Kombinerad

Medicine
 

Summary

Kombinerad optisk och μCT avbildning i en musmodell av ortopediska implantat infektion, som utnyttjar en bioluminescent konstruerad stam av Staphylococcus aureus, förutsatt att förmågan att icke-invasivt och longitudinellt övervaka dynamiken av bakteriell infektion, såväl som den motsvarande inflammatoriska svaret och anatomiska förändringar i ben.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bernthal, N. M., Taylor, B. N., Meganck, J. A., Wang, Y., Shahbazian, J. H., Niska, J. A., Francis, K. P., Miller, L. S. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. J. Vis. Exp. (92), e51612, doi:10.3791/51612 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multimodalitet avbildning har vuxit fram som en gemensam teknisk strategi som används i både preklinisk och klinisk forskning. Avancerade tekniker som kombinerar in vivo optisk och μCT imaging tillåter visualisering av biologiska fenomen i ett anatomiskt sammanhang. Dessa avbildningsmetoder kan vara särskilt användbart för att studera förhållanden som påverkar ben. I synnerhet ortopediska implantatinfektioner är ett stort problem i klinisk ortopedisk kirurgi. Dessa infektioner är svåra att behandla eftersom bakterie biofilmer bildas på de utländska inopererade material, vilket leder till ihållande inflammation, osteomyelit och eventuell osteolys av benet kring implantatet, vilket i slutändan resulterar i implantatlossning och misslyckande. Här gjordes en musmodell av en infekterad ortopedisk protesimplantat används som involverade den kirurgiska placeringen av en Kirschner-tråd implantatet i en intramedullär kanal i lårbenet på ett sådant sätt att änden av implantatet eXtended i knäleden. I denna modell LysEGFP möss, en mus-stam som har EGFP-fluorescerande neutrofiler, var anställda i samband med en självlysande Staphylococcus aureus-stam, vilket naturligtvis sänder ut ljus. Bakterierna ympades i knäleder hos mössen innan stängning operationsområdet. In vivo självlysande och fluorescerande avbildning användes för att kvantifiera bakteriebördan och neutrofila inflammatoriskt svar, respektive. Dessutom var μCT imaging utförs på samma möss så att 3D-läget för den självlysande och fluorescerande optiska signaler kan ges samtidigt registreras hos de anatomiska μCT bilderna. För att kvantifiera förändringar i benet med tiden, var det yttre benet volym de distala lårbenet mäts vid specifika tidpunkter med hjälp av en halvautomatisk kontur baserad segmenteringsprocessen. Sammantaget kombinationen av in vivo självlysande / fluorescerande avbildning med μCT avbildning kan vara särskilt användbart feller icke-invasiv övervakning av infektionen, inflammatoriska svaret och anatomiska förändringar i ben över tid.

Introduction

Multimodalitet preklinisk avbildningstekniker som innebär en kombination av optisk och anatomisk information gör det möjligt för visualisering och övervakning av biologiska fenomen i 3D 1-4. Eftersom μCT imaging tillåter utsökta visualisering av ben anatomi, använder μCT avbildning i samband med med optisk imaging är en unik kombination som kan vara särskilt användbart för att undersöka processer som involverar ben biologi 5-7. Ett exempel skulle vara att använda dessa tekniker för att studera ortopediska implantatinfektioner, som utgör en förödande komplikation efter ortopediska operationer 8,9. Bakterier biofilmer bildas på implanterade främmande föremål som främjar bakteriernas överlevnad genom att fungera som en fysisk barriär som hindrar immunceller från att känna av infektion och blockerar antibiotika från att komma åt bakterierna 10,11. Den kroniska och ihållande infektion av det gemensamma vävnaden (septisk artrit) end ben (osteomyelit) inducerar benresorption som leder till att lossa av protesen och eventuellt misslyckande 8,9. Detta resulte periprostetisk osteolys är förknippad med ökad morbiditet och mortalitet 12,13.

I vårt tidigare arbete, var in vivo självlysande och fluorescerande avbildning används tillsammans med röntgen och mikro datortomografi imaging (μCT) i en ortopedisk protesleden infektionsmodell hos möss 14-19. Denna modell involverade placera en titan Kirschner-tråd (K-wire) på ett sådant sätt att den avskurna ändan av implantatet utvidgades i knäleden från lårbenet hos möss 14-19. En ymp av Staphylococcus aureus (självlysande stam Xen29 eller Xen36) pipetterades sedan på ytan av implantatet i knäleden innan operationsområdet stängdes 14-19. In vivo optisk avbildning användes för att detektera och kvantifiera de självlysande signaler, vilket motsvarade den nu-mber bakterier i den infekterade leden och benvävnaden 14-19. Dessutom in vivo fluorescens avbildning av LysEGFP möss, vilka har fluorescerande neutrofiler 20, användes för att kvantifiera antalet neutrofiler som emigrerade till de smittade knäleder som innehåller K-tråd implantat 14,19. Slutligen anatomiska avbildningsmetoder, inklusive högupplösta röntgenbilder och μCT bildbehandling, tillåtna respektive 2D och 3D anatomisk avbildning av drabbade benet under hela den tid kronisk infektion, som vi godtyckligt skulle sluta vanligen mellan 2 och 6 postoperativa veckorna 16 , 18. Med hjälp av denna modell, kan effekten av lokal och systemisk antimikrobiell behandling, skyddande immunsvar och patologiska anatomiska förändringar i ben utvärderas 14-18. I detta manuskript var de detaljerade protokoll för optiska och μCT avbildningsmetoder inom detta ortopedisk protesleden infektionsmodell tillhandahålls som en representative system för att studera biologiska processer i den anatomiska sammanhang av benet. Dessa inkluderar kirurgiska ingrepp för att modellera en ortopedisk protesleden infektion hos möss, 2D och 3D in vivo optisk avbildningsförfaranden (för att detektera bakteriella bioluminescenta signaler och fluorescerande neutrofila signaler), μCT avbildning och analys och co-registrering av optiska bilder med 3D μCT bilder.

Protocol

Etik uttalande: Alla djur hanterades i strikt överensstämmelse med god djur praxis som definieras i de förordningar som anges i djurskyddslagen (AWA), 1996 Guide för skötsel och användning av försöksdjur och PHS Policy för Humane Skötsel och användning av försöksdjur och allt djurarbete godkändes av Johns Hopkins Animal Care och användning kommittén (Protokoll: MO12M465).

1. Förbereda Inokulat av Mid-logaritmiska självlysande bakterier

  1. Serie bioluminescent S. aureus-stam Xen29 (eller annat bioluminscent stam som Xen36) på tryptisk soja agarplattor (tryptisk sojabuljong i agar [1,5%]).
    OBS: S. aureus Xen29 21 är en genetiskt S. aureus-stam som innehåller en modifierad lux-operonet härledd från Photorhabdus luminescens, som är integrerat i en stabil nativ plasmid funnen i denna bakteriestam. Dessa motorställda bakterier avger konstitutivt ljus från levande och metaboliskt aktiva celler.
  2. Odla kolonier på plattorna genom att inkubera dem vid 37 ° C under approximativt 16 h (O / N).
  3. Välj enstaka bakterie CFU och kultur i skakning flytande TSB (240 rpm) i ca 16 timmar (O / N).
  4. Utför en subkultur med 1/50 utspädning av O / N kulturen att få mellan logaritmisk tillväxtfas bakterier (ca 2 tim varaktighet).
  5. Pellet, resuspendera och tvätta bakterierna 3x i PBS.
  6. Uppskatta den bakteriella inokula (1 x 10 3 CFU i 2 pl PBS) genom bestämning av optisk densitet absorbans vid 600 nm.
  7. Verifiera CFU i inokulatet efter odling bakterierna O / N på plattor.

2. mus kirurgiska ingrepp

OBS: För dessa experiment, använd en tolv veckor gammal hane LysEGFP möss. Dessa möss besitter förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) som uttrycker myeloida celler (som består av mostly neutrofiler) 20. Bibehåll sterila betingelser under kirurgi och efter kirurgisk prep med betadin och 70% alkohol genom att placera varje mus på en steril duk på toppen av en hård yta vatten cirkulerande värmedyna. Använd klänning, sterila handskar, mask och sterilisera instrument.

  1. Bedöva musen med hjälp av en inhalation 2% isofluran. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Bedöma den lämpliga nivån av anestesi genom att observera andningsfrekvens, muskeltonus, tå nypa, corneal reflex och färg på slemhinnor. Täck mössen med en steril kirurgisk duk med ett hål vid operationsstället på höger knä. Musen ska få understödjande värme åtgärder för att upprätthålla kroppstemperaturen under anestesi. Varm 37 ° C vatten som cirkulerar i en varm vattenmantlad filt eller ett vatten som cirkulerar hårdplast uppvärmda arbetsstation (ProStation, Patterson, Scientific) är bra sätt att förebygga hypotermi.
  2. Injicera buprenorphine (depotberedning) (2,5 mg / kg) subkutant strax före kirurgi. Ytterligare doser av fördröjd frisättning buprenorfin kan administreras på 3 dagars intervall som behövs för smärtlindring.
  3. Raka operativa knä och prep med tre alternerande skurar använder Betadine och 70% alkohol.
  4. Utför en mittlinje snitt i huden som ligger över den högra knäleden. Utöka snittet huden så att extensor mekanismen kan vara väl definierade.
  5. Utför en medial parapatellar artrotomi och sublux quadriceps-patellar tendon extensor mekanism i sidled med en Adson pincett.
    OBS: Detta för intercondylar hack av lårbenet i vanlig vy.
  6. Brotscha manuellt benmärgskanalen med hjälp av en 25 G nål följt av en 23 G nål.
    OBS: För att undvika skador på lårbenet, kan en stabiliserande plattform. Detta bör vara viktigt att tekniken för att minimera oavsiktlig fraktur på femur.
  7. Sätt i en medicinsk kvalitet titan Kirschner-tråd (0,8 mm diameter) med hjälp av en press-fit-teknik, vilket innebär manuellt skjuta den med ett stift hållare, i retrograd riktning in i märgkanalen.
    OBS: Titanium K-kablar användes som det fanns färre artefakter syns på μCT bilder med titan K-trådar jämfört med rostfritt stål K-trådar 16.
  8. Skär i slutet av Kirschner-tråd med stift fräsar, så att den avskurna änden av K-tråden sträcker sig ungefär 1 mm i knäleden utrymmet.
  9. Använd en mikropipett pipett 2 pl 1 x 10 3 CFU av självlysande S. aureus Xen29 på spetsen av implantatet inom knäleden utrymme.
    OBS: Mer volym leder till mer omfattande vävnadskontamination och mindre diskret avbildning.
    OBS: I kontroll oinfekterade möss, tillsätt 2 l av steril koksaltlösning utan några bakterier.
  10. Minska quadriceps-patellar komplex tillbaka till mittlinjen med pincett och stäng liggande subkutana vävnaden och huden med absorbersubkutikulär suturer.
    OBS: Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur förrän återhämtat sig helt.
  11. Vid slutet av experimenten, avlivades alla djur som använder koldioxid inandning enligt Johns Hopkins Animal Care och användning kommittén riktlinjer. Verifiera döden genom att observera djuret inte återhämta sig inom 10 minuter efter exponering koldioxid slutar och halsdislokation.

3 2D Optisk avbildning (in vivo Bioluminescent och Fluorescent Imaging)

  1. Bedöva LysEGFP möss (t.ex. 2% inandning isofluran) och placera dem med ventrala sidan upp i en avbildning kammare.
  2. Utför in vivo självlysande avbildning med IVIS Spectrum optiska hela djuret in vivo imaging-system. Kontrollera först Självlysande och bekräfta valet av en öppen fIlter urval, synfält (FOV) C - 13 cm, och rulla exponeringstiden ner till Auto (autoexponering inställning). Autoexponering justerar automatiskt anskaffningstiden (slutartid), binning (digital pixel binning) och f-stop (bländare) på instrumentet för att optimera signalintensiteten samtidigt undvika mättnad. Klicka sedan på Hämta för att fånga den självlysande bilden.
    OBS: För in vivo självlysande bildbehandling, bild möss mellan 1-5 min.
  3. Utför sekventiell in vivo fluorescerande avbildning genom att markera rutan bredvid Fluorescent. Välj 465 nm excitation filter och 520 nm filter emission. Rulla exponeringstid ner till Auto och välj FOV C (steg 3.2.1). Klicka sedan på Hämta för att fånga fluorescens bilden.
    OBS: För in vivo fluorescerande avbildning, bild möss mellan 0,5 sek.
  4. Kvantifiera in vivo självlysande signaler totala flödet (fotoner / sek) i ett område av intresse (ROI) med hjälp av Living Image programvara genom att först expanderaROI Tools avsnitt i verktygspaletten.
    1. Markera cirkeln ikon och antalet ROI som motsvarar det antal föremål djur i FOV. Ändra storlek på ROI att omfatta regionen av intresse dvs, den självlysande spridningsbild samlas.
    2. Välj Mät ROI i ROI Tools i verktygspaletten och ROI Measurement fönstret visas. Total Radiance (fotoner / sek) värden representerar summan av självlysande punkter inom den genererade ROI.
    3. Välj SELECT ALL och kopiera flikar i det nedre högra hörnet av fönstret kommer att överföra informationen till urklipp och låta klistra in i efterföljande program för analys.
  5. Kvantifiera fluorescerande signaler in vivo som total strålningsutbytet ([fotoner / sek] / [^ W / cm 2]) inom ett cirkulärt område av intresse (ROI) med hjälp av Living bildbehandlingsprogram.
    1. Inom programvarufönstret Living Bild, expandera ROI Verktyg i verktygspaletten. Väljcirkel ikon och antalet ROI som motsvarar det antal föremål djur i FOV.
    2. Ändra storlek på ROI att omfatta regionen av intresse nära motsvarar självlysande signalen från den tidigare bilden förvärvet.
    3. Välj Mät ROI i ROI Tools i verktygspaletten och ROI Measurement fönstret visas.
      OBS: Totala Radiant Efficiency ([fotoner / s] / [^ W / cm 2]) representerar summorna av fluorescerande punkter inom ROI.
    4. Markera alla och kopiera flikarna i det nedre högra hörnet av fönstret kommer att överföra informationen till urklipp och låta klistra in i efterföljande program för analys.

4 μCT Image Acquisition

  1. Placera sövda LysEGFP mössen in i en avbildning kammare.
    OBS: Denna avbildning kammare är utformad för att passa både IVIS Spectrum bildsystem och Quantum FX in vivo μCT bildsystem för att möjliggörasamtidig registrering av optiska och μCT bilder.
  2. Öppna CT programmet och välj Meny förinställda 60 mm FOV std dynamik i list.
  3. Sätt i stor borrning locket och adaptern arm för avbildnings shuttle i instrumentet.
  4. Placera musen imaging shuttle i kurvportarmen skjut in armen i hålet och stäng dörren. Slå på Live-läge (Eye-knappen på kontrollpanelen) och placera motivet vid 0 ° och 90 ° portal position med hjälp av X-axeln och Y-axelkontrollerna för att centrera djuret i X capture fönstret. Stäng sedan Live-läge genom att klicka på Eye-knappen.
  5. Skaffa en dynamisk scan bild med 60 mm FOV genom att klicka på knappen CT Scan (bredvid Live Mode-knappen). Exportera den förvärvade bild i DICOM-format och lagra på en plats som kan nås senare.
    OBS: Den ungefärliga dos att vara 26 mGy per skanning. En 30 mm FOV kan användas om bättre upplösning önskas.

5.3D Optical Image Acquisition, Bildning och μCT Co-registrering

  1. Placera musen bildtransfer insatsen i Spectrum genom att placera bild shuttle innehåller musen till denna insats och se till att musen inte rör sig.
  2. Med hjälp av Living Bild, väljer Bilder Wizard i förvärvet Kontrollpanelen för att starta guiden. För att starta, välj Bioluminescens, sedan DLIT och välj sedan reportern "Bakterier" från rullgardinsmenyn och lämpliga utsläppsfilter för modellen väljs automatiskt, i detta fall 500 till 620 nm.
    1. Välj Nästa och sedan utse de förvärvsparametrar och ämnesinformation i det sista fönstret. Konkret kommer Imaging Ämne bli Mouse, kommer Auto inställningar väljas låta autoexponering för att maximera signalkvaliteten samtidigt undvika mättnad och Synfält kommer att sättas till C - 13cm.
    2. Välj Avsluta i det sista fönstret och sekvensen fönstret av Förvärvet panelen kommer att vara enutomatically i med DLIT sekvensen. Det kommer att finnas en bild som förvärvats per utsläpp filter valda och autoexponering kommer att välja optimala inställningar vid varje våglängd enligt val i guiden Imaging. Den genererade sekvensen innehåller också en strukturerad ljusbild som behövs för ämnet ytgenerering via yttopografin verktyget nedan.
  3. Välj Acquire Sekvens att förvärva DLIT uppgifter.
  4. När bilden förvärvet är klar generera yttopografi. Börja med att expandera fliken yttopografi i verktygspaletten.
    1. Välj sedan riktning som korrekt speglar den sida av djuret inför kameran eller toppen av IVIS instrumentet. Klicka sedan på Generate Surface. Crop den region av FOV som innehåller djuret.
    2. Använd sedan den lila mask för att definiera gränserna för djuret.
      OBS: Maskerings verktyg använder färgkontrast så djur med mörk päls eller hud inte kommer att maskera lämpligt från stage.
    3. Välj Avsluta och ytan kommer att visas automatiskt. Spara resultatet under fliken Yta topografi stäng sedan fliken som vi inte längre behöver den.
  5. Rekonstruera 3D optisk källa position med diffusa optiska rekonstruktionsalgoritmer som genomförs i Living Bild 22 genom att expandera fliken DLIT 3D återuppbyggnad.
    1. Bilder som förvärvats för DLIT sekvensen visas.
      OBS: Programmet kontrollerar automatiskt kvaliteten på de förvärvade data och avmarkera bilder bedöms vara för svag eller om mättnad är närvarande. Välj Start i nedre högra sida.
    2. Vid behov kan man justera tröskeln för varje självlysande bilden genom att dubbelklicka och använda tröskel reglaget längst ned till vänster.
      OBS: detta är främst att omfatta lägre intensitet signal och försiktighet bör praktiseras vid tröskel högre eftersom det kan ställa allmänna intensiteten för den slutliga rekonstruerade källan.
  6. Öppna DICOM webbläsaren genom att klicka på ikonen 3D i verktygsfältet längst upp i programmet (tredje från vänster) och sök efter Quantum FX bilden förvärvats tidigare.
    1. Ladda den här bilden i 3D-fliken Visa Living Bild genom att dubbelklicka på filen för import.
      OBS! Fiducial bör automatiskt och leda till μCT bilden registreras med den optiska 3D-bild.
  7. Avmarkera yttopografin visualisering karta genom att utöka 3D Optiska instrument i verktygspaletten och avmarkera kryssrutan Visa Ämne Yta på fliken Yta.
  8. Manuellt skapa en uppslagstabell för att visualisera skelettet och K-tråd implantatet som är synliga i μCT bilden med histogrammet under fliken Volym av 3D-multi Modality Tools avsnitt i verktygspaletten.
    1. Histogrammet visar fördelningen av voxel nivåer i 3D volymetriska data och deras färg opacitet. För att avgöra var den speciella vävnaden av intresse är i histogrammet, använd reglaget verktyg för att tröskelvärdet för rendering tills vävnaden eller strukturen är synlig.
    2. Högerklicka i histogrammet för att generera poäng och bildar en kurva för att isolera det området i histogrammet. Detta kommer att upprepas för varje struktur - skelett följt av K-wire implantat och kan sparas som en uppslagstabell för framtida analyser.
    3. Komponenter kan vara färgkodade om så önskas genom att dubbelklicka varje genererad punkt i histogrammet och välja önskad färg i popup-fönstret.

6. μCT Bild Visualisering och analys

  1. Med hjälp av Quantum FX mjukvaran, markera bilden av intresse och starta Viewer. Välj roteringsverktyget och omorientera bilden för att visualize den längsgående axeln hos lårbenet. Välj mätningsverktyget och mäta lårbenet längd.
  2. Starta 3D Viewer för att generera 3D-renderingar. Justera tröskelvärdet för att visa förändringar i ben anatomi i samband med implantatinfektion.
  3. Applicera klippning plan så att 3D-rendering är begränsad till den önskade tvärsnittssektion av området med intresse för distala lårbenet.
  4. Starta Analysera 11,0 programpaket. Ladda * .vox fil som användes för att skapa 3D-rendering.
  5. Starta Bildräknare verktyget. Använd "Region Pad" verktyg för att beskära bilden (ta bort plan som inte inkluderar lårbenet).
  6. Starta Sned Sektioner verktyget. Använd alternativet 3 poäng för att hitta punkter i mitten av lårbenet, trochanter major och slutet av stiftet. Gör dessa punkter en sned plan och skapa en bild med nya skivor.
  7. Starta intresseområdet verktyg. Visa transaxiell skivor. Justera min och max inställnings för att visa kortikala benet. Skapa konturer för de skivor som motsvarar för en flera skivor (med ett ungefärligt intervall av 5 segment) för de skivor som motsvarar den distala 25% av femur. Använd "propagera Region verktyg för att interpolera mellan dessa konturer och skapa en 3D-regionen av intresse. Spara den här regionen av intresse som ett objekt kartan.
  8. Starta "Sample Options" verktyg. Markera kryssrutan för objekt karta som just skapades och välj alternativknapparna för lämpliga alternativ. Klicka på "Konfigurera Log Stats 'för att bekräfta att" Volume "kryssrutan är markerad. Klicka på "Sample Images" för att göra faktiska mätningar.
  9. Exportera volymmätningar i ett dataanalysprogram. Normalisera de yttre ben volymerna från senare tidpunkter till den första avbildas tidpunkt med hjälp av formeln: Δ Volym (%) = ([Volym (dag X) - Volym (dag 2)] / [Volym (dag 2)]) x 100 .
    OBS: I denna formel variabeln "X" representerar den tid sevärdhet. Den resulterande antalet kommer representera förändringen i storleken på ytter benvolym av det distala lårbenet över tiden.
  10. För att visualisera 3D intressanta området på toppen av benet, ladda CT bilden i "Volume Render" verktyg. Ladda objektkartan som innehåller 3D-regionen av intresse. Gå till "View''Objects" och ställ in "Original" för att vara "On". Öppna "Preview"-fönstret. Starta "Render Typer" menyn och välj "Object compositing".
  11. Klicka på "Threshold"-knappen och verktyg samt anpassa de trösklar för att visa benet och objektkarta. Använd samma fasta tröskelintervall för alla tidpunkter. Klicka på "Rotation"-knappen och ställ in orienteringen att vara en sann anterolateral vy. Klicka på "Render" för att skapa den slutliga rendering. Rädda rendering från huvud "VolymRender "fönstret.

Representative Results

In vivo självlysande och fluorescerande avbildning

I föreliggande studie är det protokoll som beskrivits för denna tidigare publicerad modell av en ortopedisk protesleden infektion hos möss 14-19, vilket innefattar den kirurgiska placeringen av en titan K-tråd implantat som sträcker sig från en intramedullära kanalen i lårbenet i det gemensamma utrymme 14-19. S. aureus bioluminescent stam Xen29 (1 x 10 3 CFU i 2 pl PBS) pipetterades direkt ovanpå slutet titanimplantat i knäleden före stängning operationsplatsen 16. För att visualisera och kvantifiera bakteriebördan och neutrofil tillströmning icke-invasivt i bedövade LysEGFP möss, in vivo hela djuret optisk imaging utförs för att sekventiellt bild de självlysande signaler från bakterierna och EGFP fluorescerande signaler från de infiltrerande neutrofiler med hjälp av IVIS Spectrum optiska hela djuret i vivoavbildningssystem på tre postoperativa dagar (dvs dagar 2, 14 och 28). De bioluminescerande signalerna för Xen29-infekterade möss förblev ovanför bakgrundssignaler från skeninfekterade möss för hela experimentet (figur 1 A, C) 16. Vårt tidigare arbete visat att de in vivo självlysande signaler approximeras noggrant antalet ex vivo CFU isolerade från det gemensamma / benvävnad och anhängare till implantaten 17,18. Dessutom var högre än skeninfekterade möss de EGFP fluorescerande signaler vid tidiga tidpunkter men närmade bakgrundsnivåerna under infektion (Figur 2B, C) ​​16.

3D samtidig registrering av in vivo optiska signaler med μCT bilder

För att visualisera de optiska signalerna (dvs, bakteriell bioluminiscerande och EGFP fluorescerande signaler) i den anatomiska samband med de post-kirurgiska knäleder jagn 3D, sam-registrerade μCT bilder som genereras med hjälp av Quantum FX μCT bildsystem de optiska bilder som genereras med hjälp av IVIS Spectrum bildsystem. Detta co-registrering kan ske på grund av att musen avbildning kammaren skulle införas i antingen maskinen för att se till att mössen var i exakt samma riktning. För att verifiera denna noggrannhet, var resultaten jämfördes med en bild förvärv utförs med hjälp IVIS Spectrum-CT in vivo imaging system som integrerar båda formerna i ett instrument utan att kräva fysisk omlokalisering av djuret. För att kartlägga de optiska data till de μCT bilder i 3D, utnyttjade vi en diffus optisk tomografi rekonstruktionsalgoritm 16. Den resulterande 3D-rekonstruktion visas (film 1).

Dessutom μCT avbildning tillät visualisering och kvantifiering av de följdändringar i kvaliteten och dimensionerna på benet som inträffade underinfektionen (figur 2) 16. Som tidigare rapporterats, yttre benet volym distala lårbenet ökat kraftigt över tiden (Figur 2A) 16. För att kvantifiera dessa förändringar var 3D volymetriska bildanalys utförs på den distala 25% av boney yta av lårbenet och förändringarna i benvolym över tiden normaliserades till det initiala benvolym. Den yttre benvolymen kraftigt ökat i infekterade möss jämfört med skeninfekterade möss (Figur 2B) 16. Ökningen av det distala lårbenet yttre benvolymen var sannolikt på skelettskador som orsakas av infektion i gemensamma vävnad och ben, vilket observerades med hjälp μCT bildbehandling och histologiska analys 16.

Figur 1
Figur 1 2D in vivo bioluminescent och fluorescenssignaler. S. aureus Xen29 eller inga bakterier (oinfekterade) ympades i knäleden efter K-wire placering och LysEGFP möss avbildas med IVIS Spectrum bildsystemet 16. (A) Mean in vivo självlysande signaler mätt som totala flödet (fotoner / sek) ± sem. (B) Medelvärde in vivo EGFP fluorescerande signaler mätt som total strålningsutbytet (fotoner / sek) / (^ W / cm 2) ± SEM. (C) Representant in vivo självlysande och fluorescerande signaler överlagras på en svartvit fotografisk bilden av mössen. Detektionsgränsen för den bakteriella belastningen med hjälp av in vivo självlysande avbildning är mellan 1 x 10 2 och 1 x 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 Xen29-infekterade möss versus sham-infekterade möss (Students t-test [två-tailed]). VänligenObservera att detta är en representativ siffra som innehåller tidigare publicerade data som genereras med hjälp Xen29 och avbildas med IVIS Lumina XR Imaging System 16. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. 3D μCT avbildning. S. aureus Xen29 eller inga bakterier (oinfekterade) ympades i knäleden efter K-tråd placering och möss avbildades med användning Quantum FX in vivo μCT systemet. (A) Representative 3D μCT återgivningar av Xen29 infekterade möss (övre paneler) och sham-infekterade möss (lägre paneler). (B) Procent av yttre ben volymförändring (distal 25% av lårbenen) normaliserad till den ursprungliga timig punkt (medelvärde ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 Xen29-infekterade möss versus sham-infekterade möss (Students t-test [två-tailed]). Observera att detta är en representativ siffra som innehåller tidigare publicerade data som genereras med hjälp av självlysande stammen S. aureus Xen29 och avbildas med Quantum FX in vivo μCT bildsystemet 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1 . Representant 3D anatomisk samtidig registrering av Xen29 bioluminescenta signalerna och EGFP-neutrofila fluorescerande signaler i kombination med de μCT bilderna. Bilderna roteras på den vertikala axeln.

Discussion

Multimodalitet avbildning som avbildningstekniker som utnyttjar in vivo optisk avbildning i kombination med μCT bildbehandling ger en ny teknisk strategi som gör att 3D-visualisering, kvantifiering och longitudinell kontroll av biologiska processer i en anatomisk kontext 1-4. Protokollen i föreliggande studie ger detaljerad information om hur in vivo självlysande och fluorescerande avbildning kan kombineras med μCT avbildning i en ortopedisk protesimplantat infektionsmodell hos möss för att övervaka den bakteriella belastningen, neutrofil inflammation och anatomiska förändringar i benet icke-invasivt och i längdled över tid. Sammantaget den information som erhålls genom att kombinera optisk och strukturell avbildning innebär ett stort tekniskt framsteg, vilket kan vara särskilt väl lämpade för att studera biologiska processer och patologiska tillstånd som påverkar rörelseapparaten.

Ett intresseing slutsats som bör påpekas är att vi konstaterade att EGFP-neutrofila fluorescerande signaler minskade till bakgrundsnivåerna med 14-21 dagar och låg kvar på bakgrundsnivåer under hela försöket trots förekomsten av självlysande bakterier. Det är osannolikt att den röntgenstrålning påverkade neutrofil överlevnad som vi observerade liknande kinetik hos neutrofila signalerna i icke-bestrålade möss 19. I vårt tidigare arbete som innebär en modell av S. aureus infekterade sår, involverade neutrofil infiltration en kombination av robust neutrofil rekrytering från cirkulationen, långvarig neutrofil överlevnad på platsen för infektion och den målsökande av KIT + progenitorceller till abscess, där de lokalt ger upphov till mogna neutrofiler 23. Det är troligt att liknande processer bidragit till neutrofil infiltration i den ortopediska implantat S. stafylokocker modell. Även om det är okänt varför neutrofila signalerna minskade i Orthopaedic infektionsmodell, kan det vara att immunsvaret förändrats över tid eftersom denna infektion gått från en akut till kronisk infektion och det är ett ämne för framtida utredning.

Det finns begränsningar med denna musmodell av ortopedisk protesleden infektion och in vivo multimodalitet imaging som bör noteras. För det första är denna musmodell en förenkling av de faktiska förfaranden och material som används i ortopedisk kirurgi i människor 24. Ändå gör denna modell rekapitulera den kroniska infektionen och påföljande inflammation i ben och gemensamma vävnad som ses i humana ortopediska implantatinfektioner 8,9. Dessutom, för att erhålla μCT bilderna, var relativt låga doser av röntgenstrålning används för att minimera eventuella negativa effekter på djurens hälsa under infektionsförloppet. För bättre upplösning av ben, högre doser av röntgenstrålning kan användas för μCT avbildning på euthanized ennimals. Detta skulle emellertid eliminera möjligheten att icke-invasivt och i längdriktningen övervaka ben förändras över varaktigheten av experimenten.

Sammanfattningsvis har multimodalitet imaging involverar kombinationen av in vivo hela djuret optisk avbildning med anatomisk μCT imaging tillåten mer omfattande information om smittan och inflammatoriska svaret. Dessutom har dessa tekniker tillåts att utvärdera konsekvenserna av infektion och inflammation på ben och gemensamma vävnad. Framtida arbete skulle kunna dra nytta av multimodalitet imaging för att utvärdera effekten av antimikrobiella behandlingar, immunsvar, patogenes av sjukdomen och de reaktiva förändringar i benet som vi har börjat undersöka 14-18. Dessutom kunde multimodalitet imaging utvärdera prober och spårämnen för att diagnostisera närvaron av en infektion, såsom tidigare beskrivits i djurmodeller ett lår infektion, endokardit, lung Infectjoner och biomaterial infektioner 25-28. Slutligen kan användningen av multimodalitet imaging utvidgas bortom infektionssjukdomar och används mellan ämnesområden, inbegripet ortopedi, reumatologi och onkologi, att undersöka andra förhållanden som påverkar rörelseapparaten, till exempel skelettcancer, metastatisk sjukdom, frakturer och artrit 5-7 .

Disclosures

JAM, BNT, EL, NZ, KPF betalas anställda i PerkinElmer, som tillverkar avbildningsinstrument, förutsatt att Xen29 självlysande S. aureus-stam, och betalas för kostnader för offentliggörande av denna video-artikeln. De återstående Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av en H & H Lee Surgical Resident Research Scholars Program (till JAN), en AO Foundation startpeng S-12-03M (till LSM) och ett National Institutes of Health bidrag R01-AI078910 (till LSM) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain PerkinElmer Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient
Tryptic soy broth BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 211825
Bacto Soy Agar BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 214010
LysEGFP knockin mouse strain Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene
Betadine Purdue Products, Stamford, CT
Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) Synthes, West Chester, PA 492.08
Wire Cutter - Duracut T.C. H&H Company, Ontario, Canada 83-7002
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL 118718
Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. 95056-936
Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) Zoopharm, Windsor, CO analgesic
IVIS Spectrum Imaging System PerkinElmer, Hopkinton, MA optical in vivo imaging system
Quantum FX in vivo µCT system PerkinElmer, Hopkinton, MA µCT in vivo imaging system
IVIS SpectrumCT Imaging System PerkinElmer, Hopkinton, MA combined optical and µCT in vivo imaging system
Living Image Software PerkinElmer, Hopkinton, MA Image analysis software for in vivo optical imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
  2. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
  3. Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
  4. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  5. Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
  6. Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
  7. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  8. Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
  9. Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
  10. Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
  11. Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
  12. Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
  13. Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
  14. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
  15. Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
  16. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
  17. Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
  18. Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
  19. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
  20. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
  21. Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
  22. Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
  23. Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
  24. Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
  25. Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
  26. Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
  27. van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
  28. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics