Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

A codificação de experiências no cérebro e na consolidação de memórias de longo prazo dependerá de transcrição do gene. Identificar a função de genes específicos em experiência de codificação é um dos principais objetivos da neurociência molecular. Além disso, a associação funcional de genes definidos com comportamentos específicos tem implicações para a compreensão da base de transtornos neuropsiquiátricos. A indução da transcrição de programas robustos foi observado no cérebro de ratinhos após várias manipulações comportamentais. Enquanto alguns elementos genéticos são utilizados recorrentemente seguinte diferentes manipulações comportamentais e em diferentes núcleos do cérebro, os programas de transcrição são em geral única para os estímulos indutores e a estrutura na qual eles são estudados 1,2.

Nesta publicação, um protocolo é descrito para perfilamento transcricional robusta e abrangente de núcleos cerebrais de ratos em resposta à manipulação comportamental. Aprotocolo é demonstrado no contexto da análise da dinâmica de expressão de genes no núcleo accumbens seguinte experiência aguda cocaína. Subseqüente a um definido na experiência vivo, o tecido neural alvo é dissecado; seguido por purificação de RNA, a transcrição reversa e a utilização de matrizes de microfluidos para a análise detalhada de qPCR de múltiplos genes alvo. Este protocolo é voltada para análise abrangente (dirigindo-50-500 genes) de limitar a quantidade de matéria-prima, tais como amostras de cérebros pequenos, ou mesmo uma única célula.

O protocolo é o mais vantajoso para a análise de amostras múltiplas em paralelo (por exemplo, células isoladas, análise dinâmica seguinte farmacêutica, viral ou perturbações comportamentais). No entanto, o protocolo também pode servir para a caracterização e garantia de qualidade das amostras antes de estudos todo o genoma por microarrays ou RNAseq, bem como a validação dos dados obtidos a partir de estudos de todo o genoma.

Introduction

Organização dinâmica do cérebro permite flexibilidade cognitiva e comportamental. Experiências são codificadas através de modificações da estrutura e força das conexões entre os neurônios no cérebro 3. Este "dependente da experiência plasticidade" é o resultado da indução de padrões específicos da expressão do gene que fornece as proteínas necessárias para a modificação da estrutura e força 4 sináptica. A identificação de redes de regulação gênicas mediar a formação de memórias de longo prazo é um princípio central da neurociência molecular, com a expectativa de que a identificação dos elementos dominantes de programas de transcrição irá fornecer uma visão sobre os princípios fundamentais que regulam a formação da memória, bem como metas para tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Programas de transcrição desdobrar-se em ondas temporalmente definidos, cada um dos quais codificam genes de caráter diferente, que são importantes para destágios iferentes na implementação dos resultados do evento de sinalização 1,2. Por isso, é importante abordar a dinâmica de transcrição em um prazo temporal, detalhado, de modo a identificar o conjunto completo de genes induzidos, e obter insights sobre sua função potencial de acordo com a dinâmica de sua indução.

A dependência de drogas é uma forma robusta de dependentes de experiência plasticidade causada pelos efeitos duradouros das drogas de abuso em circuitos neurais no cérebro 5,6. Inicial, a exposição aguda a drogas pode levar ao desenvolvimento de dependência e da transição para a utilização crónica. A informação contextual é um elemento crucial para o desenvolvimento de dependência. Pistas ambientais associadas à droga são atribuídas importância significativa nas mentes dos usuários de drogas. A informação contextual lembrando um usuário de drogas de experiência de drogas no passado pode induzir a recaída ânsia de drogas, mesmo após longos períodos de abstinência de exposição ao fármaco 7,8.Daí o grande desafio clínico em vício - a propensão dos adictos recaírem mesmo muito tempo depois de os sintomas de abstinência têm abrandado 9.

Sensibilização comportamental à cocaína é um modelo simples de cocaína experiência útil no estudo dos mecanismos da dependência de drogas. Neste modelo amplamente estudado para a sensibilização de longa duração induzida pela exposição crônica às drogas de abuso, roedores estão habituados a primeira injeção de solução salina (intraperitoneal, IP) em um ambiente de romance (uma câmara de campo aberto, no qual sua atividade locomotora é monitorado) ; em seguida, eles recebem injecções diárias de cocaína nas câmaras de campo abertas, enquanto a sua actividade é monitorizada 10 (Figura 1). Este paradigma comportamental resulta tipicamente numa sensibilização robusta de comportamento locomotor (8-12 vezes superior actividade de linha de base) 11, que é mantida durante um período de vários meses após a cessação das injecções de cocaína, demonstrando a formação de um taradotraço de memória ASIVE de experiência com drogas.

O circuito neural de recompensa, naturalmente envolvido em reforçar comportamentos essenciais para o sucesso de uma espécie (por exemplo, alimentação, sexo), é explorada por drogas de abuso para reforçar comportamentos associados ao fármaco 12,13. Os mecanismos moleculares e celulares, através da qual a experiência de drogas de abuso é aumentada parecem ser semelhantes aos mecanismos subjacentes à formação da memória declarativa ou semânticas em outras estruturas cerebrais 14. Portanto, a robustez do modelo sensibilização comportamental faz com que seja um sistema modelo atraente para estudar mecanismos de dependentes de experiência plasticidade.

O núcleo accumbens (NAC) é um integrador central do circuito de recompensa do cérebro, e tem sido extensivamente associados com o desenvolvimento da dependência de 5,6. A formação de vício depende da transcrição de novas proteínas no núcleo accumbens, e robusto emprodução de programas de transcrição bem estruturados é observado no NAc seguinte experiência cocaína 15-19. A resposta transcricional aguda a exposição à cocaína é susceptível de funcionar em vários níveis, a fim de adaptar-se ao forte estímulo de indução e para direcionar a produção de novas proteínas que são responsáveis ​​pelas mudanças estruturais e eletrofisiológicas induzidas pela exposição à droga 6,19-22.

A fim de promover o estudo dos mecanismos moleculares dos dependentes de experiência plasticidade no cérebro, um protocolo descrito para a análise global da dinâmica de transcrição em amostras de tecido cerebral após a manipulação comportamental. O protocolo é ilustrada no contexto da experiência comportamental estudada no laboratório Citri - sensibilização comportamental à cocaína, utilizando matrizes dinâmicas de microfluidos para a análise da transcrição. O protocolo descrito, obviamente, não se limita ao estudo tele nucleus accumbens no contexto da sensibilização comportamental, mas poderia ser aplicado a um grande número de paradigmas comportamentais e regiões do cérebro. Na verdade, este protocolo pode ser aplicado aos tecidos do corpo fora do cérebro, e uma variedade de experiências ou manipulações do organismo estudado.

O protocolo é dividido em quatro etapas. No primeiro passo, o animal é submetido ao paradigma comportamental; No segundo passo, o tecido é microdissecados; na terceira etapa - mRNA é purificado, reversamente transcrito e sondadas, e na etapa final, os dados são analisados.

No contexto do estudo da dinâmica de transcrição, o tempo preciso e definição da experiência são provavelmente os parâmetros experimentais mais importantes para o controle. Por esse motivo, o nosso modelo de comportamento de escolha é a de sensibilização comportamental à cocaína, um sistema que permite elevado nível de controlo sobre os parâmetros do experimentador da experience. Paradigmas comportamentais adicionais que permitem o sincronismo preciso e abordam diferentes modelos de dependentes de experiência plasticidade ou a formação da memória estão disponíveis. Estes modelos incluem o medo condicionado 23, enriquecimento ambiental aguda 24,25, romance objeto de exploração 26 e experiência visual após criação escuro 27. Ainda assim, a sensibilização comportamental à cocaína é uma manipulação comportamental consistentemente robusta, criando um traço de memória altamente penetrante, que dura meses seguintes experiência cocaína 28.

O cérebro é seccionado, seguido por microdissecção manual dos nucleus accumbens. Tem sido a nossa experiência que microdissecção Manual de fatias de cérebro rapidamente preparados proporciona o método mais fiável e rápido de extracção do tecido relevante para o paradigma comportamental, e com a experiência, as fronteiras do tecido tornam-se evidentes e facilmente reconhecidas. Alternativamente, fatias finas poderiam ser prepared, seguido por captura a laser microdissecção. Embora este método permite a delineação muito da região de interesse definidas, isto é lento (correndo assim o risco de perda de ARNm lábil), fastidioso e requer equipamento dispendioso dedicado (um microscópio equipado com uma instalação de captura por laser). O protocolo aqui definido também pode ser adaptado para análises de transcrição de uma única célula, por aspiração do citoplasma das células identificadas visualmente, utilizando pipetas de remendo 29. É importante notar que o protocolo descrito fornece uma média populacional, ao mesmo tempo que é altamente provável que, na maioria dos casos, apenas uma sub-população de células dentro do tecido são, na verdade, envolvido na resposta à experiência. É de interesse para o perfil de transcrição de forma seletiva a partir de dentro de populações de células específicas em resposta à experiência, mas a discussão dessas abordagens está além do escopo atual.

Para a purificação de ARNm, transcrição reversa e de qPCR de consulta, o tecidoé interrompido por passagem através de agulhas finas, seguido pela utilização de kits comerciais (para mais informações, consulte a Tabela 8). A escolha é informado pela experiência com essas metodologias que garantam a extração segura de RNA de alta qualidade e resultados robustos de aplicações a jusante.

Enquanto o protocolo é descrito por de alto rendimento qPCR utilizando matrizes dinâmicas, as amostras podem ser sondado para a expressão de genes usando ponto final PCR, de baixo rendimento qPCR, microarrays de expressão gênica ou seqüenciamento de profundidade. A preferência por qPCR de alto rendimento, utilizando matrizes dinâmicas é devido ao facto de ARNm obtido a partir de núcleos cerebrais seguinte paradigmas comportamentais é frequentemente de quantidades limitantes. Matrizes dinâmicas fornecer uma plataforma que permite a análise global eficiente dos transcritos de um grande número de amostras em paralelo numa única experiência. Após a aquisição inicial do sistema de microfluidos (vulgarmente uma pu institucionalrchase), as experiências são relativamente baratos para ser executado. Na sequência desta análise, mais consultas das amostras pode ser realizada utilizando as plataformas mais caras para procurar novas transcrições (por microarrays ou RNAseq) com as matrizes dinâmicas proporcionando uma referência abrangente para a garantia da qualidade. Finalmente, para a análise de dados, são utilizados métodos convencionais. Ponteiros específicos a respeito de questões que possam surgir serão discutidos no texto do protocolo.

Este protocolo é mais apropriado para os investigadores interessados ​​em uma investigação completa do seu sistema de interesse, estudando várias condições e repetições. O protocolo também é mais adequado para os investigadores que já afinados (através de microarray ou RNAseq experimentos) em um subconjunto de 50-500 genes de interesse, que eles estão interessados ​​em consultar repetidamente.

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Protocol

NOTA: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade Hebraica de Jerusalém.

1 Preparação da solução de ACSF

  1. Preparar solução ACSF como descrito na Tabela 1. Adicione 1 L de ddH2O (> 18 mohms pureza), para trazer a osmolaridade ~ 300 mOsm / L, com adição apropriada de água ou de NaCl.

2. Equipamentos e sala preparada

O equipamento para o monitoramento do comportamento locomotor induzido pela cocaína é composto por câmaras de comportamento (50 x 45 cm) com fio com uma fonte de luz interior, ventilador e uma câmera (ou sensores de infravermelho), e está equipado com uma caixa de perspex interior (30 x 30 cm) em que os ratos estão autorizados a circular livremente enquanto sua locomoção é monitorada. O teste comportamental deve ser realizado entre 1 hora após as luzes acesas para 1 hora antes de as luzes apagadas, em um ciclo claro / escuro regular. Os animais devem ser treinados de forma consistente, ao mesmo tempo cada dia.

  1. Limpar as câmaras depois de cada ensaio com desinfectante fornecida pela instalação de rato e / ou remoção de odores de reagentes, a fim de evitar a polarização de sinalização olfactivo e para assegurar a desinfecção adequada.

IMPORTANTE: Ao manusear os ratos ficar quieto, calmo e cuidadoso.

Preparação 3 Animais

  1. Casa 5 C57BL6 camundongos machos (6-12 semanas de idade; ~ 25-35 g de peso) por gaiola, em uma sala com um ciclo claro / escuro de 12 horas e livre acesso a alimentos e água, de acordo com as normas e requisitos de Experimentação Animal Cuidados orientação e protocolos Comitê. Antes de iniciar o experimento, os ratos pesar e registrar os dados. A cocaína é administrada mais tarde de acordo com o peso dos ratos.
  2. Transferir todas as gaiolas contendo ratos na sala comportamental 30 min antes de começar o primeiro julgamento.
  3. Habituar todo ocamundongos utilizados no experimento de manipulação do experimentador, injeções e acompanhamento na configuração do comportamento. Isto é conseguido através de injecções intraperitoneais 3 consecutivas diárias de 250 ul de solução salina, como descrito abaixo.
  4. Administrar uma injeção intraperitoneal de 250 mL de solução salina. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 min. Repita esta ação durante 3 dias consecutivos, na mesma hora todos os dias.
  5. No quarto dia, dividem os ratos em dois grupos. Prepara-se uma solução estoque de cocaína a 2 mg / ml em solução salina. Administrar uma única injecção de uma solução de cocaína (finais de 20 mg / kg) para o grupo experimental de acordo com o peso do rato (por exemplo, para um rato de 25 g - injectar 250 ul, ao passo que um rato de 30 g irá receber 300 ul). Administrar solução salina ao grupo de controlo. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse por 20 minutos em uma câmara de comportamento para o monitoramento da atividade locomotora (Latossoloaliado, os primeiros 15 min são monitorados).
  6. Após a injecção de cocaína, sacrificar os ratinhos em diferentes pontos de tempo (0, 1, 2, 4, 8 e 24 h após a injecção). Importante, certifique-se que os ratos de referência (0 ponto de tempo) não receberá qualquer injecção neste dia. Devido à sua importância, é imperativo incluir repetições do grupo de referência.

4. Dissecção de núcleo accumbens

  1. Anestesiar os ratos com isoflurano, no momento apropriado após a injecção de cocaína / soro fisiológico. O isoflurano deve ser ventilado directamente para fora da sala. Portanto, o procedimento deve ser realizada numa hote química.
  2. Monitorização da profundidade da anestesia, testando o reflexo do pé traseiro. Aperte a pata para provocar uma resposta de retirada pelo animal. Um animal que mostra um reflexo não está em um nível cirúrgico de anestesia e não em um estado de eutanásia.
  3. A extracção do cérebro:
    1. Eutanásia o mouse por decapitação.
    2. <li> Retirar a pele acima do centro do crânio e cortar o crânio com uma tesoura afiada.
    3. Inserir as tesouras no ponto onde a medula espinal entra no cérebro (forame) e fazer dois cortes laterais.
    4. A partir do mesmo ponto, fazer um corte sagital longa ao longo da sutura sagital. Ao chegar ao bulbo olfatório, clipe para a esquerda e para a direita.
    5. Com uma pinça, retire o crânio com cuidado, segurando cada metade do crânio firmemente e puxando para o lado, tomando cuidado para não pressionar sobre ou danificar o cérebro.
    6. Remover o cérebro enquanto cortando os nervos cranianos, utilizando uma colher de micro invertida espátula.
  4. Inserir o cérebro em solução ACSF gelado durante 1-2 min para refrigerar e endurecer.
  5. Retirar do cérebro ACSF, pavio excesso de fluido com uma toalha de papel, criar um corte coronal entre o cerebelo e o resto do cérebro e cola no cérebro, com a porção rostral voltado para cima, sobre o palco vibratome.
  6. Cortar o NAc: Manter soluções aCSF a temperaturas geladas na câmara de corte do vibratome. Seção em 200 mM até o núcleo accumbens (NAC) é claramente identificado de acordo com o Paxinos e Franklin Rato Atlas Cerebral (aproximadamente 1,8 mm anterior ao bregma; prestar atenção à forma do corpo caloso, a localização ea forma da comissura anterior e os ventrículos, bem como a morfologia global da secção de cérebro). Neste ponto, criar duas secções de 400 um, a partir da qual o NAc serão dissecados.
  7. De acordo com um estereoscópio, use uma lâmina fina para dissecar a área de NAc fora das fatias. A definição da CNS é de acordo com o atlas do cérebro do rato Paxinos e Franklin, e pode convenientemente ser dissecado em seções apropriadas por quatro passes rápidos da lâmina sobre o tecido. (Figura 2).
  8. Coloque seções Nac imediatamente em 900 mL de Trizol reagente de lise em um tubo de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até RNA extração.

Transcrição 5 Extração de RNA e cDNA Reversa

  1. Descongelar os tubos contendo o núcleo accumbens secções em reagente Trizol lise à temperatura ambiente e homogeneizar o lisado com uma seringa de 1 ml ligada a 25 G até a agulha o tecido é completamente homogeneizada (pelo menos 15-20 vezes). As primeiras voltas são difíceis, e requerem que empurra o tecido contra a parede do tubo, de modo a dividi-la em pedaços pequenos que podem entrar na ponta da agulha.
  2. Para assegurar a homogeneização, pipetar o lisado para uma mini-coluna de spin QIAshredder e centrifugar a 12000 xg durante 1 min.
  3. Pipete o lisado para um novo tubo de microcentrifugação e extrair o ARN de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar o ARN a -80 ° C até à sua utilização.
  4. Medir a concentração de RNA, analisar a integridade e qualidade usando uma Bioanalyzer ou equipamento equivalente. Use 100-500 ng RNA para cada rodada de preparação cDNA com rAndom primers hexaméricos.

6. Primer Projeto e Testes Primer

  1. Escolhendo bons primers: Para um par de primers ideal para qPCR de transcritos de mRNA, siga estes requisitos (Figura 3):
    1. Primers projeto já não contendo de 17-28 bases. Evite repetições de nucleotídeos como eles promovem err�ea.
    2. Iniciadores de design com temperatura de fusão (Tm) entre 56-68 ° C (60-64 ° C de forma óptima). A T m de dentro do par de primers devem estar dentro de 1 ° C, de um ao outro.
    3. Esteja ciente de que o tamanho do produto deve ser idealmente entre 80 e 150bp.
    4. Certifique-se de que pelo menos um dos iniciadores inclui uma junção exão-exão, ou o fragmento amplificado contém um grande intrão (intrão-spanning), para evitar a amplificação de contaminantes de ADN genómico.
    5. Use um software confiável com base em Primer3 (para exemplos, ver Tabela 2), a fim de melhorar o projeto de primer.
  2. Testando o prIMers: A fim de assegurar a especificidade e eficácia dos iniciadores, uma reacção de qPCR de controlo devem ser executadas:
    1. Use uma amostra positiva (contendo ADNc molde para todos os pares de iniciadores relevantes) e titula-se o ADNc (por exemplo, oito diluições de três vezes a partir de uma concentração inicial de ~ 10 ng), em reacções paralelas em duplicado. Incluir um controlo sem molde, o qual controla a contaminação dentro das soluções utilizadas para a reacção.
    2. Calcular a eficiência do iniciador por meio da fórmula: (10 (- 1 / declive) -1) x 100, de tal forma que a curva da inclinação óptima é - 3,333 (isto é, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4).
    3. Determinar a especificidade da amplificação. Amplificação específica é demonstrada por um único pico proeminente comum para todas as curvas de fusão dos produtos de amplificação, enquanto que fora da amplificação alvo, apresentado como um desvio óbvio from o único grande pico.

7 Análise qPCR

  1. Pré-amplificação:
    1. Análise abrangente qPCR baseia-se na consulta paralelo de limitar as quantidades de ARN com um grande número de pares de iniciadores. Portanto, um passo de pré-amplificação é essencial. Neste passo, o ADNc é submetido a 14-18 ciclos de pré-amplificação com uma mistura de todos os iniciadores que irão ser utilizados para a consulta da amostra no futuro (até 800 pares de iniciadores).
    2. Diluir todos os primers em TE (baixo EDTA) a 50 mm para Alvo amplificação específica (STA).
    3. Piscina juntos alíquotas de 1 ul de tudo do iniciador 50 uM define a ser incluído na reacção STA, até 800 ensaios.
    4. Preparar uma pré-mistura e as amostras para STA, tal como descrito na Tabela 3. Permitir erro através da preparação de mistura de 110% do número de amostras a serem amplificadas.
    5. Aliquota de 3,75 mL de STA de pré-mistura para cada amostra. Adicionar 1,25 mLde cDNA para cada.
    6. Vortex para misturar as reações e centrifugar por 10 seg.
    7. Coloque as reacções STA em um termociclador e ciclo como indicado na tabela 4.
  2. Exonuclease I (ExoI) tratamento:
    1. Dilui-se a Exo I, como indicado na Tabela 5.
    2. Adicionar 2 mL de ExoI diluído (4 U / mL) para cada reação STA 5 jul, vortex, girar para baixo (> 6.000 xg) e coloque em um termociclador a 37 ° C durante 30 minutos e depois a 80 ° C durante 15 min.
    3. Dilui-se os produtos finais a uma concentração apropriada para o ensaio. Use TE Buffer (adicionar 43 mL de tampão TE para a amostra TSA 7 mL).
    4. Guarde os produtos STA diluído a -20 ° C ou o uso imediatamente.
  3. Primer e configuração de exemplo para qPCR:
    1. Preparar as amostras como se mostra na Tabela 6. Preparar a mistura de acordo com o chip escolhida para a experiência, e adicionar as amostras conforme apropriado.
    2. Agilitar as soluções de amostra da mistura por um período mínimo de 20 segundos, e centrifugar (> 6000 xg) durante pelo menos 30 seg. Reacções preparadas podem ser armazenadas durante períodos de tempo curtos, a 4 ° C até que o chip é pronto para carga.
    3. Preparar os ensaios tal como descrito na Tabela 7.
    4. Agitar a mistura de ensaio durante um mínimo de 20 seg e centrifuga-se (> 6000 xg) durante pelo menos 30 segundos para girar para baixo de todos os componentes.
      IMPORTANTE: Vortex bem e centrifugar todas as soluções de amostra e ensaio antes da pipetagem para as entradas de chips. Não fazer isso pode resultar em uma diminuição da qualidade dos dados.
      NOTA: A concentração final de cada iniciador é de 5 uM na entrada e 500 nM no final da reacção.
  4. Priming e carregando a matriz dinâmica IFC (circuito de fluídica integrado) de chips. O chip IFC tem entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas (acumuladores) para a linha de controlo de fluido (óleo mineral) utilizados para pressurizar as câmaras de microfluidos (Figure 4A).
    1. Injectar fluido da linha de controlo em cada um acumulador no chip.
    2. Remover e descartar o filme protector azul a partir do fundo do chip.
    3. Coloque o chip no controlador IFC apropriado (controlador MX para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o controlador HX IFC para a 96,96 dinâmico matriz IFC), em seguida, executar o script Prime (113x) para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o Prime (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para ferrar o chip.
    4. Quando o script for concluído, retire o chip ferrado do controlador IFC.
    5. Pipeta de 5 mL de cada mistura de ensaio e 5 mL de cada amostra em Mix suas entradas.
    6. Retorne o chip para o controlador IFC.
    7. Usando o software controlador IFC, execute o Mix (113x) roteiro de Carga para o 48.48 dinâmico matriz IFC) ou Carregar Mix (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para carregar as amostras e ensaios para o chip. Quando o script de carga Mix terminar, retire a cargachips ed do controlador IFC.
    8. Coloque o chip no termociclador, crie um novo prazo chip (de acordo com as instruções do fabricante), incluindo a análise de curva de fusão. Usando o software termociclador, assegurar que as câmaras de reação são reconhecidas corretamente, e permitir que a reação de correr para a conclusão.

Análise de Dados 8.

  1. A garantia da qualidade: A fim de garantir a qualidade dos dados, verificar a qualidade dos iniciadores de endereçamento curvas de diluição (como descrito acima). Monitorar a especificidade da amplificação exibindo as curvas de fusão de fragmentos amplificados, os picos de forma otimizada, que deve ser bem alinhada 29.
  2. Visualização: Para visualização de grandes quantidades de dados obtidos pelo alto rendimento qPCR, utilize o software gerado heatmaps, em que a expressão é de intensidade de cor correspondente. Além disso, apresentar a dinâmica de transcrição de genes individuais como gráficos de dispersão alinhados.
  3. Publicação: Em publicaçãoos resultados de expressão gênica, é aconselhável seguir as orientações MIQE para publicação de experimentos quantitativos PCR em Tempo Real, detalhando as informações mínimas que devem ser comunicadas para um experimento de qPCR para garantir a sua exactidão, a interpretação correta, e reprodutibilidade.

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Representative Results

A qualidade dos resultados obtidos através da aplicação deste protocolo crucialmente depende de um número de parâmetros. Planeamento experimental adequada irá resultar na perturbação mínima aos ratinhos experimentais, de modo a que a experiência testado (neste exemplo, que a exposição a cocaína) será a experiência mais dominante na sua história recente, e, portanto, irá resultar num forte e específico da transcrição programa. Figura 1 descreve o plano experimental para a sensibilização comportamental à cocaína, que define os pontos de tempo após a experiência de cocaína no qual o núcleo accumbens é dissecado a partir de ratos e analisados. O próximo ponto fundamental é a de definir os limites precisos para a excisão de tecido adequada para análise. Figura 2 descreve os limites do núcleo accumbens, em secções coronais e sagitais. De preferência, o esvaziamento deve ser realizada de tal modo que uma pequena margem de tecido NAc é excluído da região taken para criação de perfis. Isto assegura perfis consistente apenas do NAc, reduzir a variabilidade e o potencial de artefactos decorrentes da inclusão de tecido circundante.

Ao amplificar quantidades limitantes de RNA, como para a dissecção de pequenos núcleos do cérebro, de muitos ciclos de amplificação são necessários para a detecção correcta do sinal. Portanto, um ponto crucial em qualquer experiência de PCR quantitativo, ainda mais amplificado quando se trabalha com pequenas quantidades de material de partida, é a caracterização dos iniciadores utilizados para amplificação. Figura 3 descreve características chave na definição de iniciadores óptimos, e A Figura 4 mostra as curvas de amplificação de iniciadores dirigidos contra c-Fos e FosB, demonstrando que estes pares de iniciadores amplificam o seu transcrito alvo com eficiência ~ 100% em cada ciclo. Após a validação primer e estabelecimento do paradigma experimental adequada para permitir uma avaliação clara da transcrição dos TISS-alvoue, análise abrangente pode ser realizado na plataforma Fluidigm Biomark, permitindo-se a 9.216 reacções paralelas (qPCR no formato 96,96, Figura 5). Esta plataforma de alto rendimento permite a análise paralela de múltiplas repetições experimentais, utilizando as condições experimentais idênticas em um único chip. Os dados de repetições experimentais quádruplos, abordando a indução da transcrição de c-Fos e FosB seguinte experiência aguda de cocaína, são mostrados na Figura 6.

Figura 1
Figura 1 paradigma experimental para a análise transcricional dinâmico seguinte experiência cocaína. (A) Protocolo experimental - ratos estão habituados ao manuseio e injeção por 3 dias, enquanto monitora a atividade locomotora por rastreamento de vídeo em câmara comportamento som atenuante. Ratossão, em seguida, sujeita a experiência de cocaína; uma única exposição = experiência aguda de cocaína; 5 injeções consecutivas são denominados exposição crônica. Uma única injeção seguinte ≥16 dias de abstinência de cocaína é considerado um desafio cocaína. Dinâmica de transcrição são dirigidas em diferentes pontos de tempo experimentais seguintes experiência cocaína (1, 2, 4, 8, 24 hr). (B) Lote da pista do rato no interior da câmara de comportamento seguinte de 3 dias de injecção de soro fisiológico ou 3 dias de uma solução salina + exposição à cocaína aguda único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 Localização de núcleo accumbens do cérebro do rato. Linhas brancas grossas marcar a localização dos cortes definindo a b oundaries da CNS (A) Secção coronal;. (B) Corte sagital. (Fotos adaptado do Atlas Cerebral Allen Referência Atlas de Imagens:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100883869 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3
Figura 3 primers Planejamento qPCR. Diretrizes para o planejamento de primers qPCR, com definições para a especificidade, estabilidade e compatibilidade. "Target =" 2fig3highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 A avaliação da eficiência do iniciador. (A) Os resultados das curvas de amplificação de Fos e FosB usando matrizes Fluidigm IFC. Uma curva padrão foi gerada utilizando diluições em série de 3 sete vezes de RNA total extraído de rato NAc e sondadas para a expressão de Fos e FosB. (B) A eficiência do par de primers para Fos e FosB foi avaliado através da representação gráfica do valor limiar de ciclo ( Ct) para cada diluição em função do logaritmo da diluição da amostra de dobragem. A eficiência dos iniciadores são calculados a partir do declive da curva padrão, tal como definido no texto. As curvas de amplificação e os pontos na curva de diluição são da mesma cor.51642 / "target =" 51642fig4highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 perfis Comprehensive qPCR aplicando a plataforma Fluidigm. (A) 96,96 matriz dinâmica IFC para o Real-Time PCR quantitativo. Os iniciadores são carregados nas entradas situadas no lado direito, e as amostras são carregadas nas entradas localizados no lado esquerdo do chip. Este valor foi modificado com a permissão de Fluidigm Tempo real Análise PCR Guia do Usuário. Mapa (B) Calor dos resultados de qPCR, representando valores de Ct para cada bem no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 Exemplo de resultados da dinâmica de expressão na sequência de uma exposição aguda de cocaína. A expressão induzida por cocaína do c-Fos e FosB são apresentados como uma função do tempo. Médias de repetições experimentais quádruplos, realizados de acordo com o protocolo definido aqui, são exibidos, juntamente com barras de erro retratando erro padrão da média.

Reagente MW mM g / L
De NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58.44 119 6.95
NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
A glicose (Sigma-Aldrich, G8270) 180,16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d> 74.55 2,5 0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137,99 1 0.138
MgSO4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246,5 4 0,99
CaCl2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0,59

Tabela 1 solução ACSF.

Nome do software Aplicação localização web
Roche Probefinder desenho iniciadores http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI primer à explosão desenho iniciadores http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Tabela 2 lista Software.

Reagente Volume / Reacção (ul) Volume por 48 Reações + 10% acima da idade (ul) Volume para 96 ​​Reações + 10% acima da idade (ul)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2,5 132 264
500 nM (10x) mistura de iniciador reunidas 1 52.8 105,6
Água 0,25 13.2 26.4
cDNA 1,25
Volume Total 5

Tabela 3 A solução reaccional STA.

Condição Segure 10-14 Cycles Segure
Temperatura 95 º C 95 º C 60 ° C 4 º C
Tempo 10 min 15 seg 4 min

Tabela 4 condições ciclo térmico de pré-amplificação.

componente Por 5 mL de amostra (mL) 48 amostras com Overage (ul) As amostras com 96 Overage (ul)
Água 1.4 84 168
Exonuclease I Tampão de reacção 0,2 12 24
Exonuclease I a 20 unidades / ul 0,4 24 48 </ Td>
Volume Total 2.0 120 240

Tabela 5 ExoI solução de reacção.

</ Tr>
AMOSTRA MIX Componente Volume por entrada (ul) Volume por entrada com Overage (ul) Volume de 48,48 matriz dinâmica IFC (l) (120 amostras) Volume de 96,96 matriz dinâmica IFC (l) (120 amostras)
2X SsoFast EvaGreen Supermix com baixa ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2,5 3 180 360
20X DNA Binding Dye Amostra Carregando Reagente (Fluidigm, PN 100-3738) tampa verde 0,25 0,3 18 36
STA e amostra tratada ExoI 2,25 2.7
Total 5 6

Tabela solução Pré-Mix 6 Amostra.

Tabela 7 Mistura de Ensaio solução.

Componente Volume por entrada (ul) Volume por entrada com Overage (ul) Volume de 48,48 matriz dinâmica IFC (ul) Volume de 96,96 matriz dinâmica IFC (ul)
Reagente Carregando 2X Assay 2,5 3 180 360
Suspensão de ADN 1X tampão (TE baixo EDTA) 2 2.4 144 288
50 mM cada Atacante mista e reverse primers 0,5 0,6
Volume Total 5 6
Nome do reagente / Material Empresa Número de Catálogo
Virusol Oriek Medical J29D
O isoflurano, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy Mini Kit mais universal QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
High Capacity cDNA kit transcrição reversa Invitrogene AB-4368814
Tampão TE Invitrogene 1355656

Tabela 8 lista de produtos químicos / reagentes.

Nome do Equipamento Empresa Número de Catálogo
Comportamento Câmara (MDF; 50 x 45 cm) Auto montado
Caixa de perspex interior (30 x 30 cm) Auto montado
Câmera e gravador de vídeo Campden Inst CMD-80051
Software Media Recorder Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies A Agilent 2100 Bioanalyzer
Termociclador Bio-Rad 1852048
Espátula microspun invertido Bochem Instrumento GmbH 3213
Biomark HD ReAder Fluidigm BMHD-BMKHD
Chip dinâmico matriz para a expressão do gene 96,96 Fluidigm BMK-M-96.96

Tabela 9 Lista de equipamentos.

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Discussion

Caracterização de sucesso da expressão gênica do tecido cerebral após paradigmas comportamentais depende de: 1) manejo cuidadoso de ratos durante o paradigma comportamental; 2) dissecção rápida e precisa do tecido de interesse; 3) medidas RNA segura de garantir a integridade do RNA; e 4) O planejamento cuidadoso de primers e delineamento experimental, bem como precisão e atenção aos detalhes na preparação para a análise de qPCR.

O objectivo do processo descrito é a caracterização da dinâmica de eventos de transcrição induzida por uma experiência de comportamento; por conseguinte, é necessária uma atenção cuidadosa, de modo a assegurar que o paradigma comportamental experimentada pelo ratinho, de facto representa a experiência pretendida pelo investigador. Por exemplo, mesmo em um paradigma tão simples como a sensibilização comportamental à cocaína, a experiência do rato pode ser influenciado por muitos fatores de confusão: a experiência prévia do rato na gaiola de casa antes do experiment; o método de transferência para a sala experimental; a exposição à luz, som e odor na sala experimental; a experiência de lidar com pelo experimentador; a dor / desconforto causado pela injeção IP; exposição a um novo ensaio, e a experiência seguindo o comportamento especificado, até ao ponto de eutanásia. Cada uma dessas experiências pode, isoladamente, promover a indução de programas de transcrição em várias regiões do cérebro do rato. Portanto, devem ser tomados cuidados para garantir que o programa transcricional mede o paradigma desejado, e não epiphenomena associado com o paradigma. No caso das experiências de cocaína, isto é facilmente conseguido através de experimentação cuidadosa e atenção ao pormenor, bem como uma experiência de controlo simples, na qual todos os parâmetros forem mantidas constantes, mas de veículo (solução salina) é injectado para o rato em vez de cocaína. Em nossa experiência, a injeção de solução salina induz um programa de transcrição de escala muito limitada em comparação com aexposição à cocaína, o que demonstra que o paradigma permite esmagadoramente investigação dos fenômenos de interesse.

Deve ser tomado cuidado possível para limitar a gama de experiências do mouse enquanto ele ainda está ativo, necessitando de tratamento de calma e cuidado com os ratos. Em contraste, após anestesia, o trabalho rápido e preciso é essencial devido ao potencial de mudanças rápidas na representação de RNA (na escala de tempo de minutos) e da labilidade intrínseca da RNA, o que poderia ser degradado rapidamente uma vez que as células são rompidas, potencialmente perturbar o perfil de transcrição induzida pela experiência. Por isso, é importante remover o cérebro do crânio rapidamente a um ambiente refrigerado (dentro de 1-2 min) e rapidamente dissecar o NAc em condições geladas. Uma vez que o cérebro tenha sido refrigerada, o potencial para modificações da transcrição ou da degradação do ARN é significativamente reduzida, mas apenas quando as secções relevantes são colocados em reagente Trizol e congelada, is a integridade do tecido e a representação do perfil da transcrição assegurada.

Neste contexto, vale a pena mencionar que a dinâmica de transcrição de expressão imediata do gene ocorre em uma escala de tempo rápido, muitas vezes, com um pico antes de 1 hora após a estimulação. No contexto do paradigma experimental descrito, a interrogação da dinâmica da transcrição está limitado à escala de horas, a fim de reduzir a variabilidade entre as amostras. Para tempos mais curtos do que 1 hora, pequenas variações no tempo pode resultar em grande variação da magnitude das alterações observadas transcrição. Por conseguinte, o ponto de tempo de 1 hora foi escolhida para análise, uma vez que este ponto do tempo é mais fácil de realizar experimentalmente com precisão, e é menos susceptível a variação no nível de uma diferença de alguns minutos na experiência.

Tradicionalmente, micropunch tecido foi usado por muitos laboratórios para dissecção de amostras de tecido. Nãoé um número de razões para preferir microdissecção Manual do tecido. O punção é normalmente feita de aço inoxidável e não é transparente. Portanto posicionando o soco em uma localização precisa e consistente pode ser complicado. Além disso, o soco não permite nenhuma correção a ser feita, se houve um erro no posicionamento inicial. Finalmente, a extração de tecido de dentro do soco às vezes pode ser complicado, e há potencial para a perda de tecidos, ou carry-over entre as amostras. Microdissecção do tecido usando um bisturi fino permite ao experimentador um controlo mais preciso e proporciona segurança no que respeita à pureza das amostras.

Durante a extração de RNA e até a síntese de cDNA, o ambiente de trabalho deve ser mantido livre de fontes de contaminantes RNase, e os trabalhos deverão ser realizados utilizando RNase gratuitos ferramentas, materiais descartáveis ​​e reagentes. Nesta fase, a menor contaminação poderia facilmente danificar suado amostras de RNA. Manter as amostras ice frio é essencial para minimizar a actividade neural, que pode modificar a leitura de transcrição, bem como para minimizar a actividade enzimática que pode afectar a integridade da amostra. Inibidores farmacológicos adicionais são por vezes adicionados para reduzir a excitabilidade neuronal, mas, muitas vezes estes não são essenciais.

Após a transcrição reversa em cDNA, a ênfase vira para assegurar a validade dos resultados obtidos a partir da caracterização exaustiva de transcritos. O primeiro passo é o de assegurar que os iniciadores qPCR apropriados são utilizados, para a qual é altamente recomendável para testar a eficiência e especificidade do iniciador em curvas de diluição de uma determinada fonte de RNA. Os iniciadores de PCR óptimas proporcionam amplificação específica e eficaz do alvo. Amplificação específica implica que a amplificação é apenas a sequência do alvo, evidente como um único pico discreto na análise das curvas de fusão, enquanto que a amplificação eficiente implica que, em cada ciclo, a quantidade de sequência alvo éduplicada, com uma eficiência aproxima de 100%. Devido à natureza de alto rendimento dos chips microfluídicos qPCR, esses experimentos requerem um planejamento cuidadoso para garantir a inclusão de um número significativo de controles positivos e negativos. É preferível incluir controlos consistentes em cada corrida de chip, permitindo a comparação directa dos resultados do controlo e às condições experimentais. Durante a instalação do experimento, é crucial para não contaminar poços. Desde pequena quantidade de primers no poço errado pode fazer com que a amplificação do alvo desejado, cuidados extras devem ser tomados ao pipetar primers.

Para a maioria das amostras de tecidos do cérebro é difícil de ser determinado que apenas durante o esvaziamento do tecido de interesse foi extraído, sem contaminação de regiões cerebrais irrelevantes, o que poderia confundir a análise dos resultados. Para este fim, é um controlo importante para a sondagem de genes cuja expressão é que se espera serem excluídos dao tecido de interesse. Uma ferramenta útil para a identificação de padrões espaciais de expressão gênica é o Atlas Cerebral Allen ( http://www.brain-map.org/ ).

Enquanto uma discussão aprofundada de análise de dados está fora do escopo desta publicação, deve-se notar que garante experimentação cuidadosa análise cuidadosa. É importante assegurar que um número de genes de referência relevantes estão incluídos em cada ronda de qPCR. Estes genes irão servir para normalização, a fim de assegurar que as quantidades semelhantes de ARN estão a ser ensaiadas. A normalização é realizada pela primeira vez para os genes de referência dentro da amostra, e, em seguida, para os ratinhos de referência para o experimento ("tempo 0"), a aplicação do "método ΔΔCt".

O protocolo descrito neste manuscrito tem como objetivo estudar a dinâmica de transcrição seguinte experiência cocaína no núcleo accumbens de camundongos. No entanto, é muito facilmente adapted para o estudo de qualquer outra experiência do rato, enquanto os controlos apropriados são aplicadas, e o momento da experiência é bem definida. Obviamente, este protocolo também poderia ser implementado para o estudo da dinâmica da transcrição em tecidos fora do sistema nervoso também.

Deve-se ressaltar que o perfil transcricional abrangente utilizando qPCR baseado em microfluídica é um método econômico de perfilar eventos de transcrição, mas depende do conhecimento prévio dos genes-alvo de interesse. Estes são normalmente obtidos através de métodos de criação de perfil imparciais, tais como microarrays e sequenciamento profundo. Portanto, no fluxo de trabalho de um grande projecto, abrangente perfis qPCR poderia proporcionar o volume de dados, mas, preferencialmente, deve seguir uma caracterização imparcial prévia do sistema.

Também vale a pena afirmar que o processo aqui descrito para a obtenção de amostras de tecido pode também ser implementada em relação aos estudosing uma variedade de outros eventos celulares - proteômica e modificações de proteínas, metabolômica, lipidomics e marcas epigenéticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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References

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