ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הקידוד של חוויות במוח ובאיחוד של זכרונות לטווח ארוך תלוי בשעתוק הגנים. זיהוי הפונקציה של גנים מסוימים בניסיון קידוד הוא אחד מהיעדים המרכזיים של מדעי מוח מולקולריים. יתר על כן, העמותה הפונקציונלית של גנים מוגדרים עם התנהגויות ספציפיות יש השלכות על הבנת הבסיס של הפרעות נוירופסיכיאטריות. אינדוקציה של תוכניות שעתוק חזקות נצפתה במוחם של העכברים הבאים מניפולציות התנהגותיות שונות. בעוד שחלק מאלמנטים גנטיים מנוצלים שוב ושוב הבא מניפולציות התנהגותיות שונות ובגרעינים שונים במוח, תוכניות תעתיק הן כללית ייחודיות לגירויים התרמה והמבנה שבו הם למדו 1,2.

בפרסום זה, פרוטוקול מתואר לפרופיל תעתיק חזק ומקיף מגרעיני המוח של עכברים בתגובה למניפולציה התנהגותית.הפרוטוקול בא לידי הביטוי בהקשר של ניתוח של דינמיקת ביטוי גנים בגרעין נסמך הבא ניסיון קוקאין חריף. לאחר שהוגדר בניסיון vivo, הרקמה העצבית היעד היא גזור; ואחריו טיהור RNA, להפוך שעתוק וניצול של מערכי microfluidic לניתוח qPCR מקיף של גני המטרה מרובים. פרוטוקול זה מיועד לניתוח מקיף (פונה 50-500 גנים) של הגבלת כמויות של חומר מוצא, כגון דגימות מוח קטנות או אפילו תאים בודדים.

הפרוטוקול הוא הכדאי ביותר לניתוח מקביל של דגימות מרובות (למשל תאים בודדים, ניתוח דינמי הבאים תרופות, נגיפי או הפרעות התנהגות). עם זאת, הפרוטוקול יכול גם לשמש להבטחת האפיון ואיכות של דגימות לפני לימודי כל הגנום על ידי microarrays או RNAseq, כמו גם אימות של נתונים המתקבלים ממחקרי הגנום.

Introduction

הארגון הדינמי של המוח מאפשר גמישות מחשבתית והתנהגות. חוויות מקודדות באמצעות שינויים במבנה ובחוזק של קשרים בין תאי עצב במוח 3. זה "גמישות ניסיון תלוי" היא התוצאה של גיוס של דפוסים ספציפיים של ביטוי גנים המספק את החלבונים הדרושים לשינוי של מבנה וכוח 4 הסינפטי. זיהוי של רשתות רגולטוריות גן תיווך ההיווצרות של זכרונות לטווח ארוך הוא עיקרון של מדעי מוח המולקולריים מרכזי, עם הציפייה שהזדהות האלמנטים הדומיננטיים של תוכניות תעתיק תספק תובנה לתוך עקרונות יסוד המסדירים את היווצרות זיכרון, כמו גם מטרות ל טיפול בניוון עצבי והפרעות נוירופסיכיאטריות. תוכניות תעתיק להתפתח בגלי temporally מוגדרים, כל אחד מהם לקודד גנים של אופי שונה, שהם חשובים עבור דשלבי ifferent ביישום לתוצאה של אירוע איתות 1,2. לכן חשוב לטפל בדינמיקת תעתיק על לוח זמנים זמניים מפורטים, על מנת לזהות את ההשלמה המלאה של גנים המושרה, ולקבל תובנה פונקצית הפוטנציאל שלהם בהתאם לדינמיקה של גיוסם.

התמכרות לסמים היא צורה חזקה של פלסטיות ניסיון תלוי הנגרמת על ידי ההשפעות ארוכות טווח של תרופות של התעללות במעגלים עצביים במוח 5,6. חשיפה ראשונית, חריפה לתרופות עלולה להוביל להתפתחות של התמכרות ומעבר לשימוש כרוני. מידע מקושרת הוא אלמנט מכריע בהתפתחות של התמכרות. רמזים סביבתיים הקשורים לסמים מוקצים חשיבות משמעותית במוחם של משתמשים בסמים. מידע מקושרת והזכיר מתעלל תרופה של ניסיון בסמים בעבר יכול לגרום להישנות להשתוקקות לסמים גם לאחר תקופות של התנזרות ארוכות מחשיפה לסמים 7,8.מכאן האתגר הגדול הקליני בהתמכרות - הנטייה של מכורים שמפסיק אפילו זמן רב לאחר תסמיני גמילה שככו 9.

רגישות התנהגות לקוקאין היא מודל פשוט של ניסיון הקוקאין שימושי בחקר המנגנונים של התמכרות לסמים. במודל נרחב למד את זה לרגישות לטווח ארוכה הנגרמת על ידי חשיפה כרונית לסמים של התעללות, מכרסמים הם מורגלים ראשון לזריקות מלוחים (intraperitoneal; IP) בסביבת רומן (קאמרי שדה פתוח שבו הפעילות של התנועה שלהם היא פיקוח) ; לאחר מכן, הם מקבלים זריקות יומיות של קוקאין בתאי השטח הפתוחים בזמן שהפעילות שלהם היא פיקוח 10 (איור 1). הפרדיגמה התנהגות זו בדרך כלל תוצאות ברגישות חזקה של התנהגות של תנועה (8-12 לקפל מעל הפעילות בסיסית) 11, שנשמרה לתקופה של חודשים לאחר הפסקת זריקות קוקאין, הממחישה את היווצרות הקודםעקבות זיכרון asive ניסיון סמים.

המעגלים העצביים של גמול, מעורבים באופן טבעי בחיזוק התנהגויות חיוניות להצלחה של מינים (למשל האכלה, מין), מנוצלים על ידי סמים של התעללות לחזק התנהגויות הקשורים לסמים 12,13. מופיעים מנגנונים המולקולריים ותאיים על ידי אשר הניסיון של תרופות של התעללות מוגברת להיות דומה למנגנונים העומדים בבסיס ההיווצרות של זכרונות הצהרתיים או סמנטיים במבנים אחרים במוח 14. לכן, על חוסנו של מודל רגישות ההתנהגות הופך אותו למערכת מודל אטרקטיבית ללמוד מנגנונים של פלסטיות ניסיון תלוי.

הגרעין הנסמך (NAC) הוא אינטגרטור של מעגלי הגמול של המוח מרכזי, ונקשר בהרחבה בהתפתחות של התמכרות 5,6. ההיווצרות של התמכרות תלויה בשעתוק של חלבונים חדשים בגרעין הנסמך, וחזק בduction של תוכניות שעתוק מובנים באופן ברור הוא ציין בNAC הבא ניסיון קוקאין 15-19. תגובת תעתיק החריפה לחשיפה לקוקאין עשויה לתפקד במספר הרמות על מנת להתאים לגירוי האינדוקציה החזק ולכוון את הייצור של חלבונים חדשים ש הם אחראים לשינויים המבניים ואלקטרו הנגרמים על ידי חשיפה לתרופה 6,19-22.

על מנת לקדם את המחקר של מנגנונים מולקולריים של פלסטיות ניסיון תלוי במוח, פרוטוקול מתואר לניתוח המקיף של דינמיקת שעתוק בדגימות רקמת מוח בעקבות מניפולציה התנהגותית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי בהקשר של הניסיון התנהגותי למד במעבדה Citri - רגישות התנהגות לקוקאין, תוך ניצול מערכים דינמיים microfluidic לניתוח תעתיק. הפרוטוקול המתואר הוא כמובן לא מוגבל ללימוד tהוא הגרעין נסמך בהקשר של רגישות התנהגות, אבל יכול להיות מיושם על מספר גדול של פרדיגמות התנהגות ואזורים במוח. למעשה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמות גוף מחוץ למוח, ומגוון רחב של חוויות או מניפולציות של האורגניזם למד.

הפרוטוקול מחולק באופן גס לארבעה שלבים. בשלב הראשון, בעלי החיים כפופים לפרדיגמה ההתנהגות; בשלב השני הרקמה היא microdissected; בשלב השלישי - mRNA הוא, הפוך עיבד מטוהר ומשש, ובשלב האחרון את הנתונים מנותחים.

בהקשר של לימוד דינמיקת תעתיק, העיתוי וההגדרה המדויקים של החוויה הם כנראה פרמטרים הניסיוניים החשובים ביותר כדי לשלוט. מסיבה זו, מודל ההתנהגות שלנו על פי בחירה הוא של רגישות התנהגות לקוקאין, מערכת המאפשרת רמה גבוהה של שליטת הנסיין על הפרמטרים של experience. פרדיגמות התנהגות נוספות המאפשרות תזמון מדויק ולטפל בדגמים שונים של פלסטיות ניסיון תלוי או היווצרות זיכרון זמינות. מודלים אלה כוללים מיזוג פחד 23, העשרה סביבתית חריפה 24,25, חיפושי אובייקט רומן 26 וחוויה חזותית הבא גידול כהה 27. ובכל זאת, רגישות התנהגות לקוקאין היא מניפולציה התנהגותית חזקה באופן עקבי, יוצר עקבות זיכרון נפוצות מאוד שנמשכות חודשים הבאים ניסיון קוקאין 28.

המוח מחולק, ואחריו microdissection הידני של הגרעין נסמך. זה היה הניסיון שלנו שmicrodissection הידני מפרוסות המוח שהוכנו במהירות מספק את השיטה אמינה והמהירה ביותר של חילוץ הרקמות רלוונטיות לפרדיגמה ההתנהגות, ועם ניסיון, לגבולות הרקמה להיות ברורים וללא קושי מוכר. לחלופין, פרוסות דקות יכולות להיות הכנהed, ואחריו microdissection לייזר ללכוד. אמנם שיטה זו מאפשרת מאוד מוגדרת תיחום של האזור של עניין, הוא איטי (ובכך מסכן את ההפסד של mRNA יציב), מייגע ודורש ציוד ייעודי יקר (מצויד בהתקנת לייזר ללכוד מיקרוסקופ). הפרוטוקול המוגדר במסמך זה גם יכול להיות מותאם לניתוח תעתיק מתא בודד, על ידי שאיפה ידנית של הציטופלסמה של תאים מזוהים ויזואלית באמצעות טפטפות תיקון 29. חשוב לציין כי הפרוטוקול המתואר מספק ממוצע אוכלוסייה, בזמן שהוא סביר מאוד כי ברוב המקרים, רק תת אוכלוסיות של התאים בתוך הרקמה למעשה מעורבות במתן מענה לחוויה. זה עניין לפרופיל שעתוק באופן סלקטיבי מתוך אוכלוסיות תאים ספציפיות בתגובה לניסיון, אבל דיון בגישות אלה הוא מעבר להיקף הנוכחי.

לטיהור mRNA, הפוך שעתוק ושאילתות qPCR, הרקמהמופר על ידי העברתו דרך מחטים דקות, ואחריו את הניצול של ערכות זמינות מסחרי (למידע נוסף, ראה לוח 8). הבחירה הוא הודיע ​​על ידי ניסיון עם מתודולוגיות אלה, המבטיחים מיצוי אמין של RNA באיכות גבוהה ותוצאות חזקות מיישומים במורד הזרם.

בעוד הפרוטוקול מתואר לתפוקה גבוהה qPCR ניצול מערכים דינמיים, יכולות להיות נחקרות דוגמאות לביטוי גנים באמצעות נקודת סיום PCR, qPCR נמוך תפוקה, microarrays ביטוי גנים או רצף עמוק. ההעדפה לqPCR תפוקה גבוהה תוך ניצול מערכים דינמיים היא בשל העובדה כי mRNA המתקבל מגרעיני המוח הבאים פרדיגמות התנהגות הוא לעתים קרובות כמויות מגבילות. מערכים דינמיים מספקים פלטפורמה המאפשרת ניתוח מקיף יעיל של תמלילים ממספר גדול של דגימות במקביל בניסוי אחד. לאחר הרכישה הראשונית של מערכת microfluidic (נפוץ pu מוסדיrchase), ניסויים זולים יחסית להפעלה. בעקבות ניתוח זה, שאילתא נוספת של הדגימות יכולה להתבצע באמצעות פלטפורמות יקרות יותר כדי לחפש תעתיקי רומן (על ידי microarrays או RNAseq) עם המערכים הדינמיים מתן התייחסות מקיפה לאבטחת איכות. לבסוף, לניתוח נתונים, גישות סטנדרטיים מנוצלות. מצביעים ספציפיים לגבי בעיות שעלולות להתעורר יידונו בטקסט של הפרוטוקול.

פרוטוקול זה הוא מתאים ביותר לחוקרים המעוניינים בחקירה יסודית של מערכת עניין שלהם, כדי לחקור את התנאים ומשכפל מרובים. הפרוטוקול הוא גם מתאים ביותר לחוקרים שכבר מושחז ב( באמצעות ניסויי microarray או RNAseq) על קבוצת משנה של 50-500 הגנים של עניין, שבו הם מעוניינים בביצוע שאילתות שוב ושוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת עברית בירושלים.

.1 הכנת פתרון ACSF

  1. הכן פתרון ACSF כפי שמתואר בטבלה 1. הפוך L 1 DDH 2 O (> 18 MΩ טוהר), מביא osmolarity ל~ 300 mOsm / L עם תוספת מתאימה של מים או NaCl.

.2 ציוד וחדר להגדיר

הציוד לניטור של מושרה קוקאין התנהגות של תנועה מורכבת מתאי התנהגות (50 x 45 סנטימטר) חוטית עם מקור אור, אוהד פנימי ומצלמה (או חיישני אינפרא אדום), ומצויד בתיבה פנימית פרספקס (30 x 30 סנטימטר) ב שהעכברים רשאים לנוע בחופשיות בזמן שהתנועה שלהם היא פיקוח. הבדיקות התנהגותיות צריכה להתבצע בין שעות 1 לאחר כיבוי האורות לשעה 1 לפני האורות כבויים, במחזור אור / חושך רגיל. בעלי חיים צריכים להיות מאומנים באופן עקבי באותו הזמן בכל יום.

  1. נקה את התאים אחרי כל משפט עם חומר חיטוי הניתן על ידי מתקן עכבר ו / או מגיב הסרת ריחות, על מנת למנוע הטיה קיו חוש הריח ועל מנת להבטיח חיטוי נאות.

חשוב: בעוד טיפול העכברים להיות שקטים, רגועים וזהירים.

.3 הכנת בעלי החיים

  1. 5 C57BL6 עכברי זכרי הבית (6-12 שבועות; ~ 25-35 גרם משקל) בכל כלוב, בחדר עם hr 12 מחזור אור / חושך וגישה חופשית למזון ומים, על פי סטנדרטים ודרישות של בעלי חיים המקומיים אכפת הדרכת הוועדה ופרוטוקולים. לפני ביצוע הניסוי, לשקול את העכברים והיכנס נתונים. קוק מאוחר יותר מנוהל על פי המשקל של העכברים.
  2. העבר את כל הכלובים המכילים עכברים לחדר 30 דקות התנהגותיות לפני תחילת המשפט הראשון.
  3. להרגיל את כלהעכברים ששימשו בניסוי לניסוי טיפול, זריקות וניטור בהגדרת ההתנהגות. זו מושגת על ידי 3 זריקות intraperitoneal יומיות רצופות של 250 מלוח μl כפי שיתואר להלן.
  4. לנהל זריקת intraperitoneal של 250 מלוח μl. מייד לאחר ההזרקה, במקום את העכבר בתא התנהגות כדי לעקוב אחר הפעילות של תנועה ל15 דקות. חזור על פעולה זו במשך 3 ימים ברציפות, באותה השעה בכל יום.
  5. ביום הרביעי, לחלק את העכברים לשתי קבוצות. הכן פתרון מניות של קוקאין ב2 מ"ג / מ"ל ​​בתמיסת מלח. לנהל זריקה אחת של פתרון קוקאין (20 מ"ג / קילוגרם סופי) לקבוצת הניסוי על פי המשקל של העכבר (למשל לעכבר 25 גרם - להזריק 250 μl, ואילו עכבר 30 גרמו יקבל 300 μl). לנהל מלוח לקבוצת הביקורת. מייד לאחר ההזרקה, במקום את העכבר ל20 דקות בתא התנהגות לניטור של פעילות של תנועה (typicברית, 15 דקות הראשונות נמצאות תחת פיקוח).
  6. לאחר הזרקת הקוקאין, להקריב את העכברים בנקודות זמן שונים (0, 1, 2, 4, 8 ו24 שעות לאחר הזרקה). חשוב לציין, לוודא כי עכברי התייחסות (0 נקודת זמן), לא יקבלו כל זריקה ביום זה. בשל חשיבותו, קיים הכרח לכלול משכפל של קבוצת ההתייחסות.

.4 Dissection של הגרעין נסמך

  1. להרדים את העכברים עם isoflurane בזמן המתאים לאחר הזרקת קוקאין / מלוח. Isoflurane חייב אוורור ישירות אל מחוץ לחדר. לכן, ההליך צריך להתבצע במנדף הכימי.
  2. לפקח על עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס ברגל האחורית. לצבוט את הכף כדי לעורר תגובת נסיגה על ידי בעלי החיים. בעלי חיים שמראים רפלקס הוא לא ברמה של הרדמה כירורגית ולא במצב להרדים.
  3. הפקה של המוח:
    1. להרדים את העכבר על ידי עריפת ראש.
    2. <li> הסר את העור מעל מרכז הגולגולת ולחתוך את הגולגולת במספריים חדים.
    3. הכנס את המספריים בנקודה שבי חוט השדרה נכנס למוח (מגנום הנקב) ולעשות שני חתכים לרוחב.
    4. מאותה הנקודה, לעשות חתך sagittal ארוך לאורך תפר sagittal. כשהגיע לנורת חוש הריח, קליפ לשמאל ולימין.
    5. עם מלקחיים, להסיר את הגולגולת בזהירות, אחיזת כל מחצית של הגולגולת בחוזקה ומושך לצד, נזהר שלא ללחוץ על או לגרום נזק למוח.
    6. הסר את המוח תוך ניתוק עצבי הגולגולת באמצעות מרית כפית מיקרו הפוכה.
  4. מניחים את המוח בפתרון ACSF קר כקרח ל1-2 דקות לצנן ולהקשיח.
  5. הסר מוח מACSF, פתיל נוזלים עודפים עם מגבת נייר, ליצור חתך העטרה בין המוח הקטן ושאר המוח ומדביק את המוח, עם החלק מקורי פונה כלפי מעלה, על הבמה vibratome.
  6. חיתוך NAC: לשמור על פתרונות ACSF בטמפרטורות קרים כקרח בתא החיתוך של vibratome. סעיף ב200 מיקרומטר עד הגרעין הנסמך (NAC) מזוהה באופן ברור על פי פקסינוס ופרנקלין עכבר מוח האטלס (כ 1.8 מ"מ הקדמי לגבחת; לשים לב לצורה של כפיס המוח, המיקום וצורה של השליך הקדמי ו חדרי הלב, כמו גם את המורפולוגיה הכוללת של סעיף המוח). בשלב זה, ליצור שני 400 מיקרומטר סעיפים, שממנו NAC יהיה גזור.
  7. תחת stereoscope, להשתמש להב קנס לנתח את אזור NAC מהפרוסות. ההגדרה של NAC היא לפי אטלס מוח עכבר פקסינוס ופרנקלין, ויכולה בנוחות להיות גזור בסעיפים מתאימים על ידי ארבעה מעברים מהירים של הלהב ברקמה. (איור 2).
  8. הנח סעיפי NAC מייד ב900 μl מגיב תמוגה Trizol בצינור microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C עד extr RNAפעולה.

תמלול .5 הפקת RNA וcDNA ההפוך

  1. להפשיר את הצינורות המכילים גרעין נסמך סעיפים במגיבים תמוגה TRIzol בטמפרטורת החדר וhomogenize lysate עם מזרק 1 מ"ל מחובר ל25 מחט G עד הרקמה היא (לפחות פי 15-20) הומוגני לחלוטין. כמה הסיבובים הראשונים הם קשים, ודורשים דוחפים את הרקמה על הקיר של הצינור על מנת לשבור אותו לחתיכות קטנות שיכול להיכנס לקצה המחט.
  2. כדי להבטיח הומוגניזציה, pipet lysate לתוך עמודה QIAshredder מיני ספין ו צנטריפוגות ב XG 12,000 דקות 1.
  3. Pipet lysate לתוך צינור microcentrifuge חדש ולחלץ את RNA על פי הוראות היצרן. אחסן את RNA ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  4. למדוד את ריכוז RNA, לנתח יושרה ואיכות באמצעות Bioanalyzer או ציוד שווה ערך. השתמש 100-500 RNA ng עבור כל סיבוב של הכנת cDNA עם rפריימרים hexamer andom.

.6 עיצוב פריימר ובדיקת פריימר

  1. בחירת פריימרים טובים: לזוג פריימר אופטימלי לqPCR של תעתיקי mRNA, פעל לפי דרישות אלה (איור 3):
    1. פריימרים עיצוב המכילים לא יותר מ 17-28 בסיסים. הימנע מחזרות נוקלאוטיד כפי שהם לקדם mispriming.
    2. פריימרים עיצוב עם טמפרטורת התכה (T מ ') בין 56-68 ° C (בצורה אופטימלית 60-64 מעלות צלזיוס). T מ 'בתוך זוג פריימר צריך להיות בתוך 1 ° C של כל אחד אחר.
    3. להיות מודע לכך שגודל המוצר צריך להיות באופן אידיאלי בין 80 ו150bp.
    4. ודא כי לפחות אחד מצבעי היסוד משתרע על צומת אקסון אקסון, או amplicon מכיל אינטרון גדול (פורש אינטרון), כדי למנוע הגברה של מזהמי הדנ"א הגנומי.
    5. השתמש בתוכנה אמינה המבוססת על Primer3 (לדוגמאות ראו טבלה 2) על מנת לשפר את עיצוב פריימר.
  2. בדיקת יחסי הציבורimers: על מנת להבטיח את הספציפיות ואת היעילות של פריימרים, תגובת qPCR שליטה יש לבצע:
    1. השתמש במדגם חיובי (המכיל תבנית cDNA לכל זוגות פריימר הרלוונטיים) ולכייל cDNA (למשל שמונה דילולים פי שלושה מריכוז ראשוני של ~ 10 ng) בתגובות מקבילות כפולות. כולל שליטה ללא תבנית, השולטת על זיהום בתוך הפתרונות המשמשים לתגובה.
    2. לחשב את יעילות פריימר על ידי שימוש בנוסחה: (10 (- 1 / מדרון) -1) × 100, כך שהעקומה של המדרון האופטימלי היא - 3.333 (כלומר 10 (- 1 / 3.333) = 2) (איור 4).
    3. לקבוע את הספציפיות של ההגברה. הגברה ספציפית באה לידי ביטוי בשיא בולט יחיד משותף לכל עקומות ההיתוך של המוצרים מוגברים, ואילו מחוץ יעד הגברה תופיע כfr סטייה ברוראום שיא אחד הגדול.

.7 ניתוח qPCR

  1. טרום הגברה:
    1. ניתוח qPCR מקיף מבוסס על שאילתות מקבילות של הגבלת כמויות של RNA עם מספר גדול של זוגות פריימר. לכן, צעד של טרום הגברה הוא חיוני. בשלב זה, cDNA עובר 14-18 מחזורים של טרום הגברה בתערובת של כל הצבעים היסוד שישמשו לביצוע שאילתות המדגם בעתיד (עד 800 זוגות פריימר).
    2. לדלל את כל צבעי היסוד בTE (EDTA הנמוך) ל50 מיקרומטר ליעד מסוים הגברה (STA).
    3. בריכה יחד aliquots μl 1 של כל צבע יסוד 50 מיקרומטר קובע שיש לכלול בתגובת STA, עד 800 מבחני.
    4. הכן מראש לערבב ודוגמאות לSTA כפי שמתואר בטבלה 3. אפשר לטעויות על ידי הכנת תערובת ל110% ממספר הדגימות שצריכות להיות מוגברים.
    5. Aliquot 3.75 STA μl מראש תערובת עבור כל דגימה. הוסף 1.25 μlשל cDNA לכל אחד.
    6. מערבולת לערבב תגובות ו צנטריפוגות במשך 10 שניות.
    7. הנח את תגובות STA בCycler ומחזור תרמית כפי שצוין בלוח 4.
  2. אני טיפול exonuclease (ExoI):
    1. לדלל אותי Exo כפי שמצוין בטבלה 5.
    2. הוסף 2 μl של ExoI המדולל (4 U / μl) לכל תגובת STA 5 μl, מערבולת, ספין למטה (> 6,000 XG) ומקום בCycler תרמית על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן על 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. לדלל את המוצרים הסופיים לריכוז מתאים לבדיקה. שימוש TE חוצץ (להוסיף 43 μl חיץ TE למדגם TSA 7 μl).
    4. אחסן את מוצרי STA המדולל ב -20 ° C או להשתמש באופן מיידי.
  3. פריימר והתקנה לדוגמה עבור qPCR:
    1. הכן דגימות כפי שמוצג בטבלה 6. הכן תערובת על פי השבב נבחר לניסוי, ולהוסיף דוגמאות כמתאימות.
    2. אגיטייט פתרונות מיקס לדוגמה עבור מינימום של 20 שניות, ו צנטריפוגות (> 6,000 XG) במשך לפחות 30 שניות. תגובות מוכנות ניתן לאחסן לתקופות קצרות על 4 מעלות צלזיוס עד השבב מוכן להעמסה.
    3. הכן את מבחני כפי שמתואר בטבלה 7.
    4. להתסיס את מיקס Assay עבור מינימום של 20 שניות ו צנטריפוגות (> 6,000 XG) במשך לפחות 30 שניות לספין למטה את כל המרכיבים.
      חשוב: וורטקס ביסודיות ו צנטריפוגות כל המדגם וassay הפתרונות לפני pipetting לתוך פתחי הכניסה השבב. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לירידה באיכות הנתונים.
      הערה: הריכוז הסופי של כל צבע יסוד הוא 5 מיקרומטר בכניסה ו500 ננומטר בתגובה הסופית.
  4. תחול וטעינת המערך דינמי IFC שבב (מעגלים נוזליים משולבים). יש שבב IFC פתחי הכניסה לדגימות ומבחנים, כמו גם פתחי הכניסה שצוינו (מצברים) לפס בקרת נוזל (שמן מינרלים) משמש לחצים על תאי microfluidic (Figuמחדש 4A).
    1. הזרק קו נוזל שליטה לכל מצברים על השבב.
    2. להסיר ולסלק סרט מגן הכחול מהחלק התחתון של השבב.
    3. מניחים את השבב לתוך הבקר IFC המתאים (בקר MX עבור IFC 48.48 דינמי המערך או HX בקר IFC ל96.96 המערך דינמי IFC), ולאחר מכן להפעיל את תסריט ראש (113x) לIFC 48.48 דינמי המערך או ראש (136x) תסריט ל96.96 המערך דינמי IFC כדי ראש השבב.
    4. כאשר את התסריט סיים, להסיר את השבב הדרוך מן הבקר IFC.
    5. פיפטה 5 μl של כל Assay מיקס ו5 μl של כל מיקס לדוגמא לפתחי הכניסה שלהם.
    6. להחזיר את השבב לבקר IFC.
    7. שימוש בתוכנת בקר IFC, להריץ את הסקריפט טען מיקס (113x) ל48.48 המערך דינמי IFC) או לטעון Mix תסריט (136x) ל96.96 המערך דינמי IFC כדי לטעון את הדגימות ומבחנים לשבב. כאשר תסריט Mix טען סיים, להסיר את העומסשבב ed מן הבקר IFC.
    8. טען את השבב על Cycler התרמית, ליצור ריצת שבב חדשה (על פי הנחיות יצרן), כולל ניתוח עקום התכה. השימוש בתוכנת Cycler התרמית, להבטיח שתאי התגובה מוכרים כראוי, ולאפשר את התגובה עד שהושלמה.

ניתוח .8 נתונים

  1. אבטחת איכות: על מנת להבטיח את איכות הנתונים, לאמת את האיכות של פריימרים על ידי טיפול עקומות דילול (כמתואר לעיל). לפקח על הספציפיות של הגברה על ידי צפייה בעקומות ההיתוך של amplicons, הפסגות שצריכה בצורה אופטימלית להיות מיושרים בחוזקה 29.
  2. ויזואליזציה: להדמיה של כמויות גדולות של נתונים המתקבלים על ידי qPCR תפוקה גבוה, להשתמש בתוכנה שנוצרה heatmaps, שבו הביטוי הוא על ידי עוצמה בצבעים. בנוסף, יציג את דינמיקת תעתיק של גנים בודדים כמגרשי פיזור בשורה.
  3. פרסום: בפרסוםתוצאות ביטוי גנים, זה מומלץ לעקוב אחר הנחיות MIQE לפרסום של ניסויים בזמן אמת PCR כמותי, המפרט את המידע המינימאלי שיש לדווח לניסוי qPCR כדי להבטיח את הרלוונטיות, הדיוק, הפרשנות נכונה, והשחזור שלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איכות התוצאות שהתקבלו על ידי יישום פרוטוקול זה מכריע תלוי במספר הפרמטרים. תכנון ניסוי נכון יביא להפרעה מינימאלית לעכברי ניסוי, כך שהניסיון שנבדק (בדוגמא זו, שחשיפה לקוקאין) תהיה החוויה הדומיננטית ביותר בהיסטוריה המודרנית שלהם, ולכן תגרום לתעתיק חזק וספציפי תכנית. איור 1 מתאר את התכנית הניסיונית ולרגישות התנהגות לקוקאין, המגדיר את נקודות הזמן הבאות ניסיון קוקאין שבו הגרעין נסמך הוא גזור מעכברים ונותחו. הנקודה המכרעת הבאה היא זו של הגדרת הגבולות המדויקים לכריתה של הרקמה התקינה לניתוח. איור 2 מתאר את גבולות הגרעין הנסמכים בסעיפי העטרה וsagittal. רצוי הנתיחה צריכה להתבצע באופן שמרווח דק של רקמת NAC מוחרג מtak האזורen לפרופיל. הדבר מבטיח פרופיל עקבי היחיד של NAC, השתנות הפחתה והפוטנציאל לחפצים הנובעים מהכללה של רקמה הסובבת.

כשהגברת הגבלת כמויות של RNA, כמו בנתיחה של גרעיני מוח קטנים, מחזורים רבים של הגברה נחוצים לזיהוי נכון של האות. לכן נקודה מכרעת בכל ניסוי PCR כמותי, מוגברת יותר בעת עבודה עם כמויות קטנות של חומר מוצא, היא אפיון של פריימרים המשמשים להגברה. איור 3 מתאר את מאפייני מפתח בהגדרת פריימרים אופטימליים, ותרשים 4 מדגים את עקומות ההגברה של פריימרים בבימויו נגד c-Fos וFosB, הוכחה כי זוגות פריימר אלה להגביר תמליל היעד שלהם ביעילות ~ 100% בכל מחזור. בעקבות אימות פריימר והקמת פרדיגמה הניסויית הנאותה כדי לאפשר הערכה ברורה של שעתוק מTiss היעדue, ניתוח מקיף יכול להתבצע על פלטפורמת Fluidigm Biomark, מאפשר עד 9,216 תגובות מקבילות qPCR (בפורמט 96.96; איור 5). פלטפורמת תפוקה גבוהה זו מאפשרת ניתוח מקביל של חזרות ניסוי מרובות, תוך שימוש בתנאי ניסוי זהים על שבב יחיד. נתונים לחזרות ניסיוניות המרובעות, טיפול האינדוקציה תעתיק של c-Fos וFosB הבא ניסיון קוקאין חריף, הם הפגינו באיור 6.

איור 1
איור 1 פרדיגמה ניסויית לניתוח תעתיק דינמי הבא ניסיון קוקאין. פרוטוקול ניסוי () - עכברים הם מורגלים לטיפול והזרקה במשך 3 ימים, תוך מעקב פעילות של תנועה על ידי מעקב וידאו בחדר התנהגות קול מרכך. עכבריםאז הם כפופים לחווית קוקאין; חשיפה יחידה = ניסיון קוקאין חריף; 5 זריקות רצופות מכונות חשיפה כרונית. זריקה אחת הבאה ≥16 ימים של התנזרות מהקוק נקראת אתגר קוקאין. מגרש דינמיקת תעתיק מופנה בנקודות זמן ניסוי שונות הבאות ניסיון קוקאין (1, 2, 4, 8, 24hr). (ב) למסלול העכבר בתוך תא ההתנהגות הבא 3 ימים של הזרקת תמיסת מלח או 3 ימים של תמיסת מלח + חשיפת קוקאין חריפה אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 מיקום של הגרעין הנסמך במוח העכבר. קווים לבנים עבים לסמן את המיקום של חתכים המגדיר את b oundaries של NAC () סעיף עטרה;. (ב) סעיף sagittal. (תמונות שהותאמו מאלן מוח אטלס הפניה אטלס תמונות:. Http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100,883,869). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 פריימרים התכנון qPCR. הנחיות לתכנון פריימרים qPCR, עם הגדרות לספציפיות, יציבות ותאימות. "Target =" 2fig3highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 הערכה של יעילות פריימר. תוצאות () של עקומות הגברה של Fos וFosB תוך שימוש במערכי Fluidigm IFC. עקומה סטנדרטית נוצרה באמצעות שבעה דילולים של פי 3 סדרתי של רנ"א הכל חולץ מעכבר NAC ומשש לביטוי של Fos וFosB. (ב) היעילות של זוג פריימר לFos וFosB הוערכה על ידי התוויית ערך סף מחזור ( CT) בכל דילול נגד הלוגריתם של הדילול של פי המדגם. היעילות של פריימרים מחושבות מהשיפוע העקום הסטנדרטי, כהגדרתו בטקסט. עקומות ההגברה ונקודות על עקומת הדילול הן בהתאמה צבע.51,642 51642fig4highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5 פרופיל המקיף qPCR יישום פלטפורמת Fluidigm. () 96.96 מערך דינמי IFC לReal-Time PCR כמותי. פריימרים נטענים בפתחי הכניסה ממוקמות בצד ימין, והדגימות נטענות בפתחי הכניסה ממוקמות בצד השמאל של השבב. נתון זה כבר שונה באישור מדריך למשתמש בזמן אמת Fluidigm PCR ניתוח. מפת חום (ב ') על תוצאות qPCR, המייצגת את ערכי Ct לכל גם על השבב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 תוצאות לדוגמא של דינמיקת הביטוי הבא חשיפת קוקאין חריפה. ביטוי מושרה קוקאין של c-Fos וFosB מוצגים כפונקציה של זמן. ממוצעים של חזרות ניסיוניות המרובעות, שבוצעו על פי הפרוטוקול המוגדר במסמך זה, מוצגים, יחד עם ברים שגיאה המתארים שגיאת תקן של הממוצע.

מגיב MW מ"מ g / L
NaCl (סיגמא אולדריץ', 71,376) 58.44 119 6.95
NaHCO 3 (סיגמא אולדריץ', S6014) 84.01 26 2.18
גלוקוז (סיגמא אולדריץ', G8270) 180.16 10 1.8
KCl (סיגמא אולדריץ', P9541) ד> 74.55 2.5 0.186
לאא 2 PO 4 (סיגמא אולדריץ', S9638) 137.99 1 0.138
4 MgSO ⋅7H 2 O (סיגמא אולדריץ', M1880) 246.5 4 0.99
CaCl 2 (סיגמא אולדריץ', C3011) 147 4 0.59

פתרון ACSF טבלת 1.

שם תוכנה יישום מיקום אינטרנט
רוש Probefinder עיצוב פריימרים http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
פריימר-פיצוץ צמח השדה עיצוב פריימרים http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> רשימת תוכנות טבלת 2.

מגיב נפח / תגובה (μl) נפח ל48 תגובות overage 10% + (μl) נפח ל96 תגובות overage 10% + (μl)
2X TaqMan preamp מיקס מאסטר (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 ננומטר (10X) תערובת פריימר נקווה 1 52.8 105.6
מים 0.25 13.2 26.4
cDNA 1.25
נפח כולל 5

לוח 3: פתרון תגובת STA.

מצב החזק 10-14 מחזורים החזק
טמפרטורה 95 ºC 95 ºC 60 ºC 4 ºC
זמן 10 דקות 15 שניות 4 דקות

לוח 4: תנאי מחזור תרמיים לטרום הגברה.

רכיב לכל 5 לדוגמא μL (μl) 48 דוגמאות עם Overage (μl) 96 דוגמאות עם Overage (μl)
מים 1.4 84 168
מאגר תגובת exonuclease אני 0.2 12 24
Exonuclease אני ב20 יחידות / μl 0.4 24 48 </ Td>
נפח כולל 2.0 120 240

לוח 5: פתרון תגובת ExoI.

</ Tr>
MIX מדגם נפח רכיב למפרצון (μl) נפח למפרצון עם Overage (μl) נפח ל48.48 מערך דינמי IFC (μl) (120 דגימות) נפח ל96.96 מערך דינמי IFC (μl) (120 דגימות)
2X SsoFast EvaGreen Supermix עם נמוך רוקס (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
כובע ירוק 20X DNA Binding מגיב טוען לדוגמא דיי (Fluidigm, PN 100- 3738) 0.25 0.3 18 36
מדגם טופל STA וExoI 2.25 2.7
סך הכל 5 6

פתרון Pre-Mix לוח 6: דוגמא.

>
רכיב נפח למפרצון (μl) נפח למפרצון עם Overage (μl) נפח ל48.48 מערך דינמי IFC (μl) נפח ל96.96 מערך דינמי IFC (μl)
מגיב טוען 2X Assay 2.5 3 180 360
ההשעיה 1X DNA חוצץ (TE EDTA הנמוך) 2 2.4 144 288
50 מיקרומטר כל קדימה מעורב וPrimers ההפוך 0.5 0.6
נפח כולל 5 6

לוח 7: פתרון Assay מיקס.

שם מגיב / חומרים חברה מספר קטלוגי
Virusol Oriek רפואי J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
ערכת RNeasy תוספת האוניברסלית Mini QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79,654
קיבולת גבוהה ערכת cDNA ההפוך תמלול Invitrogene AB-4368814
TE הצפת Invitrogene 1355656

רשימת .8 שולחן של כימיקלים / חומרים כימיים.

h = "389">
שם ציוד חברה מספר קטלוגי
התנהגות הקאמרית (MDF; 50 x 45 סנטימטר) עצמי התאסף
תיבת פרספקס פנימית (30 x 30 סנטימטר) עצמי התאסף
מצלמת תמונות ומצלמת וידאו קמפדן Inst CMD-80051
תוכנה מקליט מדיה Noldus NDS-NMR3-00M
המספריים איריס FST FST-14,062-09
Vibratome קמפדן Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies Bioanalyzer 2100 Agilent
Cycler תרמית Bio-Rad 1852048
מרית microspun הפוכה Bochem כלי GmbH 3213
Biomark HD Reאדר Fluidigm BMHD-BMKHD
צ'יפ מערך דינמי לביטוי 96.96 גן Fluidigm BMK-M-96.96

רשימת ציוד לוח 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפיון מוצלח של ביטוי גנים מרקמת המוח הבא פרדיגמות התנהגות תלוי: 1) טיפול זהיר של עכברים במהלך הפרדיגמה ההתנהגות; 2) לנתיחה מהירה ומדויקת של רקמה של עניין; 3) אמצעי RNA-בטוח כדי להבטיח את התקינות של רנ"א; ו4) תכנון זהיר של פריימרים ופריסה ניסיונית כמו גם דיוק ותשומת לב לפרטים בהכנה לניתוח qPCR.

המטרה של ההליך המתואר היא לאפיין את הדינמיקה של אירועי תעתיק הנגרמים על ידי ניסיון התנהגותיות; לכן, תשומת לב קפדנית הוא הכרחית על מנת להבטיח כי הפרדיגמה ההתנהגות חוותה על ידי העכבר אכן מייצגת את הניסיון שנועד על ידי החוקר. לדוגמא, אפילו בפרדיגמה פשוטה כמו רגישות התנהגות לקוקאין, הניסיון של העכבר יכול להיות מושפע מגורמי בלבול רבים: הניסיון הקודם של העכבר בכלוב בבית לפני לשעברperiment; השיטה של ​​העברה לחדר הניסוי; החשיפה לאור, צליל וריח בחדר הניסוי; הניסיון של טיפול על ידי הנסיין; כאב / אי הנוחות הנגרמת על ידי הזרקת IP; חשיפה לניסוי חדשני, והניסיון הבא ההתנהגות עד לנקודה של המתת חסד שצוינה. כל אחת מהחוויות אלה עשויים, בבידוד, לקדם אינדוקציה של תוכניות תעתיק באזורי המוח שונים של העכבר. לכן, יש להקפיד על מנת להבטיח כי תכנית תעתיק מודדת את הפרדיגמה הרצויה, ואינו קשור תופעה-לווים עם הפרדיגמה. במקרה של ניסיון קוקאין, זו מושגת בקלות על ידי ניסויים זהירים ותשומת לב לפרטים, כמו גם ניסוי שליטה פשוט, שבה כל הפרמטרים נשמרים קבועים, אבל רכב (מלוח) מוזרקת לעכבר ולא הקוקאין. מניסיוננו, הזרקה מי מלח גורמת לתכנית תעתיק של בקנה מידה מוגבלת מאוד בהשוואה לחשיפת קוקאין, הוכחה כי הפרדיגמה גורפת מאפשרת חקירה של התופעות של עניין.

יש לנקוט זהירות רבה כדי להגביל את הטווח של חוויות של העכבר בזמן שהוא עדיין פעיל, דבר המחייב טיפול רגוע וזהיר של העכברים. בניגוד לכך, בעקבות הרדמה, עבודה מהירה ומדויקת היא הכרחית בשל הפוטנציאל לשינויים מהירים בייצוג של RNA (בזמנים של דקות) והרפיפות הפנימית של RNA, אשר יכולה להיות מושפל במהירות ברגע שהתאים הם שיבשו, שעלולים להיות לשבש את פרופיל תעתיק הנגרם על ידי ניסיון. לכן חשוב להסיר את המוח מהגולגולת במהירות לסביבה מקוררת (בתוך 1-2 דק ') ומהירות לנתח את NAC בתנאים קר כקרח. ברגע שהמוח כבר מקורר, הפוטנציאל לשינויי תעתיק או השפלה RNA מופחת באופן משמעותי, אך רק כאשר הסעיפים הרלוונטיים ממוקמים במגיב TRIzol וקפוא, iשל שלמות הרקמה והייצוג של פרופיל תעתיק הבטיחו.

בהקשר זה, כדאי להזכיר כי דינמיקת תעתיק של ביטוי מיידי מוקדם גן מתרחשת על זמן בקנה מידה מהירה, לעתים קרובות הגיע לשיא שעות לפני 1 בעקבות גירוי. בהקשר של פרדיגמה הניסויית המתוארת, החקירה של דינמיקת תעתיק מוגבלת לסולם של שעות על מנת להפחית את השונות בין דגימות. לפעמי שעות קצרות יותר מאשר 1, וריאציות קטנות בעיתוי עלולות לגרום לשונות רבות בגודל של שינויי תעתיק נצפו. לכן נקודת זמן 1 שעה כבר נבחרה לניתוח, שכן נקודה זו בזמן היא באופן ניסיוני קלה יותר לבצע בדייקנות, והוא פחות רגיש לשינויים ברמה של הבדל כמה דקות בניסוי.

באופן מסורתי, micropunch רקמות כבר בשימוש על ידי מעבדות רבות לנתיחה של דגימות רקמה. ישהוא מספר הסיבות להעדיף microdissection הידני של הרקמה. האגרוף הוא בדרך כלל עשוי מפלדה אל חלד ואינו שקוף. לכן מיצוב האגרוף במיקום מדויק ועקבי יכול להיות מסובך. יתר על כן, האגרוף אינו מאפשר כל תיקון להתבצע אם הייתה טעות במיקום הראשוני. לבסוף, הפקה של רקמה מתוך האגרוף יכולה לפעמים להוכיח מסובכת, ויש פוטנציאל לאובדן רקמות, או לשאת על בין דגימות. Microdissection של הרקמות באמצעות אזמל דק מאפשר הנסיין שליטה מדויקת יותר ומספק ביטחון בנוגע לטוהר של הדגימות.

במהלך מיצוי RNA ועד סינתזת cDNA, סביבת העבודה צריכה להיות נקיה ממקורות המזהמים RNase, ועבודה צריכה להתבצע באמצעות RNase כלים, מתכלה וריאגנטים חופשיים. בשלב זה, הזיהום הקטן ביותר יכול בקלות מושחת בעמל דגימות RNA. שמירת הדגימות iקר ce הוא חיוני למזעור פעילות עצבית שיכול לשנות את קריאת תעתיק, כמו גם לצמצום פעילות האנזימטית שיכול להשפיע על שלמות מדגם. לפעמים מתווספים מעכבים תרופתיים נוספים כדי להפחית את הרגישות עצבית, אך לעתים קרובות אלה אינם חיוניים.

בעקבות הפוך שעתוק לcDNA, הדגש הופך להבטחת תוקפו של התוצאות שהתקבלו מהפרופיל המקיף של תמלילים. הצעד הראשון הוא להבטיח כי פריימרים qPCR מתאימים מנוצלים, שעבורו זה מומלץ מאוד לבדוק את היעילות וספציפיות פריימר על עקומות דילול של מקור מוגדר של RNA. פריימרים PCR אופטימליים לספק הגברה ספציפית ויעילה של היעד. הגברה ספציפית מרמזת כי הגברה היא רק של רצף היעד, כפי שמעיד שיא בדיד יחיד בניתוח עקום התכה, תוך הגברה יעילה מרמזת כי בכל מחזור, הכמות של רצף היעד היאמשוכפל, עם יעילות שלהן דומים 100%. בגלל אופי התפוקה הגבוהה של שבבי qPCR microfluidic, ניסויים אלה דורשים תכנון קפדני על מנת להבטיח את הכללה של מספר לא מבוטל של בקרות חיוביות ושליליות. עדיף כוללים בקרות עקביות בכל טווח שבב, המאפשר השוואה ישירה של התוצאות משליטה ותנאי ניסוי. במהלך ההגדרה של הניסוי, חשוב לא לבארות לחצות-לזהם. מאז כמות זעירה של פריימרים בבאר הלא נכונה עלולה לגרום להגברה של היעד רצוי, יש לנקוט במשנה זהירות כאשר pipetting פריימרים.

עבור רוב דגימות רקמה מהמוח שקשה להיות בטוחים כי במהלך הנתיחה רק הרקמות של העניין היו שחולצו, ללא זיהום של אזורים במוח לא רלוונטיים, שיכול לבלבל את ניתוח התוצאות. לשם כך, שליטה חשובה היא חיטוט לגנים ביטוים צפוי שלא להיכללהרקמות של עניין. כלי שימושי לזיהוי תבניות המרחביות של ביטוי גנים הוא אלן מוח האטלס (http://www.brain-map.org/).

בעוד דיון מעמיק בניתוח נתונים הוא מעבר להיקף של פרסום זה, יש לציין כי ניתוח זהיר כתבי ניסויים זהירים. זה חשוב לוודא כי מספר גני התייחסות הרלוונטיים כלולים בכל סיבוב של qPCR. גנים אלה ישמשו לנורמליזציה על מנת להבטיח שכמויות דומות של רנ"א שמתבצעת assayed. נורמליזציה מבוצעת ראשונה לגני ההתייחסות בתוך המדגם, ולאחר מכן לעכברי התייחסות לניסוי ("זמן 0"), יישום "שיטת ΔΔCt".

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה נועד ללמוד דינמיקת תעתיק הבאה ניסיון קוקאין בגרעין הנסמך של עכברים. עם זאת, זה מאוד בקלות adapteד ללימוד כל ניסיון אחר של העכבר, כל עוד בקרות נאותות מיושמים, והעיתוי של החוויה מוגדרת היטב. ברור, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם לחקר הדינמיקה של שעתוק ברקמות מחוץ למערכת העצבים, כמו גם.

יודגש כי פרופיל תעתיק מקיף באמצעות qPCR מבוסס microfluidic הוא שיטה יעילה וחסכונית של פרופיל אירועי תעתיק, אבל תלוי בידע מוקדם של גני המטרה של עניין. אלה הם בדרך כלל מתקבלים באמצעות שיטות אפיון משוחדות, כגון microarrays ורצף עמוק. לכן, בזרימת העבודה של פרויקט גדול, פרופיל qPCR מקיף יכול לספק את חלק הארי של הנתונים, אבל מעדיף צריכה לעקוב אפיון משוחד מראש של המערכת.

כדאי גם קבעו כי התהליך המתואר במסמך זה לקבלת דגימות רקמה יכול גם להיות מיושם לכיוון מחקרing מגוון אירועים אחרים סלולריים - פרוטאומיקה ושינויי חלבון, metabolomics, lipidomics וסימנים אפיגנטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
  2. Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
  3. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  4. Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
  5. Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
  6. Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
  7. Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
  8. Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
  9. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
  10. Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
  11. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).
  12. Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
  13. Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
  14. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
  15. Carlezon, W. A. Jr, et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
  16. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
  17. Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
  18. Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
  19. Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
  20. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
  21. Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
  22. Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
  23. Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
  24. Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
  25. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
  26. Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
  27. Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
  28. Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
  29. Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics