على الورق اللونية الكشف عن

JoVE Journal
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bisha, B., Adkins, J. A., Jokerst, J. C., Chandler, J. C., Pérez-Méndez, A., Coleman, S. M., Sbodio, A. O., Suslow, T. V., Danyluk, M. D., Henry, C. S., Goodridge, L. D. Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water. J. Vis. Exp. (88), e51414, doi:10.3791/51414 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يصف هذا البروتوكول الكشف اللونية السريع للالقولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه الزراعية. هنا، يتم تصفية المياه من خلال التعديل العقيمة مور مسحات (MMS)، والتي تتكون من مرشح الشاش بسيطة المغلقة في خرطوشة من البلاستيك، لتركيز البكتيريا. بعد الترشيح، يتم تنفيذ التخصيب غير انتقائية أو انتقائية للبكتيريا المستهدفة في MMS. للكشف اللونية من البكتيريا المستهدفة، ثم يتم يعاير التخصيب باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) جزءا لا يتجزأ مع البكتيريا الإرشادية ركائز. كل الركيزة يتفاعل مع الانزيمات البكتيرية الهدف الإرشادي، وتوليد المنتجات الملونة التي يمكن أن يتم الكشف عن البصر (الكشف النوعي) على μPAD. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد الصور الرقمية من μPADs تفاعلت مع المسح المشترك أو أجهزة التصوير وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ، آلخوار لمزيد من التفسير الموضوعي وموحدة من النتائج. على الرغم من أن تصميم إجراءات الفرز البيوكيميائية لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية المذكورة آنفا، في بعض الحالات تنتج الأنزيمات التي كتبها مجهريات البقعة الخلفية أو تدهور ركائز اللونية قد تنتج إيجابية كاذبة. وبالتالي، هناك حاجة إلى تأكيد التشخيص باستخدام أكثر التمييزية. ومع ذلك، وهذا التركيز والكشف عن منصة البكتيرية غير مكلفة وحساسة (0.1 كفو / مل حد الكشف)، من السهل القيام بها، والسريع (يتم تنفيذ التركيز، والإثراء، والكشف غضون ما يقرب من 24 ساعة)، لتبرير استخدامه كطريقة الفحص الأولي لجودة الميكروبيولوجية للمياه الزراعية.

Introduction

من المهم أن يتم الكشف عن الأمراض المنقولة بالأغذية وكلاء بسرعة ويفضل في إعدادات ميدانية من أجل الحد من عبء الأمراض المنقولة بالأغذية. وتشمل استراتيجيات مشتركة للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة عن طريق الأغذية التنميط الكيمياء الحيوية، وزراعة انتقائية والتفضيلية، والعزلة المناعية والكشف، والكشف الجزيئي. غير أن ما يعرقل هذه الأساليب التي تلوث متفرقة، وأحجام عينة صغيرة اختبارها، وتركيزات منخفضة في كثير من الأحيان من البكتيريا المسببة للأمراض المنقولة عن طريق الأغذية، تتطلب أوقات المعالجة طويلة، و / أو غير قابلة للتطبيق لإعدادات المجال. علاوة على ذلك، في كثير من المركبات المصفوفات الغذائية المثبطة لكشف والتطبيقات التشخيصية. من أجل تحسين احتمالات الكشف عن الجراثيم، واقترحت إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية أن اختبار المياه الزراعية (مثل مياه الغسيل ومياه الري) التي إما يأتي في اتصال مع مساحة كبيرة من المنتجات الطازجة أو بمثابة وسيلة لعتلوث roduce هو بديل قابل للتطبيق لاختبار مباشرة من المواد الغذائية 1. وحتى مع ذلك، وغالبا ما تكون منخفضة الطبيعية الممرض الأعباء إلى جانب تأثير التخفيف من عينة تمثيلية المياه الزراعية يجعل طرق إعداد العينات للتركيز الممرض الأساسية. ان مثل هذه الطريقة تتطلب أخذ العينات كميات كبيرة من المياه (≥ 10 L)، كافية الممرض على التركيز، والتوافق مع استراتيجيات الكشف المصب.

مسحات مور تعديل (MMS) هي أجهزة غير مكلفة وبسيطة، وعرة تستخدم لتركيز البكتيريا من كميات كبيرة (≥ 10 لتر) من الماء 2-4. يتكون MMS من شريط من البلاستيك مليئة الشاش، والتي هي بمثابة فلتر الخشنة لكميات كبيرة من المياه التي يتم ضخها من خلال الكاسيت باستخدام مضخة تحوي. رسائل الوسائط المتعددة هي طريقة غير التمييزي لتركيز البكتيريا (≥ تركيز 10 أضعاف) الذي يلتقط المواد العضوية وغير العضوية الجسيمات بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة في معالجة لىعينات مضغة. فمن المرجح أن فعالية ممتازة للتركيز الكائنات الدقيقة المستهدفة من قبل MMS يمكن تفسير حقيقة أن من المتوقع أن تعلق على جزء الطمي أو الطين العضوية المجاميع الصغيرة من المواد الصلبة العالقة 3 الكائنات الحية الدقيقة. تصميم وعرة للMMS يسمح للتغلب على أوجه القصور المرتبطة معظم طرق الترشيح الأخرى لالتقاط وتركيز البكتيريا من المياه، مثل انسداد المرشحات، وعدم القدرة على معالجة كميات كبيرة، وعينات فلتر مع العكارة العالية، وارتفاع التكاليف. لهذه الأسباب، وادارة الاغذية والعقاقير توصي بإدراج لMMS في الإجراءات الرسمية لإجراءات جمع العينات البيئية والمتعلقة تنتج-5.

هنا، يتم وصف طريقة لتركيز، والإثراء، والكشف عن الإشريكية القولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة من المياه الزراعية. ويستخدم MMS للتركيز جرثومةeria، وأيضا بمثابة سفينة لتخصيب البكتيرية انتقائية أو غير انتقائية. ويتحقق كشف البكتيريا كيميائيا باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) 6. يمكن تصنيعها μPADs كشبكات فلويديك أو اختبارات البقعة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك ضوئيه والطباعة النافثة للحبر، وختم، والشمع الطباعة 7-11. يمكن أمثلة من التصاميم فلويديك تكون أنماط قناة شجيري حيث يترسب العينة في الوسط وبعد ذلك يتدفق إلى الخزانات البعيدة أو أنماط قناة واحدة التي يتم فيها سحب العينة أو الركيزة من الخزانات الخارجية للقناة عن طريق عمل شعري في مركز 12. لهذا البروتوكول، الذي اخترناه لتوظيف لمدة 7 ملم قطرها الشمع ورقة صفائف بقعة جعلهما مع ركائز مولد اللون التي يمكن معالجتها بواسطة الأنزيمات يدل على الكائنات الحية الدقيقة اختبار هنا: الكلورية الحمراء β-D-galactopyranoside (CPRG) و 5 - برومو كلورو-4-3-indolyl β-D-غلوكورونيد (X-الحلاوة)للكشف عن β-غالاكتوزيداز وβ غلوكورونيداز التي تنتجها E. القولونية؛ كابريلات 5 برومو كلورو 6-3-indolyl (أرجواني كابريلات) للكشف عن C8-استريز التي تنتجها السالمونيلا.؛ و5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-ميو اينوزيتول الفوسفات (X-الشرطة الوطنية العراقية) للكشف عن فوسفتيدلينوستول محددة فسفوليباز C (PI-PLC) التي تنتجها L. المستوحدة 6. وبالتالي، فإن وجود بكتيريا خاصة يمكن ملاحظتها بصريا دون الحاجة إلى معدات معقدة أو تفسير البيانات. خصوصية وحساسية اللونية الكشف μPAD القائم على إنزيم من هذه البكتيريا هدف محدد قد تم استكشافه من قبل 6. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم حساسية طريقة الكشف عن تركيز متكاملة لهذه البكتيريا المستهدفة من قبل ارتفاعه كميات كبيرة من الماء مع المستويات المحددة مسبقا من الكائنات الحية الدقيقة (بيانات غير منشورة وبيشة وآخرون 13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تركيز البكتيريا من كميات كبيرة من المياه للأغراض الزراعية عن طريق MMS

  1. إعداد MMS
    1. قطع مستطيلة المقطع من 4 رقائق جبن قياس 40 × 12 سم.
    2. طي القماش القطني على طول المحورين للحصول على مستطيل من 20 × 6 سم.
    3. لفة القماش القطني بإحكام على طول المحور الطويل لتشكيل أسطواني مسحة من حوالي 6 سم و 3 سم في القطر.
    4. الأوتوكلاف مسحة القماش القطني في رقائق الألومنيوم، لا الأوتوكلاف الكاسيت. تطهير الكاسيت عن طريق نقع لمدة 30 دقيقة في 10٪ التبييض المنزلية، وتنشيط الكلور المتبقي عن طريق نقع الكاسيت لمدة 15 دقيقة في ماءات خماسية ثيوسلفات الصوديوم (نا 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) الحل (50 ملغ / لتر أعدت في الماء المعقم).
    5. إدراج مسحة في الكاسيت MMS.
      ملاحظة: إذا تم استخدام نسخة غير القابل للتصرف من الكاسيت MMS، وتبدأ مع ورقة 4 رقائق من القماش القطني ليasuring 80 × 22 سم، وأضعاف ذلك إلى 40 × 11 سم وألفه لتشكيل الاسطوانة حوالي 11 سم و 6 سم في القطر.
    6. تجميع MMS.
    7. نعلق الفينيل الأنابيب إلى صنابير على جانبي MMS، وضمان أنابيب تلتزم بالكامل إلى صنابير، وإصلاح أنابيب إلى مضخة تحوي. التأكد من أن أنابيب المنبع للمضخة تحوي هو من طول كافية لأخذ العينات.
  2. تركيز البكتيريا
    1. عينة لا يقل عن 10 لتر من المياه المستخدمة في الزراعة عن طريق تشغيل مضخة تحوي بسرعة عالية.
    2. بعد أخذ العينات اكتمال سحب مضخة مدخل تحوي عينة من المياه ومتابعة تشغيل المضخة حتى يتم احترام أي مياه تخرج من النفايات السائلة MMS.
    3. إذا تم استخدام متعددة لتشغيل عدة عينات في نفس الوقت، وجمع النفايات السائلة من كل MMS، وعندما يتم تصفية 10 L من خلال MMS واحدة إغلاق صمام لذلك MMS خاصة ومتابعة تشغيل المضخة.
      1. عند أخذ العينات طق الانتهاء، سحب مضخة مدخل تحوي من المياه للأغراض الزراعية، وفتح كل صمامات مشعب، ومتابعة تشغيل المضخة حتى يتم احترام أي مياه النفايات السائلة التي تخرج من MMSS.
  3. عندما تم الانتهاء تركيز لجميع MMSS، وإزالة بعناية أنابيب الفينيل من صنابير MMS وغطاء صنابير على كلا الجانبين من MMS. ويمكن تخزين MMS توج بإحكام لمدة تصل إلى 12 ساعة قبل أن يضيف وسائل الإعلام تخصيب اليورانيوم.

2. MMS إثراء وإعداد نموذج

  1. تخصيب
    1. فك غطاء MMS، وجو معقم و مطهر إضافة 20 مل من مرق تخصيب معقمة مناسبة. استخدام أحد MMS لكل تخصيب انتقائية. بدلا من ذلك، إجراء تخصيب غير انتقائية لنشر جميع البكتيريا المستهدفة الثلاث في نفس العينة.
      ملاحظة: إذا تم استخدام نسخة غير القابل للتصرف من الكاسيت MMS، وإزالة جو معقم و مطهر مرشح القماش القطني من الكاسيت ووضع في كيس معقم قبل الإعلانقرع 225 مل من وسائل الإعلام تخصيب المناسبة.
      1. لإثراء E. القولونية، إضافة 20 مل من الماء مخزنة ببتون (BPW) تستكمل مع 8 ملغ / لتر من هيدروكلوريد فانكومايسين.
      2. لإثراء السالمونيلا.، إضافة 20 مل من BPW تستكمل مع الملحق السالمونيلا (4 مل / لتر).
      3. لإثراء L. المستوحدة، إضافة 20 مل من فيداس UP الليستيريا (LPT) مرق.
      4. للتخصيب غير انتقائي في وقت واحد لجميع الكائنات الحية الدقيقة الثلاث باستخدام MMS واحد، استخدم العالمية مرق preenrichment (UPB).
    2. المسمار غطاء MMS مرة أخرى على بإحكام. تأكد من أن صنابير وتوج بإحكام لتجنب تسرب وتلوث محتمل خلال تخصيب اليورانيوم.
    3. احتضان MMS لمدة تصل إلى 18-24 ساعة في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة. استخدام 42 درجة مئوية لمدة E. كولاي والسالمونيلا. التخصيب انتقائية. استخدام 30 درجة مئوية لمدة L. المستوحدة تخصيب انتقائية، واستخدام 37 & #176؛ C لتخصيب غير انتقائية.
  2. تحضير العينة
    1. عند اكتمال الحضانة، وإزالة MMS من الحاضنة، إرفع قبعة واحدة من صنابير، والاستغناء بلطف حوالي 0.5 مل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بدلا من ذلك، فك MMS وماصة من 0.5 مل من تخصيب بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إذا تم استخدام الإصدار القابل للتصرف لا من الكاسيت MMS، ماصة 0.5 مل من تخصيب من الكيس.
    2. لتحليل اللونية من E. القولونية تخصيب انتقائية، أو لتحليل التخصيب غير انتقائية، يصوتن 0.5 مل من التخصيب في 5 W، 22 كيلو هرتز لمدة 20 ثانية باستخدام sonicator التحقيق.

3. إعداد وتضمينها من ركائز اللونية في μPADs

  1. إعداد ما يكفي من μPADs لكل عينة والهدف اختبارها. للكشف عن E. القولونية إعداد CPRG وX-الحلاوة μPADs، على السالمونيلا. الكشف عن إعداد μPADs MC، وL. monocytكشف ogenes إعداد μPADs X-الشرطة الوطنية العراقية.
    1. إعداد العازلة HEPES [0.1 M HEPES مع 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)] لركائز اللونية وضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت وفقا لالركيزة التي على وشك أن يستخدم: 7.5 درجة الحموضة لإعداد CPRG أو X-الحلاوة، الرقم الهيدروجيني 9 للمولودية، ودرجة الحموضة 7 لX-الشرطة الوطنية العراقية.
    2. إعداد الحلول الأسهم من ركائز في درجة الحموضة تعديلها العازلة HEPES بتركيزات 3 ملي (CPRG)، 62.5 ملم (X-الحلاوة)، 15 مم (MC)، و 100 ملي (X-الشرطة الوطنية العراقية). حماية حلول الأسهم من الضوء.
    3. وضع μPADs داخل طبق بتري معقمة، ثم يسجي على microspot μPAD مع 24 ميكرولتر من كل الركيزة محلول المخزون.

4. كشف وتحليل البيانات

  1. كشف
    1. إضافة 6 ميكرولتر من العينة المخصب إلى كل microspot μPAD المناسبة الواردة في طبق بتري.
    2. ضع الغطاء الخلفي على طبق بتري وختم ذلك مع parafilm.
    3. احتضان العينةمع μPAD عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 ساعة للسماح للتنمية اللون وجفاف microspots.
  2. الفحص البصري للنتائج
    1. تنفيذ الكشف عن طريق التفتيش البصري البسيط للتغيرات لون μPADs.
      ملاحظة: بشكل عام، من المتوقع أن تنتج ردود فعل قوية يتغير لون نهائي التالية 18-24 ساعة من التخصيب، والتي ينبغي أن تغني عن الحاجة إلى مزيد من التوضيح وينبغي النظر الإيجابية.
    2. تحديد وجود E. القولونية عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير CPRG من الأصفر إلى الأحمر البنفسجي وmicrospots جعلهما مع تغير X-الحلاوة من عديم اللون إلى اللون الأزرق والأخضر.
    3. تحديد وجود L. المستوحدة عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير X-الشرطة الوطنية العراقية من عديم اللون إلى النيلي.
    4. تحديد وجود النيابة السالمونيلا. عينة إيجابية من خلال مراقبة microspots جعلهما مع تغير MC من عمودorless إلى الأرجواني والبنفسجي.
  3. البرمجيات بمساعدة تحليل البيانات
    ملاحظة: أجريت لتحديد ما إذا كانت ردود الفعل بوضوح ضعف إيجابية أو سلبية، وتمكين تحليل شبه الكمي للنتائج.
    1. السماح للμPADs لتجف تماما.
    2. مسح μPAD باستخدام ماسح ضوئي سرير مسطح.
    3. استخدام البرمجيات يماغيج لمعالجة الصورة.
      1. "فتح" الصورة الممسوحة ضوئيا ليتم تحليلها في ImageJ تقع تحت "ملف" علامة على القائمة الرئيسية (أو اضغط على "CLT + O").
      2. عكس الصورة اختيار "عكس" الموجود تحت "تحرير" علامة على القائمة الرئيسية (أو اضغط على "CLT + شيفت + I").
      3. استخدام "تحليل" علامة على القائمة الرئيسية واختيار "مجموعة المقاييس ..." لتحديد قياسات ذكرت تحليلها.
      4. تأكد من أن "كثافة رمادي متوسط"، "الحد الى عتبة" و "مربعات التسمية العرض" هيفحص، ثم اضغط على "موافق". هذا يحدد كيف البرنامج يحلل كل المنطقة المحددة وكيف يفيد ذلك.
      5. استخدام "البيضاوي" أداة لرسم دائرة التي تحدد المنطقة التي تريد لقياس الداخل.
      6. تحت عنوان "تحليل" التبويب حدد "القياس" (أو اضغط على "CLT + M"). يقوم البرنامج قياس متوسط ​​كثافة اللون الرمادي ضمن المنطقة المحددة ورفع تقرير بذلك في شاشة المنبثقة التي يمكن نسخها ولصقها على التفوق لمزيد من التحليل.
        ملاحظة: للحصول على تحليلات أكثر دقة، ويجب أن يتم تنفيذ اثنين على الأقل مكررات التقنية لكل عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح في هذا البروتوكول، وتركيز البكتيريا باستخدام رسائل الوسائط المتعددة (الشكل 1) لا يمكن أن يؤديها في حوالي 15-20 دقيقة. وMMS في شيدت من الستايرين الأكريلونيتريل (ABS) في اثنين من مكونات منفصلة؛ غطاء وخرطوشة على حد سواء مع التجمع حنفية دمجها والتي يتم إدراجها في شاش مسحة أسطواني (الشكل 1A). ثم يتم ثمل كل من المكونات معا تشكيل MMS (الشكل 1B). هو الدافع وتجهيز مقرها MMS-بواسطة مضخة تحوي بطارية تعمل بالطاقة، والسماح للعينات إلى التركز في إعدادات المجال. وذلك بربط تركيز MMS، انتقائية التخصيب (18-24 ساعة)، وμPADs؛ المياه الزراعية يمكن أن تكون بسرعة (حوالي 24 ساعة)، بسهولة، وفحص بثمن بخس لمسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الهامة والكائنات الحية الدقيقة المؤشر، بما في ذلك E. القولونية، السالمونيلا، وL. المستوحدة. مع هذا البروتوكول، وهذه البكتيريا يمكن الكشف عن الهدف إد عند مستويات منخفضة مثل 0.1 كفو / مل. تستند المقايسات μPAD على الكشف عن البكتيريا الإرشادية الإنزيمات التي تتفاعل مع ركائز اللونية (الشكل 2). فحوصات الكشف عن E. القولونية، ولكن ليس E. كولاي O157: H7، إنتاج منتج الأخضر والأزرق (الشكل 2A). وبالمثل، فإن الفحص الذي يكشف أغلبية E. سلالات القولونية تنتج ناتج التفاعل الأحمر البنفسجي (الشكل 2B). فحوصات الكشف عن السالمونيلا. (الشكل 2C) وL. المستوحدة (الشكل 2D) تنتج الأرجواني والبنفسجي والنيلي الألوان، على التوالي. الاختبار يمكن تفسيرها من قبل العين (نوعيا)، والأحكام البصرية وعادة ما تكون مرضية للتمييز بين العينات الإيجابية والسلبية. بدلا من ذلك، الصور الرقمية يمكن التلاعب بها باستخدام برنامج يماغيج (الشكل 3A) للسماح لأكثر موضوعية وموحدة تفسير البيانات (الشكل 3B).

ق ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. والتعديل مور المسحة (MMS) الكاسيت. (A) وMMS تفكيكها. يتم إنتاج MMS في طابعة 3-D من الستايرين الأكريلونيتريل (ABS)، ويتألف من ثلاثة عناصر رئيسية هي: خرطوشة مع التجمع حنفية دمجها والتي يتم إدراجها مسحة جبن أسطواني (مطوية 4 رقائق)، وتوج مع غطاء وجود التجمع حنفية متكاملة. (ب) MMS تجميعها.

الرقم 2
الرقم 2. البكتيريا الإرشادية التفاعلات اللونية. ركائز (X-الحلاوة، CPRG، MC، وX-الشرطة الوطنية العراقية) جعلهما في microspots من μPADs تتفاعل مع البكتيريا الإرشادية الإنزيمات (و# 946؛ غلوكورونيداز، β-غالاكتوزيداز، C8-استريز، وPI-PLC) لإنتاج التغيير اللونية. (أ) رد فعل X-الحلاوة إيجابية يعد مؤشرا على النوعية E. القولونية، ولكن ليس E. كولاي O157: H7؛ (ب) رد فعل إيجابي CPRG هو إشارة إلى أن E. القولونية موجودة؛ (C) يشير إلى وجود رد فعل إيجابي MC وجود السالمونيلا.؛ (D) ورد فعل الشرطة الوطنية العراقية X-الإيجابية يدل على وجود L. المستوحدة.

الرقم 3
. الرقم 3 البصرية ويماغيج يحلل من البكتيريا الإرشادية الاختبارات μPAD اللونية ويظهر الصور الرقمية اللونية لكل مقايسة مع كل من السالب (-) وإيجابية الاختبار (+). وأجريت الاختبارات السلبية باستخدام لست] من SPECI البكتيريةوفاق التي لا ترميز الانزيمات المستهدفة والاختبارات إيجابية مع لست] أو التخصيب من البكتيريا المستهدفة. (1) معدلة الممسوحة ضوئيا الصور. (2) الصور الممسوحة ضوئيا تحويلها إلى اللون الرمادي باستخدام برنامج يماغيج، و (3) مقلوب لون الصور عن تفسير لاحق من شدة الرمادي. (4) متوسط ​​كثافة الرمادي قياسها باستخدام يماغيج داخل كل microspot من μPAD (يشار مثال microspot بواسطة السهم الأصفر ودائرة). يبين B متوسط ​​شدة الرمادي (يحدده يماغيج) لكل μPAD اللونية اختبار الإيجابية والسلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة متكاملة للكشف عن E. القولونية، السالمونيلا، وL. المستوحدة في المياه الزراعية. هنا، وتركيز MMS البكتيريا كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه للأغراض الزراعية، ويقترن مع تخصيب البكتيرية، والكشف اللونية بكتيريا الإرشادية باستخدام μPADs. الإجراء MMS يمكن التعامل مع محتوى الجسيمات عالية في عينات المياه مع التركيز على البكتيريا 10 أضعاف، قوي وبسيط لا يكفي التطبيقات الميدانية من قبل أفراد مدربين الحد الأدنى، ويمكن أن يؤديها مع الحد الأدنى من التكاليف. من خلال دمج خطوة تخصيب البكتيرية، ويتم الكشف عن البكتيريا الحية وتعزيز حساسية الأسلوب إلى حد كبير. التخصيب يضاعف الهدف أن يعاير، وعند دمجها مع وسائل الاعلام نمو الانتقائي، ويقلل من نمو مجهريات البقعة غير المرغوب فيها في العينات التي يمكن أن تسهم في تحقيق نتائج إيجابية كاذبة. يتم إجراء الكشف النهائي مع μPADs، والتي توفر بسيطة،فعالة، وسهلة تكلف لتفسير حل للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الهامة. الإجراء بأكمله، بما في ذلك تركيز MMS، والإثراء بين عشية وضحاها، والكشف اللونية، لا يمكن أن يؤديها في غضون يوم واحد، وبالكشف عن التلوث الجرثومي في المستويات القليلة مثل 0.1 كفو / مل.

لتبسيط الطريقة وتقلل من احتمال التلوث، يتم استخدام MMS كحاوية لتخصيب البكتيرية. مضيفا ان هذا التخصيب إلى إجراء يزيد من الحساسية، والنوعية، ويضيف مرونة في الأسلوب. على الرغم من أن ثلاثة فقط التخصيب انتقائية استخدمت هنا، يمكن تطوير وتحسين التخصيب للبكتيريا. على سبيل المثال، ونحن استكشاف إمكانية دمج محرضات محددة في وسائل الإعلام تخصيب لتعزيز إنتاج الانزيمات مراسل المستخدمة للكشف اللونية.

وμPADs تستخدم للكشف عن العوامل المسببة للأمراض بسيطة إلى استخدام صفائف بقعة واحدة التي تكلف اقل من $ 0.002/device قبل إضافة لمراسل الركيزة اللونية. حتى يمثل للمواد التخصيب وركائز اللونية، وتكلفة كل اختبار هو بضعة سنتات، باستثناء L. المستوحدة الاختبار الذي يقدر بمبلغ 1.28/test بسبب التكلفة العالية حاليا من X-الشرطة الوطنية العراقية. مع ذلك، هذه التكلفة تقل عن مثيلاتها في طرق الكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الحالية 6. في شكلها الحالي، يجب أن يكون مستعدا للμPADs على الفور قبل الاختبار بسبب ضعف الاستقرار الركيزة. للتغلب على هذا القيد، ونحن اختبار بالإضافة استقرار المضافة وتقييم التخزين الجاف لزيادة الركيزة / μPAD الصلاحية. بالإضافة إلى ذلك، نحن نعمل على تطوير μPADs المضاعفة باستخدام عدة مواقع عينة / كاشف متصلة مع بعضها البعض بواسطة قنوات ميكروفلويديك.

على الرغم من المزايا سبق تفصيله لاختبار μPAD، مشاكل مع الفحص خصوصية ممكنة: 1) الإنزيمات مراسل ليست الاستبعادأنتجت الاستثمار بقوة ببرامج من البكتيريا المستهدفة، قد تسهم بالتالي تلويث مجهريات البقعة الخلفية إلى نتيجة إيجابية كاذبة. 2) إذا استمرت الجسيمات داكنة اللون في وسائل الإعلام تخصيب، فإنه يمكن أن تحجب التحليل البصري ويماغيج عندما نقل إلى μPAD. 3) الفحص الحالية لا يمكن الكشف تحديدا E. O157 كولاي: H7. وبالتالي، فإن هذه الطريقة أكثر ملاءمة باعتباره فحص اختبار تقديم دفعة أولية لمزيد من الاختبارات والتأكيد على أن تجرى. ومع ذلك، فإن العديد من هذه العيوب ومعالجتها بسهولة. سوف يشتمل على لوحة أكبر من ركائز اللونية الإرشادية تسمح لمزيد من التحديد الدقيق للبكتيريا المستهدفة، بما في ذلك E. O157 كولاي: H7. وبالمثل، يمكن تخصيب انتقائية إجراءات إضافية تقليل مجهريات البقعة الملوثة في العينة. للحد من تأثير الجسيمات في التخصيب، يمكن أن تستخدم مرشح الخشنة قبل تطبيق العينات إلى μPAD.

في الختام، ثييوضح ق الدراسة أن MMS جنبا إلى جنب مع التخصيب وμPADs يمكن أن تستخدم لكشف مستويات منخفضة من E. القولونية، السالمونيلا. وL. المستوحدة في المياه الزراعية. مع بعض التعديلات، والإجراء هو محمول وقادرة على أن تطبق في إعدادات المجال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agricultural water Irrigation water, produce wash water, well water, etc.
Vinyl tubing Wilmar BN-CVT1005  1/4" inner diameter,  3/8" outer diameter, available at:  http://www.wilmar.com
Modified Moore Swab cartridge  Lumiere Diagnostics 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at:  http://www.lumierediagnostics.com.  Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)
Cheesecloth Chesapeake Wiper & Supply, Inc. CC90 Grade #90, 44 x 36 weave, available at:  www.raglady.com
Household Bleach Various Sodium hypochlorite concentration approx. 6%
Sodium thiosulphate 5-hydrate Mallinckrodt Baker Inc 8100-04
Manifold Built in-house Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings
Peristaltic pump Micron Meters RPP1300 Available at:  http://www.micronmeters.com
Serological pipette Various Disposable, 10 ml
Universal preenrichment broth Difco 223510
Buffered peptone water Difco 218105
Salmonella supplement Biomérieux Industry 42650 http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP Listeria (LPT) Broth Biomérieux Industry 410848 http://www.biomerieux-usa.com
Vancomycin Sigma-Aldrich 861987 http://www.sigmaaldrich.com
Pipet-Aid Various Drummond DP-110 used here
Shaking incubator Various Excella E25, New Brunswick Scientific used here
Micropipette  Various 10 μl, 1 ml
Micropipette tips Various Barrier, 10 μl, 1 ml
1.5 microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase-free
Probe sonicator Q Sonica LLC XL-2000 series
µPADs Avant  Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8022
Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) Sigma-Aldrich 59767
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Sigma-Aldrich B8174
5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)  Sigma-Aldrich 53451
5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)  Sigma-Aldrich 38896
Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm Various Sterile
Flat bed scanner Various Xerox USB scanner
ImageJ software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
  2. Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
  4. McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
  5. Solicitation Number: FDA-SS-1116253. Administration USFaD. (2013).
  6. Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
  9. Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
  10. Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
  11. Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
  12. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. WO2012125781 A3 (2012).
  13. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics