Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en etablerad djurmodell för multipel skleros. C57BL / 6 möss immuniseras med myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-peptid 35-55 (MOG 35-55), vilket resulterar i en stigande slapp förlamning på grund av autoreaktiva immunceller i det centrala nervsystemet. Protokoll för sjukdomsinduktion och uppföljning kommer att diskuteras.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multipel skleros är en kronisk neuroinflammatoriska demyeliniserande sjukdom i det centrala nervsystemet med en stark neurodegenerativ komponent. Även om den exakta etiologin av sjukdomen är ännu oklar, är autoreaktiva T-lymfocyter anses spela en central roll i dess patofysiologi. MS-terapi är bara delvis effektiva hittills och forskning fortsätter att utöka vår kunskap om patofysiologin av sjukdomen och för att utveckla nya behandlingsstrategier. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är den vanligaste djurmodell för MS dela många kliniska och patofysiologiska funktioner. Det finns en bred mångfald av EAE-modeller som speglar olika kliniska, immunologiska och histologiska aspekter av mänskliga MS. Aktivt-inducerad EAE i möss är det enklaste inducerbara modell med robusta och reproducerbara resultat. Den är speciellt lämpad för att undersöka effekterna av droger eller av särskilda gener med hjälp av transgena möss som utmanas av autoimmun neuroinflammation. Därför immuniseras möss med CNS-homogenat eller peptider av myelinproteiner. På grund av den låga immunogena potentialen hos dessa peptider är starka adjuvans används. EAE känslighet och fenotyp beror på vald antigen och gnagare stam. C57BL / 6 möss är det vanligaste stam för transgen mus konstruktion och svara bland annat på myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Den immunogena epitop MOG 35-55 är upphängd i komplett Freunds adjuvans (CFA) före immunisering och pertussistoxin appliceras på immuniseringsdagen och två dagar senare. Möss utvecklar en "klassisk" självbegränsande monofasisk EAE med stigande förlamning inom 9-14 dagar efter immunisering. Möss utvärderas dagligen använder ett kliniskt poängsystem för 25-50 dagar. Särskilda överväganden för vårdtagande av djur med EAE och potentiella tillämpningar och begränsningar av denna modell diskuteras.

Introduction

Multipel skleros (MS) är en kronisk demyeliniserande inflammatorisk sjukdom i det centrala nervsystemet, varvid förstörelse av oligodendrocyter och neuroner resulterar i heterogena och ackumulerande kliniska symptom. MS är att betrakta som en prototypisk autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) och djurmodeller har utvecklats för att belysa dess komplexa patogenes. Dessutom aktuella behandlingar är bara delvis effektiva och riktar främst den inflammatoriska fasen av sjukdomen medan den neurodegenerativa komponenten är nog den stora utmaningen för framtida behandlingsmetoder 1,2.

Även om den exakta etiologin av sjukdomen är ännu oklar, är en autoimmun reaktion mot epitoper på myelinskidan av axoner i CNS antas framkalla uppkomsten av sjukdomen. Dysreglering av immunsystemet, genetisk sårbarhet och miljömässiga faktorer (t.ex. infektioner, vitamin D) trospåverka centrala aspekter av de patofysiologiska mekanismer av MS.

Tre olika typer av djurmodeller för närvarande fastställts för utforskning av patologiska mönster av MS: Viral modeller som Theiler s murina encefalomyelit virus (TMEV), modeller inducerade av giftiga ämnen som cuprizone och slutligen olika varianter av experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) 3, 4. Trots att de alla efterlikna funktioner i MS, de skiljer sig enormt i underliggande patologiska funktioner som medverkan av det adaptiva immunsystemet. EAE är den vanligaste djurmodell som det är särskilt användbart för att undersöka neuroinflammatoriska vägar och ofta fungerar som ett "proof-of-principle" modell för effektiviteten av nya behandlingsstrategier 5,6. EAE kan induceras i många olika djur (t ex möss, råttor, miniswine, marsvin, höns, eller primater). Emellertid har möss blivit det mest använda arter, som åtminstone delvis beroratt utöka repertoaren av avancerade transgena eller knockout-möss 7.

Patofysiologin av EAE är baserad på reaktionen av immunförsvaret mot hjärnspecifika antigener. Denna reaktion inducerar inflammation och förstörelse av antigen redovisade strukturer, vilket resulterar i neurologiska och patologiska drag jämförbara som de som observerats hos MS-patienter. Kan urskiljas tre olika metoder: Aktivt-inducerad EAE (aEAE, aktiv immunisering), passivt överförda EAE (pEAE, överföring av encefalitogena celler från immuniserade djur), och på senare tid spontana modeller EAE mus (SEAE) som tillåter studier av autoimmuna mekanismer utan exogena manipulation. Det enklaste inducerbara modellen är aEAE i möss som ger i snabba och robusta resultat. Denna modell anses vara den "gyllene standarden" för neuroimmunological djurmodeller av många forskare inom området 8.

För aEAE induktion, djuretimmuniseras med en subkutan injektion av en emulsion bestående av den valda antigenen och komplett Freunds adjuvans (CFA) som åtföljs av en intraperitoneal injektion av pertussistoxin på immuniseringsdagen och två dagar senare. Följaktligen myelinspecifika T-lymfocyter aktiveras i periferin och migrera in i CNS genom blod-hjärn-barriären. Vid inträde i CNS, är T-celler aktiveras av lokala och infiltrerande antigenpresenterande celler resulterar i efterföljande inflammatoriska kaskader, inblandning av andra celler som monocyter eller makrofager och så småningom i demyelinisering och axonal celldöd 9. Beroende på immuniseringsprotokoll och kombinationen av mus-stam (t.ex. C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) och antigen (t.ex. myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG), myelinbasprotein (MBP), myelin proteolipidprotein (PLP)), sjukdomen Naturligtvis kan ta en akut, kronisk progressiv eller skovvis kurs förlöpande sjukdom.

35-55 peptid 10 vilket resulterar i en monofasisk EAE med första symptomen efter 9-14 dagar, max sjukdom ca 3-5 dagar efter sjukdomsdebut och långsam och partiell symptom återhämtning under de närmaste 10-20 dagarna. Som den immunogena potential MOG 35-55 peptid ensam är inte tillräckligt för att framkalla sjukdomen, adjuvans såsom CFA är nödvändiga. Det antas, att komponenterna i CFA aktivera mononukleära fagocyter inducera fagocytos av dessa molekyler och utsöndringen av cytokiner. Detta resulterar i en förlängning av närvaro av antigener och en effektivare transport av dessa till det lymfatiska systemet. EAE-induktion underlättas genom tillämpning av pertussistoxin (PT), som har bland annat föreslagits att modulerablod-hjärnbarriären och immunologisk respons i sig 11. Efter sjukdomsinduktion, måste särskild försiktighet iakttas för daglig utvärdering av möss för sjukdomssymptom.

Protocol

1. Allmänna kommentarer för mus Experiment

  1. Alla experiment med möss bör utföras i enlighet med riktlinjerna i respektive parts institutionella djurvård och användning kommittén.
  2. Håll möss under patogenfria betingelser och ge dem möjlighet att ha tillgång till föda och vatten ad libitum. OBS: Det är viktigt att använda ålders-och könsmatchade möss i försöksgrupper, eftersom känsligheten för sjukdom kan variera med ålder och kön.
  3. Beroende på de valda experimentella förhållanden, kan anses vara där MOG 35-55 peptid ersätts av antingen PBS utan antigen eller en nonencephalitogenic peptid en bluff-immuniserad kontrollgrupp.
  4. Överväg metodologiska aspekter innan startförsök (se även nedan). Vi rekommenderar att involvera en eller två förblindade observatörer för EAE poäng.

2. Beredning av MOG 35-55 Emulsion

  1. 200 pl av en 01:01-förhållande av MOG 35-55 peptidlösning och CFA bör injiceras till varje mus. Det finns en viss förlust av den viskösa emulsionen medan du förbereder och injicerar. Därför framställa 1,5-2x i den nödvändiga mängden. Beräkna den totala volymen av emulsionen och dividera med 2 för de nödvändiga mängderna av båda MOG 35-55 peptidlösningen och CFA.
  2. Späd frystorkad MOG 35-55 i DDH 2 O till en slutlig koncentration av 2 mg / ml. Vi brukar använda 200 mikrogram MOG 35-55 peptid per mus. Denna mängd finns i 100 pl av stamlösningen. Peptidlösningen bör förvaras vid -20 ° C.
  3. Placera innehållet i 1 injektionsflaska med uttorkad H37RA Mycobacterium tuberculosis (100 mg) i en mortel.
    1. Jord med mortel för att erhålla en tunn pulver.
    2. Tillsätt 10 ml av Freunds ofullständiga adjuvans för erhållande av en 10 mg / ml CFA förrådslösning, som kan lagras vid 4 ° C.
    3. Före immunisering späds CFA förrådslösning with IFA till en slutkoncentration av 2 mg / ml. Blanda väl före varje användning för att återsuspendera partikelformigt material och överväga några volymförlust av den viskösa lösningen under de experimentella beredningar.
    4. Blanda 01:01 med MOG 35-55 peptidlösningen tills den slutliga koncentrationen av 1 mg / ml uppnås.
      VARNING: Värm Mycobacterium tuberculosis stimulerar det medfödda immunförsvaret. Undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon.
  4. Förkyla lösningar på is.
    1. Dra upp 1 ml av 2 mg / ml CFA och 1 ml av 2 mg / ml MOG 35-55 lösning i två 2 ml sprutor. Beräkna antalet sprutor som är nödvändiga i enlighet med antalet av immuniserade djur.
      VARNING: Strängt undvika sy under beredning av adjuvans eftersom det kan orsaka granulom eller framkalla autoimmuna reaktioner.
    2. Använd en 27 G kanyl för MOG 35-55 lösning och en 20 G kanyl för CFA. Undvik luftbubblor och ansluta båda sprutorna med påRE-vägs-ventil.
    3. Skicka emulsionen från en spruta till den andra och blanda noggrant i minst 10 minuter som en god emulgering är ett kritiskt steg. Nära-stäng trevägs-ventil för att stödja emulgering. Lösningen ska vara vit, stel och trögflytande utan separation av faserna.
    4. Emulsion kan lagras under flera dagar före immunisering. Vänta åtminstone 30 minuter efter beredning av emulsionerna för att observera huruvida de är stabila. Före immunisering, dra in lösningen i en av två sprutor och anslut en 27 G kanyl.

3. Framställning av pertussis-toxin

  1. Olika mängder av pertussistoxin kan hittas i litteraturen, vilka också beror på administreringssättet (t ex intravenöst eller intraperitonealt). Vårt laboratorium använder 400 ng av pertussistoxin i 200 | il PBS intraperitonealt vid immuniseringsdagen och två dagar senare. VARNING: Pertussis toxin har många biologiska effekter. Undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon.
  2. Rekonstituera 50 ng av pertussistoxin i 500 | il DDH 2 O till 100 | ag / ml stamlösning. Förvaras vid 4 ° C.
  3. Späd 1:50 med PBS. 200 ^ innehåller nu 400 ng av PBS. Förbered den nödvändiga mängden sprutor och överväga ytterligare överskottsvolym på ~ 100 l för varje nål nav.

4. Djur Immunization

  1. Se den institutionella djuromsorg och använda kommitté för specifika kriterier för krävs kortsiktiga dödshjälp. Vårt laboratorium använder kort NARKOTISERING med isofluran medan andra protokoll såsom ketamin / xylazin injektion eller halothan kan också vara möjligt. Vänta på anestesi och använder en främre foten tå nypa för att bedöma graden av anestesi.
  2. Se till att vaccination utförs av en erfaren person för att minimera stress för djuren och för att säkerställa optimal immunisering.
  3. Injicera 100 pl av antigen / CFA emulsions subkutant i två olika ställen på varje hind flank. Se till att en kupig massa blanketter under huden som ska kvarstå under hela experimentet.
  4. Injicera 200 pl av pertussistoxin intraperitonelly.
  5. Se till att enskilda möss lätt kan identifieras för daglig utvärdering, t.ex. genom färgmarkeringar på svansbasen.
  6. Administrera en andra dos av pertussistoxin på dag två efter immunisering.

5. EAE Övervakning

  1. Vikt och klinisk värdering bör utvärderas dagligen. Uppkomsten av EAE korrelerar vanligtvis med viktminskning, som kan användas som en indikator på sjukdomsaktivitet. Se den institutionella djuromsorg och använda kommitté för att fördefiniera kriterier när enskilda möss måste tas ur experimenten. Detta bör beaktas vid viktminskning överstiger 20% av den ursprungliga kroppsvikten eller när allvarliga kliniska tecken (EAE-poäng 7 eller sämre) förekommer. Se till återtive riktlinjer för respektive institutionella djuromsorg och använda kommitté för tillåten maximal poäng.
  2. När möss har kliniska symptom på EAE, är det viktigt att säkerställa att vattenflaskan fortfarande kan nås och att mat placeras på burgolvet.
  3. Olika scoring symptom kan användas. I vårt laboratorium en 0-10 skala är etablerad.
Grad Kliniska tecken Kommentar
0 Inga kliniska tecken Normal gång, svans rör sig och kan höjas, svans sveper runt ett runt objekt om musen hålls vid svansroten
1 Delvis slapp svans Normal gång, svansspetsen slokar
2 Förlamad svans Normal gång, slokar svans
3 Bakbenen pares, okoordinerade rörelser Okoordinerad gång, svans haltar, bakbenen svara på snatta
4 En bakbenet förlamad Okoordinerad gångart med en bakbenssläpn, svans linkar, betyder ett bakben inte svara nypa
5 Båda bakbenen förlamad Okoordinerad gång med båda bakbenen dra, svans haltar, tycker både bakbenen inte svara nypa
6 Bakbenen förlamad, svaghet i framben Okoordinerad gång med forelimbs kämpar för att dra kroppen, framben reflex efter klämmande, haltar svans
7 Bakbenen förlamad, en forelimb förlamad Musen kan inte röra sig, svarar en forelimb till tå nypa, haltar svans
8 Bakbenen förlamad, båda framben förlamad Musen kan inte röra sig, båda frambenen svarar inte på tå nypa, haltar svans
9 Moribund Ingen rörelse, förändrad andning
10 Död

Tabell 1. Klinisk poängsystem.

Representative Results

Efter immunisering, möss måste utvärderas dagligen för förändringar i vikt och kliniska symptom. Sjukdom debut är vanligtvis korrelerad med en minskning av vikt som kan börja 1-2 dagar innan EAE-symptomen är synliga. Kliniska tecken på EAE börjar vanligen mellan dag 9 och 14 efter immunisering. Såsom lesioner huvudsakligen lokaliserad till ryggmärgen i MOG-EAE i C57BL / 6 möss, de utvecklar typiskt övervägande motoriska symptom i ett kaudalt rostralt mönster. En exemplifierande bild av en immuniserad mus med EAE-symptom (poäng 6) visas i figur 1A. Vissa atypiska EAE-symptom kan också förekomma som rull i axial-roterande sätt, värdera böjd utseende eller överkänslighet som inte återspeglas i den klassiska EAE beskrivs i tabell 1. Eftersom motoriska symtom är det främsta kännetecknet på denna modell, denna värdering ger oss en god indikation på sjukdomens svårighetsgrad. Olika övervakningssystem (t.ex. 0 -5 eller 0-6) och mer komplexa sammansatta poäng bedömer olika underskott har också publicerats. Observera att möss med svåra symtom måste tas ut för experimentet enligt respektive institutionell djurvård och användningskommitté. Möss visar i allmänhet partiell återhämtning av symptom under de närmaste 10-20 dagarna. Ett representativt förlopp visas i figur 1B. Det finns olika tidpunkter under EAE som är av intresse för att bedöma resultatparametrar. Några typiska analyser som ofta kan hittas beskrivs mycket kortfattat. Vid maximal sjukdom, kan möss utvärderas för cytokinproduktion eller proliferation efter återstimulering av isolerade immunceller med MOG 35-55 peptid in vitro (MOG recall-analys). Immunceller kan också isoleras från hjärnan och ryggmärg från möss med EAE-symptom och bearbetas vidare, t.ex. genom flödescytometri. Histologisk analys av ryggmärgs sektioner kan utföras vid sjukdom maximal för skada last och demyelinisering, medan vid senare tidpunkter markörer för neurodegeneration och nervcellsdöd kan vara av intresse.

Figur 1
Figur 1. Representant EAE-resultat. A. representativ bild av en immuniserad C57BL / 6 mus med EAE-symptom (EAE poäng 6). B. representant sjukdomsförlopp efter immunisering under 30 dagar. Data visas som medelvärde och standardfel av medelvärdet (n = 5). Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

En mängd olika EAE-modeller med aktiv immunisering protokoll har beskrivits under de senaste decennierna. Även råttmodeller har ofta används tills nyligen, möss är nu den mest populära modellorganism för EAE forskning. Denna utveckling är bland annat på grund av den breda och ständigt växande repertoar av tillgängliga transgena möss. Immunisering av C57BL / 6 möss med MOG 35-55 peptid är en av de mest spridda EAE-modeller och kan betraktas som en tillförlitlig, replikerbar och väl att använda djurmodell. I många neuroimmunological laboratorier, är MOG 35-55 inducerad EAE etablerad som en modell av val, medan andra EAE-modeller används för mer specifika experimentella frågor.

En kritisk punkt att tänka på är att planeringen av de experimentella inställningarna så att EAE-experiment utförs metodologiskt korrekt. För intern validitet, är förblindad poängsättning av sjukdomssymtom rekommenderas. Experimental grupper bör vara ålders-, vikt-och könsmatchade och möss bör slumpmässigt till behandlingsgrupper. Experiment ska alltid utföras i enlighet med djurskyddsbestämmelserna. EAE-studier är ofta underpowered och inte tar hänsyn till statistiska typ II fel. Därför före experiment, urvalsstorlek beräkningar ska utföras. Nödvändiga gruppstorlekar beroende på den förväntade effekten storleken. Samråd med en expert för statistisk analys kan anses innan EAE-experiment.

Vissa begränsningar av det protokoll som måste hållas i åtanke. Viktigast är att tolkningen av aEAE uppgifter äventyras av läget för immunisering med användning av adjuvans och pertussis-toxin och som har både ytterligare inflytande på den immunologiska reaktionen. Det bör också beaktas att MOG 35-55 EAE modellen visar främst en CD4 + T-cell driven immunologiskt svar. CD8 + T-celler och B-celler spelarbör betraktas som en mindre framträdande roll och alternativa protokoll när itu med dessa celltyper. Den förväntade sjukdomsförlopp är akut, monofasiska och självbegränsande. Alternativt kan en skovvis förlöpande sjukdom naturligtvis också uppnås på alternativa EAE-modeller. Ytterligare en viktig begränsning av protokollet är en viss slagsida mot den immunologiska komponenten i MS patofysiologi. Under de senaste åren har det blivit allt tydligare att MS har en stark neurodegenerativ komponent. Döden av oligodendrocyter och neuroner resulterar i en progressiv ackumulering av neurologiska bortfall. Det måste tas hänsyn till att EAE modellen kanske inte är helt lämpade för att ta itu med experiment frågor om neurodegenerativa mekanismer för autoimmun inflammation. Alternativa djurmodeller med fokus på CNS patologi kan anses - t.ex. cuprizone modell som äventyrar giftig demyelinisering utan inblandning av det perifera immunsystemet.

Den beskrivna protokollet betraktas som en grundläggande neuroimmunological experimentell modell och kan modifieras för andra tillämpningar. Det förfarande som beskrivs ovan kan lätt tillämpas på andra EAE-protokoll genom olika möss stammar eller typ och mängd av protein (t.ex. använda PLP 139-151 peptid och SJL möss för en skovvis förlöpande EAE sjukdomsförloppet som är speciellt lämpad för att bedöma terapeutisk effekter på återfall). Det beskrivna protokollet kan även användas för adoptiv-överföring experiment (passiv EAE). I denna modell är C57BL / 6 möss immuniserade med MOG 35-55 peptid och CFA såsom beskrivits ovan. I motsats härtill är pertussistoxin inte nödvändig. Efter 7-15 dagar, mjälte eller lymfkörtlar är isolerade och immunceller återstimuleras in vitro med MOG 35-55 peptid och olika cytokiner innan de överförs till en ny grupp av C57BL/6se möss. Dessa mottagande möss utvecklar EAE några dagar tidigare än på classisk immunisering. In vitro-förhållanden kan varieras för specifika immunologiska frågor (t.ex. polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).

Ibland kanske låg incidens sjukdom eller svaga symptom vara en experimentell utmaning. Några rekommendationer för felsökning är:

- Sjukdomens svårighetsgrad kan varieras med olika mängder av peptid / mus.

- Optimalt CFA koncentration kan variera från 1 till 5 mg / ml. Betrakta en titrering av CFA vid fastställande av experimenten. Se de respektive riktlinjerna för respektive parts institutionella djuromsorg och använda kommitté för tillåtna CFA koncentrationer så många regler förbjuder CFA koncentrationer som överstiger 2 mg / ml.

- Olika metoder beskrivs för framställning av emulsionen. Alternativa metoder som vortex i 1 timme eller ultraljudsbehandling kan övervägas om dålig emulgering anses possible felkälla.

- Ålder, kön, årstid och miljöförhållanden inom djuranläggningen är viktiga faktorer som påverkar EAE känslighet. Man bör se till att förhållandena är jämförbara mellan oberoende försök.

Såsom beskrivits ovan kan den nämnda protokoll användas som startpunkt för adoptiv EAE-experimenten. Denna modell är speciellt lämpad för att separera perifera och CNS-effekterna av en genetisk fenotyp (t.ex. genom att överföra encefalitogena knockout celler i vildtyp recipientmöss) och för specifika immunologiska frågor som fenotypen av de överförda cellerna kan karakteriseras ordentligt. Den senaste utvecklingen i EAE forskning under de senaste åren är T-cellreceptor-transgena möss. Dessa möss utvecklar EAE-symptom spontant utan yttre påverkan kringgå problemet med adjuvans inokulering. Emellertid kräver denna modell stora mängder av djur för breeding att säkerställa tillräckliga gruppstorlekar. Utvärdering av knockoutmöss kräver korsningar före EAE-experiment i motsats till aEAE. Som varje mus utvecklar sjukdomssymptom på en annan dag, kan utvärdering av nya ämnen vara ganska komplicerat. Därför kvarstår värdet av klassisk aEAE för neuroimmunological oemotsagda.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av det Tvärvetenskapliga Centrum för klinisk forskning (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics