Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Кодирование опытом в головном мозге и консолидации долгосрочной памяти зависит от транскрипции генов. Определение функции специфических генов в опыте кодирования является одним из основных задач молекулярной нейробиологии. Кроме того, функциональная ассоциация определенных генов с конкретными поведения имеет значение для понимания основ нервно-психических расстройств. Индукционная надежных программ транскрипции наблюдалось в мозге мышей следующих различные поведенческие манипуляции. В то время как некоторые генетические элементы используются периодически следующих различных поведенческих манипуляций и в различных ядер головного мозга, транскрипционные программы в целом уникальным для индуцирующих стимулов и структуры, в котором они изучаются 1,2.

В этой публикации, протокол описан для надежной и всеобъемлющей транскрипции профилирования из мозга зародышей мышей в ответ на манипуляции поведенческих.Протокол продемонстрирована в контексте анализа динамики экспрессии генов в прилежащем ядре после острого опыт кокаина. После определено в естественных условиях опыта, целевой нервной ткани рассекают; с последующей очисткой РНК, обратная транскрипция и использования микрофлюидных массивов для комплексного КПЦР анализа нескольких генов-мишеней. Этот протокол направлена ​​на всестороннее анализа (адресации 50-500 генов) ограничения количества исходного материала, таких как небольшие образцов мозга или даже отдельных клеток.

Протокол является наиболее выгодным для параллельного анализа нескольких образцов (например одиночных клеток, динамического анализа следующей фармацевтической, вирусной или поведенческих возмущений). Тем не менее, протокол также мог бы служить для характеризации и контроля качества образцов до целого генома исследованиях микрочипов или RNAseq, а также проверка данных, полученных из цельного исследований генома.

Introduction

Динамичной организацией мозгом позволяет когнитивные и поведенческие гибкость. Опыт кодируются путем изменения структуры и прочности связей между нейронами в мозге 3. Это "опыт-зависимой пластичности" является результатом индукции специфических форм генной экспрессии, что обеспечивает необходимые белки для модификации синаптической структуре и прочности 4. Идентификация генов регуляторных сетей посредником образование долгосрочной памяти является центральным принципом молекулярной нейробиологии, с ожиданием, что идентификация доминирующих элементов транскрипционных программ обеспечит понимание основных принципов, регулирующих формирование памяти, а также целевые показатели для лечение нейродегенеративных и психоневрологических расстройств. Транскрипции программы развернется в временно-определенных волн, каждая из которых кодирует гены разного характера, которые важны для гifferent этапы реализации исхода данного события сигнализации 1,2. Поэтому важно, чтобы обратиться транскрипционные динамику на детальном временном масштабе времени, с тем чтобы определить полный набор генов, индуцированных, и разобраться в их потенциальной функции в соответствии с динамикой их индукции.

Наркомания является надежной формой зависящей от опыта пластичности, вызванного долговременными последствиями злоупотреблением наркотиками на нейронных цепей в мозгу 5,6. Начальное, острое воздействие препаратов может привести к развитию наркомании и переход к хроническим использования. Контекстной информации является ключевым элементом в развитии наркомании. Связанных с наркотиками средовые сигналы назначаются важное значение в сознании наркоманов. Контекстная информация напоминая наркоманом прошлого опыта наркотиков может вызывать рецидив к наркотиков тягу даже после длительных периодов воздержания от наркотиков воздействия 7,8.Поэтому великий клинической проблемой в зависимости - склонность наркоманов к рецидиву даже долгое время после снятия симптомов убыль 9.

Поведенческая сенсибилизация к кокаину является простая модель кокаина опыта полезной при изучении механизмов наркомании. В этом широко изученной модели для длительной сенсибилизации, вызванной хроническим воздействием наркотиков, вызывающих зависимость, грызуны сначала приучали к засоленных инъекций (внутрибрюшинными; IP) в новой среде (открытой полевой камеры, в которой их двигательную активность контролируется) ; Затем, они получают ежедневные инъекции кокаина в камерах открытом пространстве в то время как их деятельность контролируется 10 (рисунок 1). Это поведенческая парадигма обычно приводит в прочном сенсибилизации поведения опорно-двигательного (8-12 раз выше базовой деятельности) 11, который ведется в течение нескольких месяцев после прекращения приема кокаина инъекций, демонстрируя образование извращенецasive след памяти опыта наркотиков.

Нейронная схема вознаграждения, естественно участие в укреплении поведения, необходимые для успеха того или иного вида (например, подачи, секс), эксплуатируется злоупотреблением наркотиками укрепления наркотиками связаны с поведением 12,13. Молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых опыт злоупотреблением наркотиками усиливается, кажется, похожи на механизмы, лежащие образование декларативных или семантических воспоминаний в других структурах мозга 14. Таким образом, надежность поведенческой модели сенсибилизации делает его привлекательным модельную систему для изучения механизмов зависящей от опыта пластичности.

Прилежащем ядре (NAC) является центральным интегратор награду схемы мозга, и была широко ассоциируется с развитием наркомании 5,6. Формирование наркомании зависит от транскрипции новых белков в прилежащем ядре, и надежная вводство четко структурированных программ транскрипции наблюдается в NAc следующие кокаина опыта 15-19. Острая транскрипции ответ на воздействия кокаина, вероятно, работать на нескольких уровнях для того, чтобы адаптироваться к сильной индукции стимула и направить производство новых белков, которые несут ответственность за структурные и электрофизиологических изменений, вызванных воздействием препарата 6,19-22.

В целях содействия изучению молекулярных механизмов зависящей от опыта пластичности в мозге, протокол описывается для всестороннего анализа динамики транскрипции в пробах мозговой ткани следующем поведенческой манипуляции. Протокол иллюстрируется в контексте поведенческой опыта исследуемой в лаборатории Citri - поведенческой чувствительности к кокаину, используя микрофлюидных динамические массивы для транскрипции анализа. Протокол описано, очевидно, не ограничивается изучением тОн прилежащем ядре в контексте поведенческой сенсибилизации, но может быть применен к большому числу поведенческих парадигм и областей головного мозга. В самом деле, этот протокол может быть применен к ткани тела вне мозга, а также различные опыте или манипуляций организма изучены.

Протокол грубо разделить на четыре стадии. На первом этапе, животное подвергают поведенческой парадигмы; на втором этапе ткань микродиссекции; на третьем этапе - мРНК очищенная, обратной транскрипции и зондируют, и на конечной стадии данные анализируются.

В контексте изучения транскрипционных динамику, точные сроки и определение опыта, вероятно, наиболее важные экспериментальные параметры для управления. По этой причине, наша модель поведения выбора является то, что поведенческой чувствительности к кокаину, системы, которая обеспечивает высокую степень контроля над экспериментатора параметров experienсе. Дополнительные поведенческие парадигмы, которые позволяют точное время и решению различных моделей зависящей от опыта пластичности или формирования памяти доступны. Эти модели включают страх кондиционирование 23, острый экологической обогащения 24,25, по исследованию объекта роман 26 и визуальный опыт следующую темной воспитания 27. Тем не менее, поведенческая сенсибилизация к кокаину является последовательно надежный поведенческая манипуляции, создавая весьма распространенной след памяти, которая длится в течение нескольких месяцев после кокаина опыт 28.

Мозг подразделяется последующим ручным микродиссекции прилежащем ядре. Это был наш опыт, что руководство микродиссекции от быстро подготовленных срезах мозга обеспечивает самый надежный и быстрый метод извлечения ткани, необходимой для поведенческой парадигмы, и с опытом, границы ткани становится очевидной и легко распознаваться. Кроме того, тонкие ломтики может быть ДГОред, затем лазер-захвата микродиссекции. Хотя этот метод позволяет высоко определяется разграничение интересующей области, это очень медленный процесс (что может привести к потере лабильного мРНК), утомительно и требует дорогостоящего специализированное оборудование (микроскоп, оснащенный лазерной установки захвата). Протокол определено здесь также может быть адаптирована к одноклеточного транскрипции анализа, ручной аспирации цитоплазме визуально выявленных клеток с использованием патч пипетки 29. Важно отметить, что протокол, описанный обеспечивает среднем населения, в то время как весьма вероятно, что в большинстве случаев, только субпопуляции клеток в ткани на самом деле участвует в борьбе с опытом. Представляет интерес к профилю транскрипцию выборочно, изнутри конкретных клеточных популяций, принявших участие в опыте, но обсуждение этих подходов выходит за текущей области.

Для очистки мРНК, с обратной транскрипцией и КПЦР Запросы, тканинарушается, пропуская ее через тонкие иглы, с последующим использованием коммерчески доступных наборов (для получения дополнительной информации, табл 8). Выбор сообщается опытом с этих методологий, обеспечивающих надежную экстракцию высокой РНК качества и надежных результатов последующих применений.

Хотя протокол описан для высокой пропускной кПЦР используя динамические массивы, образцы могут быть проверены экспрессии генов с помощью конечной точки ПЦР, с низкой пропускной КПЦР, генные микрочипы выражения или глубоко секвенирования. Предпочтение высокой пропускной КПЦР с использованием динамических массивов связано с тем, что мРНК, полученной из ядер головного мозга следующие поведенческие парадигмы часто предельных величин. Динамические массивы обеспечить платформу, которая позволяет эффективно всесторонний анализ транскриптов из большого количества параллельных образцов в одном эксперименте. После первоначального приобретения микрожидкостной системы (обычно институциональной о.е.rchase), эксперименты являются относительно недорогими для запуска. После этого анализа, дальнейшее Запрос образцов может быть выполнена с использованием более дорогостоящих платформ для поиска новых транскриптов (на микрочипов или RNAseq) с динамические массивы предоставление всеобъемлющей информации для обеспечения качества. Наконец, для анализа данных, стандартные методы используются. Конкретные указатели, касающиеся вопросов, которые могут возникнуть, будут обсуждены в тексте протокола.

Этот протокол является наиболее подходящим для следователей, заинтересованных в тщательного расследования их системы интересов, обучающихся несколько условий и повторов. Протокол также наиболее подходящий для следователей, которые уже отточенные в (через микрочипов или RNAseq экспериментов) на подмножестве 50-500 интересующих генов, которые они заинтересованы в запросе неоднократно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол следует руководству по уходу животное из Еврейского университета в Иерусалиме.

1 Получение раствора ACSF

  1. Подготовьте ACSF решение, как описано в таблице 1. Сделайте 1 л в DDh 2 O (> 18 МОм чистоты), в результате чего осмолярность до ~ 300 мОсм / л с соответствующим добавлением воды или NaCl.

2 Оборудование и номер Настройка

Оборудование для мониторинга кокаина вызванной поведения опорно-двигательного состоит из поведения камер (50 х 45 см) проводных с внутренним источником света, вентилятором и камеры (или инфракрасных датчиков), и оснащены внутренней коробке плексигласа (30 х 30 см) в которые мышей свободно перемещаться в то время как их передвижение отслеживается. Поведенческий тест следует проводить в период между 1 час после включения света до 1 ч перед выключенным светом, на регулярной цикле свет / темнота. Животные должны быть обучены последовательно, в то же время каждый день.

  1. Очистить камеры после каждого испытания с дезинфицирующим средством, представленной мыши объекта и / или удаления запаха реагента, с тем чтобы предотвратить смещение обонятельный кий и обеспечить надлежащую дезинфекцию.

ВАЖНО: При работе мыши тихо, спокойно и осторожны.

3 Подготовка животных

  1. Дом 5 C57BL6 самцов мышей (6-12 недель; ~ 25-35 г веса) на клетку, в комнате с 12 ч цикл свет / темнота и свободный доступ к пище и воде, в соответствии со стандартами и требованиями местных животных Уход комитета руководство и протоколы. Перед началом эксперимента, взвесить мышей и регистрировать данные. Кокаин позже вводили в соответствии с массой тела мышей.
  2. Перенесите все клетки, содержащие мышей в поведенческих комната 30 мин до начала первого судебного разбирательства.
  3. Приучить всемышей в эксперименте, чтобы экспериментатор обработки, инъекции и мониторинга в настройках поведения. Это достигается за счет 3 последовательных ежедневных внутрибрюшинных инъекций 250 мкл физиологического раствора, как описано ниже.
  4. Администрирование внутрибрюшинно инъекцию 250 мкл физиологического раствора. Сразу же после инъекции, поместить курсор в поведении камеры, чтобы контролировать двигательную активность в течение 15 мин. Повторите это действие в течение 3 дней подряд, в тот же час каждый день.
  5. На четвертый день, разделить мышей на две группы. Подготовка исходного раствора кокаина на 2 мг / мл в физиологическом растворе. Вводить одну инъекцию кокаина раствора (конечная 20 мг / кг) в экспериментальной группе в зависимости от веса мыши (например, для мыши 25 г - инъекции 250 мкл, тогда как 30 г мыши получают 300 мкл). Администрирование физиологический раствор с контрольной группой. Сразу же после инъекции, поместите курсор в течение 20 мин в поведении камеры для мониторинга двигательной активности (Typicсоюзник, первые 15 мин контролируются).
  6. После инъекции кокаина, пожертвовать мышей в различные моменты времени (0, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после инъекции). Важно отметить, что убедиться, что ссылки мышей (0 момент времени) не будет получать инъекции в этот день. С учетом его важности, необходимо включить повторов контрольной группы.

4 Рассечение прилежащем ядре

  1. Обезболить мышей с изофлуран в соответствующее время после инъекции кокаина / физиологический раствор. ИФ должны быть непосредственно вентилируемые из комнаты. Таким образом, процедура должна быть выполнена в химическом вытяжном шкафу.
  2. Мониторинг глубины анестезии путем тестирования заднюю ножку рефлекс. Зажмите лапу, чтобы вызвать реакцию Изъятие животного. Животное, которое показывает рефлекс не при хирургической уровня анестезии и не в состояние усыпить.
  3. Добыча мозга:
    1. Усыпить мыши путем обезглавливания.
    2. <литий> Снимите над центром черепа кожу и вырезать череп с острыми ножницами.
    3. Вставьте ножницы в точке, где спинной мозг поступает в мозг (затылочного отверстия) и сделать два боковых порезов.
    4. С той же точки, чтобы длинный сагиттальной разрез вдоль стреловидного шва. По достижении обонятельной луковицы, клип влево и вправо.
    5. С пинцетом удалите череп тщательно, захватывая каждую половину черепа твердо и потянув в сторону, стараясь не нажимать на или повредить мозг.
    6. Снимите мозг в то время разрыва черепные нервы с помощью перевернутой микро ложку шпателем.
  4. Поместите мозг в растворе ACSF ледяной в течение 1-2 мин, чтобы охладить и затвердевают.
  5. Удалить мозг от ACSF, фитиль избыток жидкости с бумажным полотенцем, создать корональной разрез между мозжечка и остальной части головного мозга и клей мозг, с ростральной части вверх, на этапе vibratome.
  6. Резка НАК: Поддержание ACSF решения на ледяных температурах в нарезания палаты vibratome. Раздел на 200 мкм до прилежащем ядре (НАК) четко определены в соответствии с Paxinos и Франклина мозга мыши Атлас (примерно 1,8 мм впереди брегмы; обратить внимание на форму мозолистого тела, расположения и формы передней спайки и желудочки, а также в целом морфология секции мозга). В этот момент создания двух секций 400 мкм, из которых НАК будет разрезать.
  7. Под стереоскоп, использовать тонкую лезвие рассекать область НАК из ломтиков. Определение НАК по атласу мозга мыши Paxinos и Франклин, и может быть легко рассекают в соответствующих разделах на четыре быстрых проходов лопатки на ткани. (Рисунок 2).
  8. Поместите НАК разделы сразу в 900 мкл Trizol лизиса реагента в микроцентрифужных трубки и хранить при температуре -80 ° C до РНК ЕхПИдействие.

5 Экстракция РНК и кДНК Обратная транскрипция

  1. Растопить пробирки, содержащие прилежащем ядре секции в триазол лизиса реагента при комнатной температуре и гомогенизации лизата с 1 мл шприца, подключенного к 25 G иглу, пока ткань не будет полностью гомогенизируют (по крайней мере в 15-20 раз). Первые несколько патронов трудно, и требуют нажатия ткани по отношению к стенке трубы, чтобы разорвать его на мелкие кусочки, которые могут войти в кончик иглы.
  2. Для обеспечения гомогенизации, пипетки лизата в QIAshredder мини колонке спина и центрифуге при 12000 мкг в течение 1 мин.
  3. Внесите лизат в новой трубки микроцентрифужных и извлечь РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить РНК при -80 ° С до использования.
  4. Измерьте концентрацию РНК, анализировать целостность и качество, используя Bioanalyzer или эквивалентную оборудование. Используйте 100-500 нг РНК для каждого раунда подготовки кДНК с гAndom гексамера грунтовки.

6 Грунтовка Дизайн и Primer Тестирование

  1. Выбор хороших праймеров: Для оптимального пары праймеров для кПЦР транскриптов мРНК, выполните следующие требования (рисунок 3):
    1. Дизайн праймеров, содержащие не более 17-28 оснований. Избегайте нуклеотидные повторы так как они способствуют ошибочного праймирования.
    2. Дизайн праймеров с температурой плавления (Т м) между 56-68 ° С (оптимально 60-64 ° C). Т м в течение пары праймеров должна быть в пределах 1 ° С от друга.
    3. Знайте, что размер продукта в идеале должен быть между 80 и 150 б.п..
    4. Убедитесь, что по крайней мере один из праймеров охватывает экзон-экзон соединение или ампликона содержит большое интрон (интрон-охватывая), чтобы избежать амплификации геномной ДНК загрязнений.
    5. С помощью надежного программного обеспечения на основе Primer3 (примеры таблица 2), чтобы улучшить дизайн праймера.
  2. Тестирование примеров: Для того чтобы обеспечить специфичность и эффективность праймеров, реакция КПЦР управления должна быть выполнена:
    1. Используйте положительное образец (содержащий шаблон кДНК для всех соответствующих пар праймеров) и титруют кДНК (например восемь три раза разведения от начальной концентрации ~ 10 нг) в двух экземплярах параллельных реакций. Включите контроль не-шаблона, который контролирует загрязнения в пределах решений, используемых для реакции.
    2. Рассчитать праймера эффективности по формуле: (10 (- 1 / наклон) -1) × 100, такая, что кривая оптимального склон - 3,333 (т.е. 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Рисунок 4).
    3. Определить специфику усиления. Удельный усиления демонстрируется одного видного пика, общей для всех кривых плавления амплифицированных продуктов, в то время как мимо цели усиления будет выглядеть как явная предвзятость фром один большой пик.

7 Анализ КПЦР

  1. Предварительно усиления:
    1. Комплексный анализ КПЦР основан на параллельной запросов ограничения количества РНК с большим числом пар праймеров. Таким образом, этап предварительной амплификации имеет важное значение. На этом этапе, кДНК проходит 14-18 циклов предварительной амплификации смесью всех праймеров, которые будут использоваться для запроса образца в будущем (до 800 пар праймеров).
    2. Развести все праймеров в ТЕ (низкий ЭДТА) до 50 мкм для конкретных целевых амплификации (STA).
    3. Бассейн вместе 1 мкл аликвоты все 50 мкМ праймера устанавливает которые должны быть включены в реакции STA, до 800 анализов.
    4. Готовят премикс и образцы для STA, как описано в таблице 3. Следует учитывать ошибки путем подготовки смеси для 110% от количества образцов, которые должны быть усилены.
    5. Алиготе 3,75 мкл STA премикс для каждого образца. Добавить 1,25 мклкДНК друг.
    6. Vortex смешивать реакции и центрифуги в течение 10 сек.
    7. Поместите реакции STA в термоциклере и цикла, как указано в таблице 4.
  2. Экзонуклеаза я (ExoI) лечение:
    1. Развести экзо I, как указано в таблице 5.
    2. Добавить 2 мкл разведенной ExoI (4 U / мкл) в каждой реакции STA 5 мкл, вихрь, спин вниз (> 6000 мкг в) и место в термоциклере на 37 ° С в течение 30 мин, а затем при 80 ° С в течение 15 мин.
    3. Развести конечные продукты до соответствующей концентрации для тестирования. Использование TE буфера (добавить 43 мкл ТЕ-буфера в 7 мкл образца TSA).
    4. Храните разводненной продукты STA при -20 ° С или использовать немедленно.
  3. Грунтовка и настройка образца для количественной ПЦР:
    1. Подготовка образцов, как показано в таблице 6. Готовят смесь в соответствии с чипом, выбранной для эксперимента, и добавить при необходимости образцы.
    2. АгиTate образца Mix решения в течение как минимум 20 секунд, и центрифугируют (> 6000 мкг) в течение по меньшей мере 30 сек. Подготовленные реакции можно хранить в течение короткого времени при 4 ° С до тех пор, чип не будет готов к погрузке.
    3. Подготовка пробы, как описано в таблице 7.
    4. Интенсивное перемешивание смеси для анализа в течение как минимум 20 сек и центрифуги (> 6000 мкг) в течение не менее 30 сек, чтобы спина вниз все компоненты.
      ВАЖНО: тщательно Vortex и центрифуги все образцы и аналитические решения перед отбором в чип вводов. Невыполнение этого требования может привести к снижению качества данных.
      Примечание: конечная концентрация каждого праймера 5 мкм на входе и 500 нМ в конечном реакции.
  4. Грунтовка и загрузка динамического массива IFC (интегрированный жидкостный контур) чип. Чип МФК имеет входы для проб и анализов, а также указанные входы (аккумуляторы) для контроля линии жидкости (минеральное масло), используемой для создания давления Микрожидкостных камеры (FIGURe 4А).
    1. Введите контрольной линии жидкости в каждом аккумуляторе на чипе.
    2. Удаляют синий защитную пленку с нижней части чипа.
    3. Поместите пластинку в соответствующий контроллер IFC (контроллер MX для 48,48 динамический массив МФК или контроллера HX IFC для 96.96 динамический массив IFC), затем запустить премьер (113Х) сценарий для 48,48 динамический массив МФК или премьер (136x) Сценарий для 96.96 динамический массив МФК в целях премьер-чипа.
    4. Когда сценарий закончил, удалить загрунтованную чип от контроллера МФК.
    5. Внесите 5 мкл каждого смеси для анализа и 5 мкл каждого образца смеси в их входные отверстия.
    6. Вернуться чип контроллера МФК.
    7. Использование программного обеспечения контроллера МФК, запустите Load Mix (113Х) сценарий для 48,48 динамический массив IFC) или Load Mix (136x) скрипт для 96.96 динамического массива IFC загрузить образцы и пробы в чип. Когда сценарий нагрузки Mix закончил, снять нагрузкучип-е изд от контроллера МФК.
    8. Загрузите чип на термоциклер, создать новый чипу работать (в соответствии с директивами производителя), в том числе анализа кривой плавления. Использование программного обеспечения термоциклер, убедитесь, что реакционные камеры признаются должным образом, и оставляют реакционную выполняться до завершения.

Анализ 8. данных

  1. Обеспечение качества: В целях обеспечения качества данных, проверки качества праймеров путем решения кривые разведения (как описано выше). Монитор специфичность амплификации путем просмотра кривых плавления ампликонов, пики, которые должны оптимально быть плотно выровнены 29.
  2. Визуализация: Для визуализации больших объемов данных, полученных с высокой пропускной кПЦР, использование программного обеспечения генерируется HeatMaps, в котором выражение цветом в зависимости от интенсивности. Кроме того, отображение транскрипции динамику отдельных генов как выстроились разброс участков.
  3. Публикация: В публикациирезультаты экспрессии генов, то рекомендуется следовать Руководству MIQE для публикации количественных ПЦР в реальном времени экспериментов, подробно минимальную информацию, что должно быть сообщено в течение эксперимента КПЦР для обеспечения ее актуальности, точности, правильной интерпретации и воспроизводимость.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Качество результатов, полученных с применением этого протокола в решающей степени зависит от ряда параметров. Правильное экспериментальная планирования приведет к минимальным вмешательством в жизнь подопытных мышей, так что испытания опыт (в этом примере, что из воздействия кокаина) будет самым доминирующим опыт в своей недавней истории, и, следовательно, приведет к надежной и определенной транскрипции Программа. Рисунок 1 описывает экспериментальную план поведенческой сенсибилизации к кокаину, определяя моменты времени после кокаина опыт, при котором прилежащем ядре рассекается от мышей и проанализированы. Следующий важный момент заключается в определении точных границ для удаления надлежащего ткани для анализа. Рисунок 2 описывает границы прилежащего ядра в корональных и сагиттальных срезов. Предпочтительно, чтобы рассечение должна быть выполнена таким образом, что тонкий край НАК ткани исключается из области Takан для профилирования. Это обеспечивает последовательное профилирование только НАК, снижение изменчивости и потенциал для артефактов, связанных с включением окружающие ткани.

При амплификации ограничение количества РНК, как и в рассечения небольших ядер головного мозга, многие циклов амплификации необходимы для правильного обнаружения сигнала. Поэтому важным моментом в любой количественной ПЦР эксперимента, дополнительно усиливается при работе с небольшими количествами исходного материала, является характеристика праймеров, используемых для амплификации. Рисунок 3 описывает основные функции в определении оптимальных праймеров, а на рисунке 4 показывает кривые амплификации праймеры направлены против с-Fos и FosB, демонстрируя, что эти пары праймеров амплификации свою целевую стенограмму с ~ 100% эффективности в каждом цикле. После проверки праймера и создание надлежащего экспериментальной парадигмы включить четкую оценку транскрипции от целевых TISSие, всесторонний анализ может быть выполнена на платформе Fluidigm Biomark, что позволяет до 9216 параллельных реакций КПЦР (в формате 96,96, рисунок 5). Это высокой пропускной платформа позволяет параллельный анализ нескольких экспериментальных повторений, с использованием идентичных условий эксперимента на одном кристалле. Данные для четырехместных экспериментальных повторений, обращаясь к индукции транскрипции с-Fos и FosB после острого опыт кокаина, демонстрируются на рисунке 6.

Рисунок 1
Рис.1 Экспериментальная парадигма для динамического транскрипции анализа следующей опыта кокаина. (А) Экспериментальный протокол - мышей приучали к обработке и инъекции в течение 3 дней, в то время мониторинга двигательную активность путем отслеживания видео в звукопоглощающий поведение камеры. Мышизатем подвергаются опыта кокаина; одноразовое действие = острый опыт кокаин; 5 последовательных инъекции называют хроническое воздействие. Одна инъекция следующие ≥16 дней воздержания от кокаина называется кокаина вызов. Транскрипционные динамика обращены в разные моменты времени экспериментальных следующих кокаина опыта (1, 2, 4, 8, 24 ч). (В) участка дорожки мыши в поведении камеры следующих 3 дней инъекции физиологического раствора или 3 дней физиологическим раствором + один острое воздействие кокаина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Местонахождение прилежащем ядре мозга мыши. Густые белые линии отметьте расположение разрезов, определяющий б oundaries НАК (A) Коронала часть;. (B) ветви. (Фотографии взято из Аллен мозга Атлас Справочный атлас Изображения:. HTTP: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; HTTP: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100883869 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Планирование КПЦР праймеров. Руководящие принципы для планирования КПЦР праймеров, с определениями для Специфичность, стабильность и совместимость. 2fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 Оценка грунтовки эффективности. (A) Результаты амплификации кривых Фос и FosB использованием массивов Fluidigm IFC. Стандартную кривую получали с использованием семи последовательных 3-кратных разведений общей РНК, извлеченной из мыши NAc и зондировали на экспрессию Fos и FosB. (В) Эффективность пары праймеров для Fos и FosB оценивали путем построения пороговое значение цикла ( Ct) на каждом разведении против логарифма кратного разведения образца. Эффективность праймеров рассчитаны из наклона калибровочной кривой, как это определено в тексте. Кривые амплификации и точки на кривой разведения являются по цвету.51642 / 51642fig4highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5 Комплексная КПЦР профилирование применения платформы Fluidigm. (A) 96.96 динамического массива IFC для Real-Time количественной ПЦР. Праймеры загружаются в впускных отверстий, расположенных в правой стороне, и образцы загружают в впускных отверстий, расположенных в левой стороне чипа. Эта цифра была изменена с разрешения Fluidigm ПЦР в реальном времени анализа руководстве пользователя. (B) Тепловая карта результатов КПЦР, представляющих значения Ct для каждой лунки на чипе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис.6 Примеры результатов динамики экспрессии следующие острого воздействия кокаина. Кокаин-индуцированной экспрессии с-Fos и FosB отображаются в виде функции времени. Средние значения четырехместные экспериментальных повторений, выполненных в соответствии с протоколом, определенным в настоящем документе, отображаются вместе с барами об ошибках, изображающих стандартную ошибку среднего.

Реагент МВт мМ г / л
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58.44 119 6.95
NaHCO 3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
Глюкоза (Sigma-Aldrich, G8270) 180.16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) д> 74.55 2.5 0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137.99 1 0,138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246,5 4 0,99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0,59

Таблица 1 ACSF решение.

Название программы Применение веб расположение
Roche Probefinder грунтовки дизайн http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI грунт-взрыв грунтовки дизайн http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Таблица 2 Список программного обеспечения.

Реагент Объем / Реакция (мкл) Объем для 48 реакций + 10% отслуживших свой срок (мкл) Объем для 96 реакций + 10% отслуживших свой срок (мкл)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 нМ (10X) объединяли грунт смесь 1 52.8 105,6
Вода 0.25 13.2 26.4
кДНК 1.25
Общий объем 5

Таблица 3 СТА реакционного раствора.

Состояние Держите 10-14 Циклы Держите
Температура 95 ° С 95 ° С 60 ° С 4 ° С
Время 10 мин 15 сек 4 мин

Таблица 4 Тепловой режим цикла для предварительной амплификации.

компонент За 5 мкл образца (мкл) 48 Образцы с отслуживших свой срок (мкл) 96 Образцы с отслуживших свой срок (мкл)
Вода 1.4 84 168
Экзонуклеаза я реакционного буфера 0.2 12 24
Экзонуклеаза я на 20 единиц / мкл 0.4 24 48 </ TD>
Общий объем 2.0 120 240

Таблица 5 ExoI Реакционный раствор.

</ TR>
ОБРАЗЕЦ MIX Объем компонентов за Inlet (мкл) Объем за Inlet с отслуживших свой срок (мкл) Объем для 48,48 динамический массив IFC (мкл) (120 образцов) Объем для 96,96 динамический массив IFC (мкл) (120 образцов)
2X SsoFast EvaGreen Supermix с низким ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X связывания ДНК Dye Образец Загрузка Реагент (Fluidigm, PN 100-3738) зеленый колпак 0.25 0.3 18 36
STA и ExoI обработанный образец 2.25 2.7
Всего 5 6

Таблица 6 Пример Pre-Mix решение.

Таблица 7 решение Анализ Mix.

Компонент Объем за Inlet (мкл) Объем за Inlet с отслуживших свой срок (мкл) Объем для 48,48 динамический массив IFC (мкл) Объем для 96,96 динамический массив IFC (мкл)
2X Анализ Загрузка Реагент 2.5 3 180 360
1X ДНК Подвеска буфера (TE низкий ЭДТА) 2 2.4 144 288
50 мкМ каждого смешанного прямого и обратного праймеров 0.5 0.6
Общий объем 5 6
Название реагента / Материал Компания Номер по каталогу
Virusol Oriek Медицинский J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC НДЦ 60307-110-25
RNeasy плюс Универсальный мини комплект QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
Высокая емкость кДНК Обратная транскрипция комплект Invitrogene AB-4368814
TE буфера Invitrogene 1355656

Таблица 8 Список химических веществ / реагентов.

Название оборудования Компания Номер по каталогу
Поведение палата (МДФ; 50 х 45 см) Само собраны
Внутренняя коробка плексигласа (30 х 30 см) Само собраны
Фотокамера и видеокамера Campden ин CMD-80051
Программное обеспечение Recorder Медиа Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Ножницы ФСТ ФСТ-14062-09
Vibratome Campden Ин. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies Agilent 2100 Bioanalyzer
Термоциклер Bio-Rad 1852048
Перевернутые microspun шпатель Bochem Инструмент GmbH 3213
Biomark HD ReАдер Fluidigm BMHD-BMKHD
Динамический Чип массив для выражения 96.96 гена Fluidigm БМК-M-96.96

Таблица 9 Перечень оборудования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Успешное характеристика экспрессии генов из мозговой ткани следующие поведенческие парадигмы зависит от: 1) осторожного обращения мышей во время поведенческой парадигмы; 2) Быстрая и точная рассечение ткани интересов; 3) РНК-сейф меры для обеспечения целостности РНК; и 4) Тщательное планирование праймеров и экспериментальной макета, а также точность и внимание к деталям в ходе подготовки к анализу КПЦР.

Цель с процедурой, описанной в характеризовать динамику транскрипционных событий, индуцированных поведенческого опыта; Поэтому, особое внимание необходимо для того, чтобы гарантировать, что поведенческая парадигма испытывали с помощью мыши, действительно представляет собой опыт, предназначенный исследователем. Например, даже в таком простом парадигмы как поведенческой сенсибилизации к кокаину, опыт мышью может быть подвержено влиянию многих сопутствующих факторов: предварительное опыт мыши в домашнем клетку до эксперимента; Способ передачи в экспериментальной комнате; свет, звук и запах экспозиции в экспериментальной комнате; опыт работы с экспериментатором; боль / дискомфорт вызванный инъекцией; Воздействие нового эксперимента, и опыт после указанного поведения до точки эвтаназии. Каждый из этих переживаний может, в изоляции, способствовать индукцию транскрипции программ в различных областях мозга мыши. Поэтому необходимо позаботиться, чтобы убедиться, что транскрипционный программа измеряет нужный парадигму, а не эпифеноменами связаны с парадигмой. В случае опыта кокаина, это легко достигнуто путем тщательных экспериментов и вниманием к деталям, а также простого контрольного эксперимента, в котором все параметры поддерживаются постоянными, а транспортного средства (физиологического раствора) вводят в мыши, а не кокаин. По нашему опыту, физиологический раствор для инъекций вызывает транскрипционный программу очень ограниченных масштабах по сравнению сЭкспозиция кокаин, демонстрируя, что парадигма подавляющем позволяет расследование явлений, представляющих интерес.

Предельное внимание следует ограничить спектр переживаний мыши в то время как он все еще активен, требуя спокойную и бережного обращения из мышей. В отличие от этого, следуя анестезии, быстрая и точная работа имеет важное значение в связи с потенциалом для быстрых изменений в представлении РНК (на шкале времени минут) и внутренней лабильности РНК, которые могли бы быть быстро разлагается, как только клетки разрушают, потенциально нарушая транскрипции профиля, вызванное опытом. Поэтому важно, чтобы извлечь мозг из черепа быстро охлажденной среде (в пределах 1-2 мин) и быстро рассекают НАК в ледяных условиях. Как только мозг был охлажден, потенциал для транскрипционных изменений или деградации РНК значительно сокращаются, но только тогда, когда соответствующие разделы размещены в TRIzol реагента и замораживают, яс целостность ткани и представление транскрипции профиль обеспечена.

В этом контексте, стоит отметить, что транскрипционные динамика выражения непосредственной-начале гена происходит на быстром масштабе времени, часто достигая максимума до 1 ч после стимуляции. В контексте описанной экспериментальной парадигмы, опрос транскрипции динамики ограничивается масштабе часов, чтобы уменьшить вариабельность между образцами. Для раз короче, чем 1 час, небольшие изменения в сроках может привести к большой вариации в величине транскрипционных изменений, наблюдаемых. Таким образом, момент времени 1 час был выбран для анализа, так как на этот раз Дело в том, экспериментально легче выполнить с точностью, и менее подвержен изменению на уровне разницей в несколько минут эксперимента.

Традиционно, ткани micropunch был использован многими лабораториями для вскрытия проб тканей. Тамряд причин, предпочитают ручной микродиссекции ткани. Пуансон, как правило, изготовлены из нержавеющей стали и не является прозрачной. Поэтому позиционирование удар точным и последовательным расположением может быть сложнее. Кроме того, удар не позволяет любое исправление быть сделаны, если была ошибка в первоначальном позиционировании. Наконец, добыча ткани изнутри удар может иногда оказаться хитрым, и есть потенциал для потери ткани, или перенос между образцами. Микродиссекция ткани с помощью тонкой скальпель позволяет экспери- ментаторам более точное управление и обеспечивает безопасность в отношении чистоты образцов.

Во время экстракции РНК и вплоть до синтеза кДНК, рабочая среда должна быть от источников РНКазных загрязнений бесплатно, и работа должна быть выполнена с использованием РНКазы бесплатные инструменты, одноразовые и реагентов. На этом этапе, самый маленький загрязнения могут легко поврежден кровные образцов РНК. Ведение образцы яCE холодным имеет решающее значение для сведения к минимуму нейронной активности, которые могут модифицировать транскрипции считывания, а также свести к минимуму ферментативную активность, что может повлиять на целостность образца. Дополнительные фармакологические ингибиторы иногда добавляют для снижения нейронной возбудимости, но часто они не являются существенными.

После обратной транскрипции в кДНК, акцент превращается в обеспечении достоверности результатов, полученных от полной профилирования транскриптов. Первый шаг заключается в обеспечении надлежащих праймеры КПЦР используются, для которых она настоятельно рекомендуется проверить праймера эффективность и специфичность на кривых разбавления определенного источника РНК. Оптимальные ПЦР-праймеры предоставить конкретную и эффективную амплификацию мишени. Специфической амплификации предполагает, что усиление только с последовательностью-мишенью, очевидно, в виде одного пика в дискретной анализа кривой плавления, в то время как эффективность амплификации означает, что в каждом цикле, количество последовательностью-мишенью,дублированы, с эффективностью, близкой к 100%. В связи с высокой пропускной способностью природы микрофлюидных чипов КПЦР, эти эксперименты требуют тщательного планирования, чтобы обеспечить включение значительного числа положительных и отрицательных контролей. Желательно включить последовательные элементы управления в каждом чипе перспективе, что позволяет прямое сравнение результатов контрольных и экспериментальных условиях. Во время установки эксперимента, важно, чтобы не заражать скважин. Поскольку небольшое количество праймеров в неправильном скважины может привести усиление нежелательных цели, дополнительная забота должна быть взята, пипетки праймеров.

Для большинства образцов ткани из мозга трудно быть уверенным, что во время вскрытия только ткань интерес экстрагировали, без загрязнения неактуальных областях мозга, которые могли бы посрамить анализ результатов. Для этого, важным управления зондирования генов выражение, как ожидается, будет исключен изткань интерес. Полезным инструментом для выявления пространственных закономерностей экспрессии генов является Аллен Brain Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Хотя подробное обсуждение анализа данных выходит за рамки данной публикации, следует отметить, что тщательное гарантирует экспериментирование тщательного анализа. Важно убедиться, что ряд соответствующих справочных генов включены в каждом раунде кПЦР. Эти гены будут служить для нормализации для того, чтобы гарантировать, что аналогичные количества РНК анализировали в настоящее время. Нормализация выполняется первым эталонных генов в образце, а затем с опорными мышей в эксперименте ("времени 0"), применяя метод "ΔΔCt".

Протокол, описанный в этой рукописи направлена ​​на изучение транскрипционных динамику следующие опыта кокаина в прилежащем ядре мышей. Тем не менее, это очень легко Adapteг для изучения любого другого опыта мыши, пока надлежащего контроля реализуются, а также сроки опыта корректно определено. Очевидно, что этот протокол также может быть реализован для изучения динамики транскрипции в тканях за пределами нервной системы, а также.

Следует подчеркнуть, что всестороннее транскрипции профилирования используют Микрожидкостных основе КПЦР является экономически эффективным методом профилирования транскрипционные события, но зависит от предварительного знания генов-мишеней, представляющих интерес. Они обычно получают через объективных методов профилирования, таких как микрочипы и глубокого секвенирования. Таким образом, в рабочем процессе большого проекта, комплексное КПЦР профилирование может обеспечить большую часть данных, но преимущественно должны следовать предварительного объективную характеристику системы.

Стоит также о том, что процесс, описанный в данном документе для получения образцов ткани также может быть реализован в сторону исследованиячисле множество других клеточных событий - протеомики и модификаций белков, метаболомики, lipidomics и эпигенетических.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
  2. Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
  3. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  4. Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
  5. Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
  6. Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
  7. Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
  8. Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
  9. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
  10. Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
  11. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).
  12. Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
  13. Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
  14. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
  15. Carlezon, W. A. Jr, et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
  16. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
  17. Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
  18. Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
  19. Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
  20. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
  21. Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
  22. Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
  23. Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
  24. Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
  25. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
  26. Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
  27. Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
  28. Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
  29. Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics