fianco portale segmentale vena del destinatario, con conseguente difficoltà chirurgica per eseguire l'operazione, poiché il lume dei vasi diventa molto piccola.

A differenza di trapianto di fegato, durante il trapianto di fegato eterotopico non vi è alcuna fase anepatica. Le anastomosi possono essere eseguiti senza alcun tempo di pressione. Inoltre, nella posizione eterotopico, non vi è alcuna interferenza dal diaframma in movimento. Inoltre, vena porta del destinatario non è bloccato, evitando così la congestione venosa del piccolo intestino, milza, pancreas e dello stomaco.

Abbiamo ottenuto buoni risultati a lungo termine in materia di trapianto microcircolazione, la morfologia e la funzione. HALT 20 con flusso regolato PVA può attendibilmente colmare una fase di insufficienza epatica acuta, mentre il fegato nativo rigenera. 15

HALT con flusso regolato PVA è unn tecnica innovativa, relativamente facile da stabilire. Questo modello consente di futuri studi sulla rigenerazione del fegato e la concorrenza tra fegato e arterialization vena porta, iperperfusione vena porta e la regolazione del flusso sanguigno portale. 20, 21

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Disclosures

Tutti gli autori hanno dichiarato senza interessi in competizione.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). K. Schleimer è stato sostenuto dalla Lise Meitner Fellowship del Ministero della Scienza e della Ricerca del NRW. Vorremmo ringraziare la signora Maria-Giovanna Blümich per l'eccellente assistenza editing. Dr. Maria Kokozidou è stato finanziato da Fresenius 2011_A61.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Silk black 7-0  Ethicon Products 892100
Vicryl 3-0 Ethicon Products J285G
Vicryl 4-0 Ethicon Products J284G
Ethilon 8-0 Ethicon Products 1714G
Ethilon 10-0 Ethicon Products 7770G
Vasofix safety 14G B Braun 2758853
Vasofix safety 20G B Braun 2758818
2 French (0.012”/0.3 mm ID x 0.025”/0.6 mm OD) x 24”/60 cm polyurethane catheter Access technologies a division of Norfolk Medical, Inc., Illinois, USA CNC-2P
HTK solution, Custodiol Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Alsbach-Hähnlein, Germany
Isofluorane 5 % Any genericon
Heparin Any genericon
0.9% saline Any genericon
Buprenorphine Any genericon

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