Journal
/
/
Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit
JoVE Journal
Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Immunology and Infection
Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

6,841 Views

09:01 min

November 17, 2020

DOI:

09:01 min
November 17, 2020

10 Views
, , , ,

Transcript

Automatically generated

Det protokoll vi presenterar här kommer att vara till hjälp för oss att förstå hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av det centrala nervsystemet autoimmun sjukdom. Med denna metod kan lymfocyter i hjärnan studeras studeras på en cell för cell basis. Detta protokoll kan också tillämpas på andra modeller och centrala nervsystemet sjukdom som behövs för att analysera egenskaper och funktioner hos immunceller.

I den här videon kan protokollet enkelt visa hur man inducerar modell och isolerar enstaka celler i hjärnan. Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedal reflex, använd en en milliliter spruta för att subkutant injicera sövda C57BL/6 möss med 100 mikrogram emulgerade MOG 35-55 i 100 mikroliter av komplett Freunds adjuvant i två olika platser i ryggen nära halsen. Samma dag och dag två postimmunisering injicerar intraperitoneally mössen med 200 mikroliter av ett nanogram per mikroliter per pertussis toxin arbetslösning.

Efter den andra injektionen, överför mössen tillbaka till deras hem bur med en uppvärmning pad och övervakning tills full recumbency. Nästa dag och under hela sjukdomsredningen, undersöka och gradera alla möss på ett förblindat sätt för de neurologiska tecken som beskrivs i tabellen och för eventuella förändringar i vikt. Vid lämplig experimentell endpoint skär man kraniet försiktigt från näsan till halsen och överför hjärnan hos varje djur från kraniallådan till individuella 50 milliliterrör som innehåller 10 milliliter RPMI-medium.

Blanda rören väl för att ta bort de vidhäftande röda blodkropparna och ta bort mediet genom aspiration. Tillsätt 10 milliliter färskt medium till varje rör och överföra hjärnorna till enskilda 100 millimeters rätter. Slutligen hugga varje hjärna med en rakhyvel och använda en plastpipett för att överföra så mycket vävnad från en maträtt i taget och sex milliliter medium till en iskallt sju milliliter centrerad glas homogenisator.

Mala hjärnan med hjälp av den lösa kolven i mortelstöten innan du använder den snäva kolven för att få vävnaden tills suspensionen är homogen. Häll sedan den resulterande vävnadsslamman i en förkyld 15 milliliter konisk röret på is. När alla proverna har homogeniserats, justera volymen i varje rör till sju milliliter med färskt medium, innan du lägger varje vävnad suspension till en ny kyld 15 milliliter rör som innehåller tre milliliter av 100%källaren membranmatris per rör.

Blanda genom inversion några gånger och använd en tre milliliter pipetter för att noggrant och långsamt lägga till en milliliter av 70 procent densitet gradient lösning under varje vävnad lösning prov. Separera cellerna genom densitet gradient centrifugation och ta bort nästan alla av det översta lagret, var noga med att helt ta bort alla myelin. Överför gränssnittet till ett nytt 15 milliliterrör och justera volymen till 10 milliliter med färskt medium.

Sedan centrifugerna proverna igen och ta bort supernatanten innan de återsänder pelletsen i cirka 100 mikroliter medium per rör. För flödescytometrisk analys av de skördade hjärncellerna, fördela ungefär två gånger 10 till de sex cellerna i 100 mikroliter av medium i enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta. När alla celler har pläterats, tillsätt 100 mikroliter av 500X cell stimulering cocktail plus proteintransport hämmare till brunnarna och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i fyra timmar.

I slutet av inkubationen poolen cellerna i botten av brunnarna genom centrifugering och resuspend pellets i 100 mikroliter av flödescytometri buffert per brunn. Förinkubera cellerna med tre mikroliter av Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block i 10 minuter vid fyra grader Celsius före färgning. Att blockera alla ospecifika Fc-medierade interaktioner.

I slutet av inkubationen, tillsätt antikroppscocktail av intresse till varje brunn och placera plattan vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. Efter 30 minuter, tvätta brunnarna med 100 mikroliter av flödescytometribuffert per brunn och sediment cellerna genom centrifugering. Efter att du har kastat supernatanterna, tillsätt 200 mikroliter av intracellulär fixeringsbuffert till varje brunn.

Efter en inkubering på 30 till 60 minuter vid rumstemperatur, samla in proverna genom centrifugering och återanvända pelletsen i 200 mikroliter av 1X permeabilitetsbuffert per brunn. Centrifugera proverna igen, och efter att ha kasserat supernatanten, resuspend pellets i 100 mikroliter med färsk permeabilisering buffert. Därefter lägger till lämpliga antikroppar för detektion av eventuella intracellulära antigener av intresse för en 30 minuters inkubation vid fyra grader Celsius, skyddad från ljus.

I slutet av inkubationen, tillsätt 100 mikroliter av 1X permeabiliseringsbuffert till varje brunn och snurra ner proverna genom centrifugation. Sedan, resuspend fläcken celler i 200 mikroliter av flödescytometri färgning buffert och analysera cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll. En typisk klinisk kurs av EAE bör resultera i en sjukdom kurva och förändring i kroppsvikt som illustreras.

C57BL/6 möss immuniserade med MOG 35-55 brukar börja utveckla sjukdomssymtom runt dag 10 till 12 och uppnå toppen av sjukdom runt dag 15 till 21. Före sjukdomsuppgången ökar kroppsvikten hos immuniserade möss gradvis innan de minskar i samband med de ökande sjukdomssymtomen Mössen visar den lägsta kroppsvikten på toppen av EAE, med kroppsvikter som återhämtar sig något när de kliniska symtomen minskar. Mössen brukar inte återhämta sig helt dock och brukar vanligtvis fortsätta att utveckla en monofasisk kronisk sjukdom patologi.

Som denna representativa flödesanalys illustrerar, är interferon gammaproducerande Th1- och IL17-producerande Th17-celler signifikant ökade hos EAE-möss. Det viktigaste steget är 3.10. Operatören bör överföra mellanlager och ljuset, är noga, ta så få andra lager som möjligt.

Efter dessa protokoll kan vi ytterligare T-lymfocyter för ytterligare transkriptionsanalys för att studera

Summary

Automatically generated

Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.

Read Article