संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहा प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines इमेजिंग

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Neuroscience

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Summary

यह लेख संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग इन विट्रो में hippocampal न्यूरॉन्स से छवि वृक्ष के समान spines के लिए काम कर रहे एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. सिम का उपयोग सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी सुधार विस्तार के साथ व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines के इमेजिंग की अनुमति, काफी सभी तीन स्थानिक आयामों में प्रकाश विवर्तन सीमा से परे छवि संकल्प प्रदान करता है.

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Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

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Abstract

वृक्ष के समान spines एक न्यूरॉन की डेन्ड्राइट से उभरते protrusions हैं और मस्तिष्क में उत्तेजक आदानों की प्राथमिक postsynaptic लक्ष्य प्रतिनिधित्व करते हैं. तकनीकी विकास न्यूरॉन कनेक्टिविटी और synaptic plasticity में महत्वपूर्ण तत्व के रूप में इन संरचनाओं की पहचान की है. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग रीढ़ आकारिकी की मात्रात्मक विश्लेषण के कारण प्रकाश की आंतरिक अपवर्तन सीमा के साथ जुड़े तकनीकी सीमाओं के लिए एक अनिवार्य समस्या बनी हुई है. वृक्ष के समान spines आसानी confocal लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है. लंबाई के अलावा अन्य रीढ़ आयाम आमतौर पर 200 एनएम के प्रकाश माइक्रोस्कोपी के सैद्धांतिक सीमा संकल्प द्वारा तय की पारंपरिक ऑप्टिकल संकल्प से छोटे हैं लेकिन, कांटा के आकार और आकार में सूक्ष्म परिवर्तन को मापने के लिए मुश्किल है.

कई हाल ही में विकसित सुपर संकल्प तकनीक वृक्ष के समान spines सहित 200 एनएम, की तुलना में छोटे छवि सेलुलर संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है. टीhese तकनीक शास्त्रीय दूर क्षेत्र आपरेशन पर आधारित है और इसलिए एक नमूना की सतह से परे मौजूदा नमूना तैयार करने के तरीकों की और छवि के लिए उपयोग करने की अनुमति कर रहे हैं. यहाँ वर्णित प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों में वृक्ष के समान spines के इमेजिंग के लिए सुपर संकल्प संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) लागू करने के लिए काम कर रहे एक प्रोटोकॉल है. सिम के संभावित अनुप्रयोगों confocal माइक्रोस्कोपी के लोगों के साथ ओवरलैप. हालांकि, दो तकनीकों अलग प्रयोज्यता प्रस्तुत करते हैं. Confocal माइक्रोस्कोपी, कारण एक शारीरिक पिनहोल का उपयोग करने के लिए, प्रकाश बाहर का ध्यान को हटाने की कीमत पर संकल्प सुधार को प्राप्त होता है, जबकि सिम, उच्च प्रभावी पार्श्व संकल्प प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक न्यूरॉन्स डीएनए plasmids फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग और सिम का उपयोग imaged साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए कांच coverslips पर सुसंस्कृत हैं. वृक्ष के समान spines विट्रो में 16-17 दिनों के बाद, जब imaged हैं क्योंकि यहाँ बताया पूरे प्रोटोकॉल, लगभग 2 सप्ताह लगते हैंवृक्ष के समान विकास के इष्टतम है. प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद, वृक्ष के समान spines विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सिम छवि के ढेर की श्रृंखला से 3 डी में खंगाला जा सकता है.

Introduction

एक वृक्ष के समान रीढ़ न्यूरॉन झिल्ली का एक छोटा सा फलाव है. यह विशेषता संरचना आम तौर पर एक एकल synapse से निवेश प्राप्त करने के लिए विशेष और दो न्यूरॉन्स के बीच शारीरिक संपर्क क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. अधिकांश कार्यात्मक परिपक्व वृक्ष के समान spines एक गोलाकार टिप, करार दिया सिर, और वृक्ष के समान शाफ्ट को सिर से जोड़ता है एक पतली गर्दन से मिलकर. हालांकि, कांटा स्थिर नहीं हैं और सक्रिय रूप से कदम है और यहां तक कि वयस्क मस्तिष्क 2 में लगातार उनकी आकारिकी बदल जाते हैं. समय की एक 2 सप्ताह की अवधि के भीतर, देर से भ्रूण या जल्दी प्रसव के बाद समय से व्युत्पन्न चूहे प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों रीढ़ संरचनाओं की तरह 3 के लिए जल्दी filipodia से विकसित है कि कई झिल्ली protrusions के साथ जटिल वृक्ष के समान arbors का विकास. इस गतिशील व्यवहार और अन्य विशेषताओं के आधार पर, वृक्ष के समान spines स्मृति भंडारण और synaptic प्रसारण 4,5 के लिए एक संरचनात्मक सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए लगा रहे हैं.

वें देखते हुएवृक्ष के समान रीढ़ आकार और आकृति synaptic समारोह में, यह सही उनके आयाम को मापने के लिए महत्वपूर्ण है है कि ई महत्वपूर्ण भूमिका. कांटा लंबाई में लगभग 200 से 2,000 नैनोमीटर से भिन्न है और आसानी से confocal लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है. हालांकि, लंबाई के अलावा अन्य रीढ़ आयाम आमतौर पर सैद्धांतिक रूप से 200 नैनोमीटर 6 के आसपास विवर्तन द्वारा तय की पारंपरिक ऑप्टिकल सिस्टम 'संकल्प, नीचे दी गई हैं. ये हल करने शक्तियां ऐसी रीढ़ गर्दन और सिर की चौड़ाई के रूप में बेहतर जानकारी, इमेजिंग के लिए अपर्याप्त हैं. ज्यादा काम करने से इस समस्या को हल करने के लिए समर्पित किया गया है और कई अपेक्षाकृत नए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक काफी प्रगति प्रदान की है. विशेष रूप से, यह एक व्यापक क्षेत्र, गैर confocal खुर्दबीन 7-10 में laterally संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग कर किसी भी उत्सर्जन प्रकाश discarding बिना शास्त्रीय सीमा से परे संकल्प को प्राप्त करने के लिए संभव है. गैर LINEA साथ संयोजन में इस तकनीक का प्रयोगआर माइक्रोस्कोपी तकनीक, यह एक असीमित कारक 11 से ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के पार्श्व संकल्प में सुधार करने के लिए सैद्धांतिक रूप से संभव है. हालांकि, ज्यादातर प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, सिम, दो 1 का एक पहलू से संकल्प सीमा पार करने की अनुमति देता है. ऐसे प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED) माइक्रोस्कोपी 12 और फोटो सक्रियण स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) के रूप में 12 अन्य सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक वृक्ष के समान spines के इमेजिंग के लिए लागू किया गया है. पाम जैसे स्थानीयकरण आधारित विधियों सुपर संकल्प को प्राप्त करने के लिए कच्चे छवियों की बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है और इसलिए गति में सीमित कर रहे हैं. दूसरी ओर, STED, उच्च इमेजिंग गति को प्राप्त कर सकते हैं अपेक्षाकृत कम फोटोन मायने रखता है और सिम 13 के लिए मामला नहीं हो सकता है, जो देखने में छोटे खेतों, पर हालांकि.

इस अनुच्छेद में उद्देश्य के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स से छवि वृक्ष के समान spines के लिए काम कर रहे एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है

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Protocol

जानवरों को शामिल सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु पीड़ा को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया और पशु प्रयोग, एम्स्टर्डम के विश्वविद्यालय, दिसम्बर प्रोटोकॉल # DED204 और DED250 के लिए आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. Coverslip तैयारी

  1. वे एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में फिट है, ताकि एक कार्बाइड या हीरा मुंशी का उपयोग x 15 मिमी 15 मिमी के आकार को coverslips नीचे कट.
  2. एक धूआं हुड में काम करते हुए पूरी तरह से एक ग्लास कंटेनर में केंद्रित नाइट्रिक एसिड समाधान (70% भार / भार) में coverslips submerging द्वारा coverslip कोटिंग शुरू करते हैं. यहां तक ​​कि वितरण हिला सुनिश्चित करने के लिए, तो 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं. यह लगभग 2 बार के लिए केंद्रित नाइट्रिक एसिड समाधान का पुन: उपयोग करने के लिए संभव है, लेकिन यह प्रकाश के लिए जोखिम के रंग ढीला कर सकते हैं.
  3. केंद्रित नाइट्रिक एसिड समाधान निकालें और ध्यान से प्रत्येक धोने के बाद मिलाते हुए 30 मिनट के लिए आसुत जल में coverslips चार बार धोने.
  4. सावधानी से निकालेंपानी.
    नोट: अगले तीन चरणों का एक बाँझ लामिना का प्रवाह कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं.
  5. 96% EtOH में coverslips भिगोएँ. EtOH के समाधान से coverslips निकालें और उन्हें सूखी.
  6. Coverslips लौ और एक गिलास कंटेनर में डाल दिया. Coverslips (उदाहरण के लिए ड्यूमॉन्ट शैली संख्या 5 संदंश) को संभालने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें.
  7. 180 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए एक सूखी गर्मी ओवन में एल्यूमीनियम पन्नी और सेंकना के साथ कंटेनर कवर कसकर कवर अगर बेक्ड coverslips को 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.

2. Coverslip कोटिंग

coverslip कोटिंग प्रक्रिया कांच की सतह और वृक्ष के समान द्रुमायण से 14 न्यूरॉन लगाव पक्ष में है.

  1. एक बाँझ लामिना हुड में, एक 12 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में व्यक्ति coverslips स्थान के लिए बाँझ छोटे संदंश का उपयोग करें.
  2. (Coverslips डूब या पर्याप्त मात्रा में) 500 पाली एल lysine समाधान के μl जोड़ें.
  3. टी लपेटेंवह वाष्पीकरण को रोकने और कमरे के तापमान पर रातोंरात इसे छोड़ने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में थाली.
  4. संस्कृति शुरू करने से पहले, एक बाँझ लामिना हुड में ध्यान से पाली एल lysine समाधान aspirate.
  5. बाहर सुखाने के लिए उन्हें रोकने, whilst दो बार बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें.
  6. महाप्राण पानी पूरी तरह से, मध्यम चढ़ाना के 1 मिलीलीटर जोड़ने और कोशिकाओं थाली करने के लिए तैयार है जब तक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में coverslips छोड़ दें. यह 24 घंटे के भीतर कोशिकाओं थाली करने के लिए सिफारिश की है.

E16-E19 चूहा भ्रूण से दिमाग के 3. निकालना

  1. रात भर एक सूखी अजीवाणु में उन्हें गर्म या 70% EtOH के साथ उन्हें धोने से सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित. EtOH प्रयोग किया जाता है, तो अच्छी तरह से सूखे.
  2. 1x HBSS बफर के साथ कई 30 मिमी व्यंजन तैयार करने और उन्हें बर्फ पर रहते हैं.
  3. (± 0.4 मिलीलीटर की एक मात्रा में 160 मिलीग्राम / किग्रा Euthasol) Euthasol की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहे बांध euthanize.
  4. सजगता के अभाव के लिए जाँच करें.
  5. 70% EtOH के साथ बांध के पेट स्प्रे.
  6. पेट के साथ एक चीरा और गर्भाशय निकालना.
  7. गर्भाशय से भ्रूण निकालें और एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में उन्हें जगह है.
  8. बड़ी कैंची से भ्रूण के सिर निकालें और ठंड 1x HBSS बफर युक्त एक नया पेट्री डिश में सिर जगह है.
    नोट: यहाँ से प्रक्रिया एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है 7.1 कदम की.
  9. बड़ा संदंश के साथ पक्षों के साथ सिर नीचे रखें.
  10. छोटे कैंची के साथ, तो laterally एक बड़े संदंश के साथ त्वचा के नीचे छील, सिर की चोटी पर त्वचा में एक बाण के समान कटौती करते हैं.
  11. खोपड़ी को हटाने के लिए कदम 3.10 में के रूप में एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करें. दुम अंत में शुरू एक बाण के समान कटौती करें; धीरे मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना खोपड़ी खोलने. दूर laterally मस्तिष्क को उजागर खोपड़ी के दो हिस्सों मोड़ो.
  12. कुंद रंग के साथ, मस्तिष्क बाहर निकालना और ताजा ठंड 1x HBSS में जगह है.
  13. हिप्पोकाम्पी के 4. विच्छेदन

    यह विच्छेदन सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए बाँझ परिस्थितियों में जितनी जल्दी संभव के रूप में किया जाता है कि बहुत महत्वपूर्ण है. बर्फ पर ठंड नमूने रखें.

    1. निकालें और ठीक कैंची के साथ सेरिबैलम त्यागें.
    2. Midline के साथ एक बाण के समान कटौती करके मस्तिष्क के दोनों गोलार्द्धों अलग करें.
    3. प्रत्येक गोलार्द्ध लो और ताजा ठंड 1x HBSS युक्त एक नया 30 मिमी पकवान में दोनों जगह.
    4. टेम्पोरल लोब पकवान के नीचे चेहरे ऐसे हैं जो प्रत्येक गोलार्द्ध रखें.
      नोट: यहाँ पर से, यह एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
    5. धीरे एक छोटे संदंश का उपयोग मध्यमस्तिष्क पकड़ और संदंश की एक और जोड़ी के साथ मध्यमस्तिष्क हटा दें. प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस युक्त बरकरार गोलार्द्ध के शेष छोड़ दें.
    6. हिप्पोकैम्पस अब डिश के नीचे का सामना करना पड़ रहा है, जिससे कि ऊतक पर बारी.
    7. धीरे पी में गोलार्द्ध पकड़एक ठीक संदंश के साथ फीता. एक और ठीक संदंश का उपयोग करके, ध्यान से और धीरे तानिका हटा दें. यह घ्राण बल्ब पर शुरू करने के लिए आसान है. हिप्पोकैम्पस नुकसान न तो सावधानी बरतें.
    8. हिप्पोकैम्पस अब सामना करना पड़ रहा है इतना है कि ऊतक पूरबी. हिप्पोकैम्पस अब इसकी विशेषता सी के आकार का संरचना से देखा जा सकता है.
    9. ठीक संदंश का उपयोग करके, हिप्पोकैम्पस काटना. ताजा ठंड 1x HBSS युक्त एक नया 30 मिमी पकवान में यह लीजिए.

    5. सेल हदबंदी और चढ़ाना

    1. उन्हें छोटे टुकड़ों में काट तो, हिप्पोकाम्पी की कुल संख्या की गणना.
    2. 3 मिलीग्राम 1x HBSS युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में टुकड़े ले लीजिए.
    3. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
    4. हिप्पोकैम्पस प्रति trypsin 6 μl जोड़ें.
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम 20 मिनट के लिए सेते 3 मिनट के बाद भंवर.
    6. ताजा ठंड 1x HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    7. Seco के बादएन डी, धो 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गर्म चढ़ाना माध्यम के 1.5 मिलीलीटर, जोड़ चढ़ाना माध्यम में सीरम trypsin गतिविधि को निष्क्रिय करेगा.
    8. ऊतक के सभी टुकड़ों को homogenously एकल कक्षों में बिखरे हैं जब तक धीरे धीरे एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ 30x triturate. किसी भी बुदबुदाती से बचें.
    9. चढ़ाना के 5 मिलीलीटर जोड़ें मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गर्म
    10. एक Trypan नीले महत्वपूर्ण धुंधला का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
    11. धारा 2 (कुल मात्रा 2 मिलीलीटर) में तैयार मध्यम चढ़ाना 1 मिलीलीटर में एक 12 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 50,000 कोशिकाओं, बीज.
    12. धीरे समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए थाली रॉक.
    13. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2. 2-3 दिनों के बाद, 10 माइक्रोन FUDR युक्त मध्यम संस्कृति के साथ चढ़ाना मध्यम के आधे (0.5 मिलीग्राम) की जगह.
      नोट: वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग 16-17 दिनों चढ़ाना के बाद किया जाता है (इन विट्रो में 16-17 दिन, DIV).

    Lipofectamine का उपयोग 6. चूहे के हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन अभिकर्मक

    1. GFP और ऊष्मायन मध्यम (Glutamax के 100 μl के साथ Neurobasal माध्यम के 10 एमएल) व्यक्त प्लाज्मिड डीएनए तैयार.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गर्म ऊष्मायन मध्यम
    3. डीएनए मिक्स (ट्यूब) तैयार करें. प्रत्येक coverslip के लिए सादे Neurobasal मध्यम के 100 μl में डीएनए की 1 ग्राम जोड़ें. धीरे मिश्रण.
    4. Lipofectamine मिश्रण (ट्यूब बी) तैयार करें. प्रत्येक coverslip के लिए सादे Neurobasal मध्यम के 100 μl में 2 μl Lipofectamine जोड़ने. धीरे मिश्रण.
    5. डीएनए मिश्रण dropwise को Lipofectamine मिश्रण जोड़ें.
    6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए लामिना का प्रवाह हुड में सेते हैं.
    7. 1 थाली करने के लिए पूर्व गर्म ऊष्मायन माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्टोर थाली 2, 5% सीओ 2.
    9. धीरे डीएनए / Lipofectamine के 200 μl प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 45 मिनट के लिए सेते dropwise जोड़ने.
    10. छोटे संदंश का उपयोग coversli लिफ्ट के साथपुनश्च न्यूरॉन्स युक्त और ताजा गर्म Neurobasal मध्यम युक्त एक 3 सेमी पकवान में उन्हें सूई से उन्हें कुल्ला और 2 थाली करने के लिए उन्हें स्थानांतरित.
    11. 37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 में ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स सेते हैं.
    12. अभिकर्मक दक्षता के लिए अभिकर्मक के बाद 24 घंटे की जाँच करें.

    7. Immunostaining और बढ़ते चूहे के हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स की

    ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता में सुधार करने के लिए, GFP का पता लगाने अभिकर्मक के बाद 48 घंटे बढ़ाने के लिए एक immunostaining प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं.

    1. 4% पीएफए ​​और 0.05 एम टीबीएस तैयार करें.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 4% पीएफए ​​समाधान गर्म
    3. धीरे coverslips युक्त कुओं से मध्यम aspirate.
    4. डेन्ड्राइट को नुकसान पहुँचाए को रोकने के लिए सावधानी से गर्म 4% पीएफए ​​के 500 μl जोड़ें.
    5. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    6. 5 मिनट के लिए 1x HBSS के साथ 3 बार धोएं.
      नोट: इस बिंदु पर नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता हैया immunostaining के तुरंत शुरू किया जा सकता है.
    7. नमूने संग्रहीत किए गए थे, तो 5 मिनट के लिए 0.05 एम टीबीएस के साथ 3 बार धोएं.
    8. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर टीबीएस-बीएसए (1%) समाधान के साथ ब्लॉक.
    9. 5 मिनट के लिए 0.05 एम टीबीएस के साथ 3 बार धोएं.
    10. ऊष्मायन मिश्रण में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
    11. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
    12. इसके अलावा, सेते रातोंरात कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर.
    13. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें.
    14. 5 मिनट के लिए 0.05 एम टीबीएस 3X के साथ धोएं.
      नोट: इस बात से, प्रकाश से सुरक्षित coverslips रखना.
    15. ऊष्मायन मिश्रण में पतला माध्यमिक फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें.
    16. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    17. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें.
    18. 5 मिनट के लिए 0.05 एम टीबीएस के साथ 3 बार धोएं.
    19. 5 मिनट के लिए 1X टीबी के साथ 2 बार धोएं.
    20. कुओं से coverslips को दूर करने के लिए ठीक चिमटी का प्रयोग करें.
    21. एक ऊतक के साथ टीबी के किसी भी अधिक सुखी और cov माउंटबढ़ते माध्यम का उपयोग कर erslips.
    22. बढ़ते मध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ सील.

    8. वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग संरचना प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग

    की तुलना में संकल्प में 2 बार सुधार का एक पहलू उपलब्ध कराने, 250 एनएम - सामग्री में वर्णित सिम प्रणाली का उपयोग कर वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग एक पार्श्व संकल्प लगभग 85-110 एनएम (XY) मूल्य और 200 के बीच एक अक्षीय (जेड) संकल्प का महत्व है व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी.

    नोट: सिम का उपयोग वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग 2 दिनों कदम 7.22 के बाद आम तौर पर किया जाता है, लेकिन नमूने अंधेरे में और 22 की एक नियंत्रित तापमान के तहत रखा जाता है, तो बाद में 3 सप्ताह के लिए किया जा सकता है - 23 डिग्री सेल्सियस

    1. 488 एनएम लेजर, पारा दीपक, मंच नियंत्रक, piezo नियंत्रक, प्रेषित प्रकाश के लिए हलोजन दीपक और पीसी पर बारी और "ANDOR एन सिम के लिए" मोड में सिम सॉफ्टवेयर शुरू.
    2. 100x TIRF वस्तु साफ95% इथेनॉल के साथ तीन बार ive, और पेट्रोलियम ईथर के साथ यदि आवश्यक है.
    3. एक 488 dichroic साथ 520 एल.पी.: निम्न फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग करें.
    4. उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखो. तेल ड्रॉप में कोई हवाई बुलबुले हैं कि जाँच करें. तेल नमूना छू तक ऊपर की ओर उद्देश्य ले जाएँ.
      नोट: जगह परिवेश प्रकाश से नमूना रक्षा के लिए और जितना संभव हो उतना कमरे में रोशनी मंद करने के लिए मंच पर एक आवरण.
    5. पीएसएफ का सबसे अच्छा समरूपता प्राप्त करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, 200 मीटर करने के लिए उद्देश्य से सुधार कॉलर सेट करें. सही कॉलर की स्थिति, प्रथम स्थान इष्टतम नाममात्र की स्थिति में उद्देश्य अंगूठी सेट और फिर एक 100 एनएम मनका नमूना जांच करने के लिए आदेश में. सर्वश्रेष्ठ पीएसएफ की समरूपता के अनुसार, थोड़ा नाममात्र के आसपास कॉलर स्थिति बदल जाते हैं.
    6. रोशनी के लिए, 3 डी सिम झंझरी (100X/1.49 सभी तरंग दैर्ध्य 1layer 3 डी) का उपयोग करें. 1 के साथ, सिम प्रकाशक में झंझरी संरेखण जगह चयनित झंझरी ब्लॉक शुरू करने के लिएजगह में 00X 1.49 उद्देश्य. दृश्य (FOV) के एक क्षेत्र के लिए 10-15 मोती अलग अनुमति दे सकते हैं कि एक एकाग्रता के साथ, मीडिया में घुड़सवार एक 100 एनएम मनका नमूना प्रयोग करें. इच्छित स्थान के लिए उद्देश्य सुधार कॉलर स्थापित करने के बाद, 3 डी सिम रोशनी का चयन करें और सॉफ्टवेयर निर्देशित संरेखण प्रक्रिया शुरू करते हैं. यह (1 दिशा) एक्स (100 Z-विमानों) यह मोतियों के साथ FOV का पुनर्निर्माण किया जाएगा, जिसमें से छवियों, एक्स (5 चरणों) चलेंगे. बाहर का ध्यान केंद्रित धुंधला प्रकाश सहित पूरे मनका कवर, एक उचित लागत पर लाभ के माध्यम से एक भी मोती चुनने के बाद, सॉफ्टवेयर फिटिंग एक स्वचालित पीएसएफ शुरू होगा और यह परिणाम के अनुसार झंझरी स्थिति को समायोजित करेगा.
    7. माइक्रोस्कोप के प्रदर्शन की जांच करने के क्योंकि तालिका आंदोलनों और / या तापमान बहती की वजह से संभव misalignment की, झंझरी संरेखण हर 2 सप्ताह दोहराएँ. इसके अलावा, यह भी निर्माता के सुझाव के अनुसार लेजर तीव्रता और स्थिरता की जांच.
    8. 95% ETH साथ नमूना सतह को साफतीन बार anol.
      नोट: अगले कदम नियंत्रण पैनल और सिम सॉफ्टवेयर के भीतर सही सेटिंग्स का एक सिंहावलोकन के लिए 3 आंकड़ा देखें.
    9. सिम सॉफ्टवेयर, ऑप्टिकल विन्यास आई FITC का चयन करें और सफेद रोशनी के साथ दृश्य निरीक्षण के लिए बुर्ज 1 में एक खाली फिल्टर ब्लॉक का चयन करें.
    10. ध्यान केंद्रित गति और XY टेबल को "ठीक" की यात्रा गति सेट करें.
    11. शटर खुला और जल्दी से नमूना पर ध्यान केंद्रित.
    12. फिर से शटर बंद करें और सेट शून्य करने के लिए जेड समन्वय.
    13. ग्रीन चैनल का उपयोग दृश्य निरीक्षण के लिए बुर्ज 1 में हरी फिल्टर का चयन करें.
    14. सबसे कम सेटिंग को पारा दीपक की तीव्रता सेट करें.
    15. उद्देश्य सीलेंट स्पर्श नहीं करता है, यकीन है कि सावधानी से नमूना की सीमा पर ले जाएं.
    16. शटर खुला और जल्दी संभव सबसे कम तीव्रता के साथ नमूना के माध्यम से स्कैन.
    17. ब्याज की एक पर्याप्त उज्ज्वल डेन्ड्राइट का सामना और ब्याज का एक खंड केंद्रित करने परदेखने के क्षेत्र में, शटर बंद कर दें.
    18. , मोड ईएम बाहर पढ़ने के लिए 1 मेगाहर्ट्ज 16 बिट लाभ, जोखिम समय 100 मिसे, लेजर शक्ति 5% और ईएम 200 हासिल करने के लिए ऑप्टिकल विन्यास 3 डी सिम 488 और कैमरा सेटिंग्स करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें.
      नोट: बुर्ज 2 में हरी फिल्टर चयन किया गया है कि जाँच करें और बुर्ज 1 खाली है.
    19. झंझरी 'चलती' करने के लिए सेट कर दिया जाता है कि जांच करें और लेजर प्रकाश के साथ और कैमरे के माध्यम से नमूना देखने के लिए लाइव क्लिक करें.
    20. देखो सारणी को सक्रिय करें.
    21. यदि आवश्यक हो तो ब्याज की वस्तु सेंटर और अतिरिक्त ठीक करने के लिए सेट ध्यान केंद्रित गति के साथ ध्यान केंद्रित.
      नोट: पढ़ने के लिए बाहर मोड में ईएम 1 मेगाहर्ट्ज 16 बिट लाभ, एक अच्छा सिम छवि के लिए लक्ष्य तीव्रता 30,000-45,000 के बीच है.
    22. जल्दी ईएम 1 मेगाहर्ट्ज 16 बिट हासिल पढ़ने के लिए बाहर मोड में 30,000-45,000 के बीच एक तीव्रता मूल्य प्राप्त करने के लिए कैमरा सेटिंग्स समायोजित. प्रारंभ में उपयोग करें:
      1. लेजर शक्ति: 0% - 20% (ऊपर वर्णित के रूप में तैयार नमूनों, 5% या 2.6 मेगावाट के साथ पर्याप्त है)
      2. एक्सपोजर समय:50 मिसे-2 सेकंड
      3. पढ़ने के लिए बाहर मोड: ईएम 1 मेगाहर्ट्ज 16 बिट लाभ
      4. EM लाभ: 0-300
      5. रूपांतरण लाभ: 1x - 5.1x
      6. Live के लिए प्रारूप: नहीं binning
      7. कब्जा करने के लिए प्रारूप: नहीं binning
        नोट: इन सेटिंग्स के साथ 1.3% विरंजन ± 6.3% नियमित काफी छवि गुणवत्ता 15 प्रभावित हो सकता है जो स्वीकार्य अधिकतम विरंजन, की एक 10% की सीमा के भीतर, हासिल की है.
    23. लाइव देखें बंद करने के लिए रोकें क्लिक करें.
    24. एन डी अनुक्रम पैनल में 3 डी जेड ढेर की सेटिंग कॉन्फ़िगर करें:
      1. रेंज: 2 माइक्रोन
      2. सेट आकार: 120 एनएम
      3. जेड विमान
      4. घर की स्थिति क्लिक करें
      5. लैम्ब्डा अनुभाग में ऑप्टिकल विन्यास 3 डी सिम 488 का चयन करें
    25. एन सिम पैड में अधिग्रहण विधा के रूप में 3 डी सिम का चयन करें.
    26. एनडी अनुक्रम अधिग्रहण भागो और कच्चे डेटा को बचाने के.
    27. फिर ऑप्टिकल विन्यास आई FITC चुने और पूरे नमूना imaged किया गया है जब तक दोहराएँ 8.15-8.27 कदमों
    28. 3 डी छवि पुनर्निर्माण: कदम 8.23 ​​में अधिग्रहीत डेटा या तो सही दूर या बाद में खंगाला जा सकता है. फिर से संगठित स्लाइस या फिर से संगठित ढेर मोड में डिफ़ॉल्ट पुनर्निर्माण सेटिंग्स के साथ जेड ढेर पुनर्गठन द्वारा शुरू करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें.
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जेड के ढेर संकेत कदम आकार के साथ बनाया जाना चाहिए और फिर से संगठित ढेर मोड में खंगाला. हमेशा कच्चे डेटा या, अधिमानतः, एक व्यापक क्षेत्र छवि की तुलना द्वारा खंगाला छवि की वैधता की जांच. पुनर्निर्माण प्रक्रिया के लिए समायोजित किया जा सकता है कि मापदंडों के विपरीत है और उच्च आवृत्ति शोर दमन कर रहे हैं. उन दोनों ने अलग कच्चे छवि गुण पुनर्निर्माण प्रक्रिया के दौरान ध्यान में रखा जाता है कि कैसे प्रभावित करते हैं. कम मॉडुलन गहराई कच्चे डेटा के मामले में, इसके विपरीत पैरामीटर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. उपयोगकर्ता एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ डेटासेट है, तो उच्च आवृत्ति शोर दमन पैरामीटर पुनर्निर्माण गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं एसईverely.
    29. जब समाप्त, केंद्र XY मंच में इमेजिंग और सभी तरह से नीचे अपने आराम की स्थिति के लिए उद्देश्य चाल है.
    30. नमूना अनमाउंट और 95% इथेनॉल के साथ नमूना और उद्देश्य दोनों साफ.
    31. सॉफ्टवेयर और पीसी बंद और अन्य सभी उपकरणों को स्विच ऑफ.
    32. अधिग्रहीत छवियों के 3D पुनर्निर्माण और रीढ़ वर्गीकरण NeuronStudio सॉफ्टवेयर का उपयोग करने से पहले वर्णित के रूप में 16 (4 चित्र देखें) झगड़ा करने के लिए फ़ाइलों को परिवर्तित करने के बाद बाहर किया जा सकता है.
    33. NeuronStudios सॉफ्टवेयर में पुनर्निर्माण के लिए निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें:
      1. वॉल्यूम: Voxel आयाम: एक्स: 0.03 माइक्रोन; वाई: 0.03 माइक्रोन; जेड: 0.120 माइक्रोन.
      2. Dendrite जांच:; 1.3: अनुपात अटैच न्यूनतम लंबाई: 5 माइक्रोन; Discretization अनुपात: 1; जंक्शनों फिर से संगठित करना: हाँ.
      3. न्यूनतम ऊंचाई: पता लगाने रीढ़ 0.2 माइक्रोन; अधिकतम ऊंचाई: 5.001 मीटर; अधिकतम चौड़ाई: 3 माइक्रोन; न्यूनतम ठूंठदार आकार: 10 voxels; न्यूनतम गैर ठूंठदार आकार: 5 स्वरएल्स.
      4. गर्दन अनुपात (सिर गर्दन अनुपात): क्लासिफायरफ़ाइल रीढ़ 1.1; पतला अनुपात: 2.5; मशरूम का आकार: 0.35 माइक्रोन;
    34. Neurite शिखर आकार: प्रतिपादन के लिए इस्तेमाल किया NeuronStudio मापदंडों ठोस ग्रहण; Neurite शिखर रंग: प्रकार से; Neurite बढ़त आकार: रेखा; Neurite बढ़त का रंग: एकल रंग; आकार रीढ़: ठोस ग्रहण; रीढ़ रंग: प्रकार से.
      नोट: 3D पुनर्निर्माण यह मात्रा प्रस्तुत करना स्थापित करने के लिए भी संभव है के बाद. डिफ़ॉल्ट सीमा से सक्रिय 'पुनर्जन्म मात्रा प्रतिपादन' विकल्प के साथ 20 के लिए स्थापित किया गया था. अपारदर्शिता की जाँच की 'स्वचालित तीव्रता' द्वारा स्थापित किया गया था. 'सतह केवल' और 'में उपयोग प्वाइंट पूर्व प्रतिपादन' विकल्प भी सक्रिय थे

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Representative Results

यहाँ वर्णित सिम का उपयोग इन विट्रो में चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines इमेजिंग के लिए एक मानकीकृत काम कर प्रोटोकॉल है. प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह और इसके महत्वपूर्ण कदम चित्र 1 में दिखाया गया है. कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल संस्कृति, विकास और चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स और immunohistochemistry के अभिकर्मक सहित नमूना तैयार करने की एक पहले चरण में अलग प्रयोगात्मक कार्य के लगभग 2 सप्ताह लग जाते हैं, और दूसरे चरण सिम का उपयोग नमूना इमेजिंग की. चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स लगभग 2 सप्ताह न्यूरॉन्स कई वृक्ष के समान spines 3,5 असर जटिल वृक्ष के समान arbors विकसित किया है जब संस्कृति की शुरुआत के बाद तय कर रहे हैं. वर्गों 1-8 में विस्तार से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह सुपर संकल्प के साथ व्यवस्थित छवि वृक्ष के समान spines के लिए संभव है. 16 से पहले वर्णित है कि confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक पारंपरिक वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग विधि के साथ तुलना में,17, सिम का उपयोग के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल की अनुमति, काफी बेहतर छवि संकल्प और 3 डी पुनर्निर्माण प्रदान करता है जल्दी filipodia से रीढ़ की हड्डी की तरह संरचनाओं को लेकर न्यूरॉन झिल्ली protrusions की पहचान और वर्गीकरण.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजना एक प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह अपने कदम और समय पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Confocal (ए) और सिम माइक्रोस्कोपी (बी) के साथ imaged dendrites और वृक्ष के समान spines के प्रतिनिधि micrographs. धारा 8 में वर्णित के रूप में प्रतिनिधि सिम माइक्रोग्राफ अधिग्रहण कर लिया था, प्रतिनिधि confocal माइक्रोग्राफ यू अधिग्रहण कर लिया था30 माइक्रोन लेजर बिजली 2.6 मेगावाट, कोई औसत: शारीरिक पिनहोल आकार गाते हैं. अधिग्रहण 16 से पहले के रूप में वर्णित NeuronStudio सॉफ्टवेयर का उपयोग कर confocal और सिम छवियों (क्रमशः सी और डी,) से खंगाला गया. डेन्ड्राइट का पता लगाया गया और कांटा ऐसी गर्दन की लंबाई, गर्दन व्यास और सिर व्यास के रूप में मुख्य मापदंडों का समायोजन के बाद सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप में वर्गीकृत किया गया. बॉक्सिंग क्षेत्रों confocal (ए) और सिम (बी) के साथ imaged और संकल्प और परिणामस्वरूप 3D पुनर्निर्माण की सटीकता में मतभेद का चित्रण उनके इसी जेड के ढेर (सी और डी), से खंगाला एक व्यक्ति वृक्ष के समान रीढ़ दिखा. सिम के उच्च संकल्प के अनुसार, हेड (ई) और गर्दन (एफ) दोनों की मात्रात्मक विश्लेषण व्यास का पता चलता है कि सिम वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी में छोटे परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है यह दर्शाता है कि एक ही वृक्ष के समान spines के लिए confocal माइक्रोस्कोपी से सिम उपायों काफी छोटे आयाम,. डी ई और एफ में अता संदर्भ confocal माप के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. परिणाम confocal और सिम खुर्दबीन दोनों मोड में imaged 5 वृक्ष के समान क्षेत्रों से निकाले 3 वृक्ष के समान spines के मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. गर्दन व्यास के लिए confocal (100.0 ± 4.296 सामान्यीकृत यूनिट) और सिम (50.61 ± 7.642 सामान्यीकृत यूनिट) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (पी ** = 0.0049) वहाँ था छवियों, एक छात्र टी परीक्षण (ई) के साथ परीक्षण के रूप में. सिर व्यास के लिए confocal (100.0 ± 6.255 सामान्यीकृत यूनिट) और सिम (58.12 ± 9.451 सामान्यीकृत यूनिट) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (* = पी .0209) वहाँ था छवियों, एक छात्र टी परीक्षण के साथ परीक्षण के रूप में.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्क्रीनशॉट इस प्रोटोकॉल में वर्णित सेटिंग्स के साथ Nikon है एनआईएस तत्वों 6.14 सिम सॉफ्टवेयर पैकेज से.

ve_content "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 4
NeuronStudio 3D पुनर्निर्माण और एक डेन्ड्राइट के एक प्रतिनिधि छवि की रीढ़ वर्गीकरण सॉफ्टवेयर से 4. स्क्रीनशॉट चित्र.

तालिका 1
अभिकर्मकों की तालिका 1. सूची. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस अनुच्छेद में सिम का उपयोग इन विट्रो में सुसंस्कृत चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स से छवि वृक्ष के समान spines के लिए काम कर रहे एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति विधि Kaech और बैंकर 18 से वर्णित मूल विधि का एक रूपांतर है. शराब बनानेवाला एट अल 19 द्वारा वर्णित के रूप में मुख्य अंतर, Neurobasal/B27 संस्कृति astroglial फीडर संस्कृतियों की आवश्यकता है, जो समाप्त मध्यम, और glial प्रसार को दबा जबकि neuronal अस्तित्व को बढ़ावा देता है, जो 3 दिन पर mitotic अवरोध करनेवाला FUDR के अलावा के प्रयोग कर रहे हैं.

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. कोशिकाओं थाली करने के लिए इस्तेमाल किया coverslips की मोटाई एक सटीक सिम प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है. Coverslip तैयारी और कोटिंग दौरान बाँझपन महत्वपूर्ण है. पाली एल lysine इलाज coverslips 2.3 और 2.4 के दौरान सूखा मत देना. कदम 5.8 में इस्तेमाल किया लौ पॉलिश पिपेट का व्यास महत्वपूर्ण है.बहुत संकीर्ण एक टिप बाद के चरणों में कम सेल व्यवहार्यता का परिणाम देगा. के रूप में जल्दी के रूप में संभव हिप्पोकाम्पी के अलगाव उच्च सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करेगा. ऊष्मायन और trypsin सांद्रता के समय उच्च सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Trypsin enzymatic गतिविधि की हानि भी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं. अंत में, कदम 5.14 में FUDR के अलावा न्यूरॉन अस्तित्व को बढ़ावा देने और glial प्रसार रोकना महत्वपूर्ण है.

नमूना इमेजिंग चरण सीधा है कड़ाई प्रोटोकॉल तत्काल उनके रूपात्मक सुविधाओं के अनुसार वृक्ष के समान spines विश्लेषण और वर्गीकृत करने के लिए 3 डी में खंगाला जा सकता है कि सुपर संकल्प छवियों के अधिग्रहण में यहाँ और परिणाम वर्णित के बाद किया जाता है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, सिम मोड में अधिग्रहण कर लिया छवियों की गुणवत्ता ही माइक्रोस्कोप के confocal मोड का उपयोग कर हासिल बिल्कुल उसी वृक्ष के समान क्षेत्रों और व्यक्तिगत कांटा की छवियों की तुलना में काफी बेहतर है. यह परिणाम था पता चलता हैटी सिम का उपयोग आंकड़े 2 ई और 2 एफ में मात्रा के रूप में वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी में सूक्ष्म परिवर्तन, अधिक से अधिक छवि के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान कर सके.

अब तक, ज्यादातर (फ्लोरोसेंट) व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के कारण इसकी कम phototoxicity के लिए, छवि जीवित कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी कारण इसकी कम phototoxic प्रभाव और पारंपरिक (जेनेटिक) fluophores साथ अच्छा संयोजन के लिए, सिम अनुमति देता जीवित कोशिकाओं इमेजिंग और सुपर संकल्प पर व्यक्त कोशिकाओं कम fluophore में वृक्ष के समान spines की पहचान. ऐसे STED या हथेली के रूप में अन्य सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तरीकों की तुलना में, सिम विट्रो में चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के इमेजिंग के लिए एक त्वरित और किफायती तरीका प्रदान करता है. अभ्यास में सिम केवल पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में दो गुना से संकल्प बढ़ जाती है.

सिम की सीमा का एक उदाहरण यह प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है, जिसमें कि हैकुछ प्रयोगात्मक setups लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है. यह अंत करने के लिए, जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप प्रतिदीप्ति पर भरोसा नहीं है जो माइक्रोस्कोपी तकनीक एक संभव समाधान उपलब्ध करा सकता है. फिर भी, विशेष रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक थकाऊ, महंगा एक धीमी प्रक्रिया है. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ही तय नमूने पर किया जा सकता है. इसलिए, सिम जीवित कोशिकाओं के सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग प्लाज्मिड अभिकर्मक लागू करने के लिए तर्क यह विभिन्न कक्षों से डेन्ड्राइट के ओवरलैप और व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines की पहचान को रोकने, अलग कक्षों की एक दुर्लभ, अभी तक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य cytoplasmic लेबलिंग में यह परिणाम है. Immunostaining के साथ अभिकर्मक के संयोजन प्रतिदीप्ति 17 को बढ़ाने के लिए पहले से दिखाया गया है. फिर भी, अन्य फ्लोरोसेंट तकनीक भी सिम के साथ वृक्ष के समान spines के इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए पर्याप्त फ्लोरोसेंट धुंधला हाल ही में डे के अधिग्रहण का उपयोग किया जा सकता हैveloped actin के बंधन जांच 20.

हाल ही में तकनीकी विकास उच्च गति संरचित रोशनी खुर्दबीन 11 हर्ट्ज 13, के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का एक बहुत ही तार्किक भविष्य आवेदन करने के लिए ऊपर फ्रेम दर पर 100 एनएम संकल्प में सक्षम है कि प्रदर्शन, गतिशील सेल इमेजिंग के लिए सिम के आवेदन की अनुमति दी है के बाद से समय चूक लाइव चूहे प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की सिम और वृक्ष के समान रीढ़ आकारिकी में तेजी से गतिशील परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए अपने आवेदन किया जा सकता है. इस एप्लिकेशन के लिए अगली चुनौती लाइव माइक्रोस्कोपी के लंबे समय अंतराल के साथ जुड़े उम्मीद संचयी phototoxicity हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम सीपीएफ के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) से एक VIDI अनुदान संख्या H64.09.016 द्वारा वित्त पोषण किया गया था. सीपीएफ उसके आलोचकों की टिप्पणियों और अंतिम पांडुलिपि पर सुधार के लिए डॉ. Silvina ए Fratantoni के लिए आभारी है. GMRDL / EMMM डच प्रौद्योगिकी फाउंडेशन NWO का हिस्सा है जो STW (परियोजना 12151 और 11350),, और जो आंशिक रूप से आर्थिक मामलों के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा समर्थित हैं. हम सहायता और समर्थन के लिए Nikon उपकरण यूरोप BV की कैथरीन किट्स और पीटर Drent धन्यवाद. सेमी अनुदान वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (अनुदान 820.02.006) द्वारा समर्थित किया गया रॉयल डच कला और विज्ञान अकादमी (अनुदान 11CDP10) और गुम्मट द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

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References

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