Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

La codificación de las experiencias en el cerebro y la consolidación de la memoria a largo plazo dependen de la transcripción de genes. La identificación de la función de genes específicos en la experiencia de codificación es uno de los principales objetivos de la neurociencia molecular. Por otra parte, la asociación funcional de genes definidos con conductas específicas tiene implicaciones para la comprensión de la base de los trastornos neuropsiquiátricos. Inducción de programas de transcripción robustos se ha observado en los cerebros de los ratones después de varias manipulaciones de comportamiento. Mientras que algunos elementos genéticos se utilizan recurrentemente siguiendo diferentes manipulaciones de comportamiento y en diferentes núcleos cerebrales, los programas transcripcionales son en general única a los estímulos que inducen la estructura y en el que se estudiaron 1,2.

En esta publicación, se describe un protocolo para sólida y completa el perfil transcripcional de los núcleos cerebrales de ratones en respuesta a la manipulación del comportamiento. Elprotocolo se demuestra en el contexto del análisis de la dinámica de la expresión de genes en el núcleo accumbens siguiente experiencia aguda de cocaína. Con posterioridad a un definido en la experiencia vivo, el tejido neural objetivo se diseca; seguido por la purificación del ARN, transcripción inversa y la utilización de matrices de microfluidos para el análisis de qPCR integral de múltiples genes diana. Este protocolo está orientado a análisis exhaustivo (direccionamiento 50-500 genes) de limitar las cantidades de material de partida, tales como muestras de cerebro pequeñas o incluso células individuales.

El protocolo es más ventajosa para el análisis paralelo de múltiples muestras (por ejemplo, células individuales, análisis dinámico siguiente farmacéutica, viral o perturbaciones de comportamiento). Sin embargo, el protocolo también podría servir para la caracterización y control de calidad de las muestras antes de los estudios de todo el genoma de microarrays o RNAseq, así como la validación de los datos obtenidos a partir de estudios de todo el genoma.

Introduction

Organización dinámica del cerebro permite la flexibilidad cognitiva y conductual. Experiencias se codifican a través de modificaciones de la estructura y la fuerza de las conexiones entre las neuronas en el cerebro 3. Esta "plasticidad dependiente de la experiencia" es el resultado de la inducción de patrones específicos de expresión genética que proporciona las proteínas necesarias para la modificación de la estructura y la fuerza sináptica 4. La identificación de las redes reguladoras de genes mediar en la formación de recuerdos a largo plazo es un principio central de la neurociencia molecular, con la expectativa de que la identificación de los elementos dominantes de programas transcripcionales proporcionará información sobre los principios fundamentales que regulan la formación de la memoria, así como los objetivos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. Programas transcripcionales se desarrollan en ondas definidas temporalmente-, cada uno de los cuales codifica genes de distinto carácter, que son importantes para el detapas ifferent en la aplicación de los resultados del evento de señalización 1,2. Por tanto, es importante para hacer frente a la dinámica de la transcripción en una escala de tiempo temporal detallada, a fin de identificar el complemento completo de genes inducidos, y obtener una perspectiva de su función potencial de acuerdo con la dinámica de su inducción.

La drogadicción es una forma sólida de experiencia plasticidad dependiente causada por los efectos a largo plazo de las drogas de abuso en los circuitos neuronales en el cerebro 5,6. , La exposición aguda inicial a las drogas puede conducir al desarrollo de la adicción y la transición hacia el uso crónico. La información contextual es un elemento crucial en el desarrollo de la adicción. Señales ambientales fármacos relacionados se asignan gran importancia en la mente de los consumidores de drogas. La información contextual recordando a un adicto a las drogas de la experiencia drogas en el pasado puede inducir la recaída en el deseo de droga, incluso después de largos periodos de abstinencia de la exposición al fármaco 7,8.De ahí el gran reto clínico en la adicción - la propensión de los adictos a la recaída, incluso mucho tiempo después de los síntomas de abstinencia han disminuido 9.

Comportamiento de sensibilización a la cocaína es un modelo simple de la experiencia de cocaína útiles en el estudio de los mecanismos de adicción a las drogas. En este modelo ampliamente estudiado para la sensibilización de larga duración inducida por la exposición crónica a drogas de abuso, los roedores son primero habituaron a inyecciones de solución salina (intraperitoneal, IP) en un nuevo entorno (una cámara de campo abierto en el que se controla su actividad locomotora) ; entonces, que reciben inyecciones diarias de cocaína en las cámaras de campo abierto, mientras que su actividad es monitoreada 10 (Figura 1). Este paradigma de comportamiento típicamente resulta en una sensibilización robusta de comportamiento locomotor (8-12 veces por encima de la actividad de línea de base) 11, que se mantiene durante un período de meses tras el cese de las inyecciones de cocaína, lo que demuestra la formación de un pervhuella de la memoria ASIVE de experiencia de la droga.

Los circuitos neuronales de la recompensa, que participan de forma natural en reforzar las conductas esenciales para el éxito de una especie (por ejemplo, la alimentación, el sexo), es explotado por las drogas de abuso para reforzar los comportamientos asociados con la droga 12,13. Los mecanismos moleculares y celulares por el cual la experiencia de las drogas de abuso se mejora parecen ser similares a los mecanismos que subyacen a la formación de la memoria declarativa o semánticas en otras estructuras cerebrales 14. Por lo tanto, la robustez del modelo de sensibilización de comportamiento hace que sea un sistema de modelo atractivo para estudiar los mecanismos de la plasticidad dependiente de la experiencia.

El núcleo accumbens (NAC) es un integrador central del circuito de recompensa del cerebro, y ha sido ampliamente asociado con el desarrollo de la adicción a 5,6. La formación de la adicción depende de la transcripción de nuevas proteínas en el núcleo accumbens, y robusto enproducción de programas de transcripción claramente estructurados se observa en el NAc siguiente experiencia cocaína 15-19. La respuesta transcripcional aguda de exposición a la cocaína es probable que funcione a múltiples niveles con el fin de adaptarse al fuerte estímulo de inducción y para dirigir la producción de nuevas proteínas que son responsables de los cambios estructurales y electrofisiológicos inducidos por la exposición a la droga 6,19-22.

Con el fin de promover el estudio de los mecanismos moleculares de la plasticidad dependiente de la experiencia en el cerebro, un protocolo se describe para el análisis completo de la dinámica de transcripción en las muestras de tejido cerebral después de la manipulación del comportamiento. El protocolo se ilustra en el contexto de la experiencia de comportamiento estudiados en el laboratorio Citri - la sensibilización de comportamiento a la cocaína, la utilización de matrices dinámicas de microfluidos para el análisis transcripcional. El protocolo descrito obviamente no se limita a estudiar tque el núcleo accumbens en el contexto de la sensibilización de comportamiento, pero podría aplicarse a un gran número de paradigmas de comportamiento y regiones del cerebro. De hecho, este protocolo se podría aplicar a los tejidos del cuerpo fuera del cerebro, y una variedad de experiencias o manipulaciones del organismo estudiado.

El protocolo se divide a grandes rasgos en cuatro pasos. En el primer paso, el animal se somete al paradigma de comportamiento; en la segunda etapa el tejido es microdissected; en la tercera etapa - ARNm se purifica, inverso-transcrito y sondeó, y en la etapa final se analizan los datos.

En el contexto del estudio de la dinámica de la transcripción, el momento preciso y la definición de la experiencia son probablemente los parámetros experimentales más importantes a controlar. Por esta razón, nuestro modelo de comportamiento de elección es el de la sensibilización de comportamiento a la cocaína, un sistema que permite alto nivel de control del experimentador sobre los parámetros de la experience. Paradigmas de comportamiento adicionales que permiten la sincronización exacta y abordan diferentes modelos de experiencia-dependiente de la plasticidad o formación de la memoria están disponibles. Estos modelos incluyen el condicionamiento del miedo 23, enriquecimiento ambiental aguda 24,25, novela objeto de exploración 26 y la experiencia visual después de la cría de oscuridad 27. Aún así, la sensibilización conductual a la cocaína es una manipulación del comportamiento sólido y coherente, creando un rastro de memoria altamente generalizado que dura meses siguientes experiencia cocaína 28.

El cerebro se secciona, seguido por microdisección manual de los núcleo accumbens. Ha sido nuestra experiencia que microdisección manual desde cortes de cerebro preparadas rápidamente proporciona el método más fiable y rápida de extraer el tejido correspondiente al paradigma de comportamiento, y con la experiencia, los límites del tejido hecho evidente y fácilmente reconocido. Alternativamente, rebanadas finas podrían ser prepared, seguido por láser de microdisección de captura. Aunque este método permite altamente definida la delimitación de la zona de interés, es lento (arriesgando así la pérdida de mRNA lábil), tedioso y requiere equipo especializado costoso (un microscopio equipado con una configuración de láser captura). El protocolo definido en este documento también podría ser adaptado para el análisis transcripcional de una sola célula, por aspiración manual de citoplasma de las células identificadas visualmente utilizando pipetas de parche 29. Es importante señalar que el protocolo descrito proporciona un promedio de la población, mientras que es muy probable que en la mayoría de los casos, sólo una subpoblación de las células dentro del tejido son en realidad implicado en la respuesta a la experiencia. Es de interés para el perfil de transcripción de una manera selectiva desde dentro de las poblaciones de células específicas que responden a la experiencia, pero la discusión de estos enfoques está más allá del ámbito actual.

Para la purificación de ARNm, transcripción inversa y qPCR consulta, el tejidose interrumpe al pasarla a través de agujas finas, seguido de la utilización de los kits disponibles en el mercado (para más información, véase el Cuadro 8). La elección es informado por la experiencia con estas metodologías, que aseguran la extracción fiable de ARN de alta calidad y resultados sólidos de las aplicaciones posteriores.

Mientras que el protocolo se describe para alto rendimiento qPCR utilizando matrices dinámicas, las muestras pueden probaron para la expresión génica usando PCR de punto final, de bajo rendimiento qPCR, microarrays de expresión de genes o la secuenciación de profundidad. La preferencia por qPCR de alto rendimiento utilizando matrices dinámicas es debido al hecho de que el ARNm obtenido a partir de núcleos cerebrales después de paradigmas de comportamiento es a menudo de cantidades limitantes. Las matrices dinámicas proporcionan una plataforma que permite el análisis global eficiente de las transcripciones de un gran número de muestras paralelas en un solo experimento. Después de la adquisición inicial del sistema de microfluidos (comúnmente un pu institucionalrchase), los experimentos son relativamente baratos para funcionar. A raíz de este análisis, además de consulta de las muestras se puede realizar utilizando las plataformas más costosas para buscar nuevas transcripciones (por microarrays o RNAseq) con las matrices dinámicas que proporciona una referencia completa para el aseguramiento de la calidad. Finalmente, para el análisis de datos, se utilizan enfoques estándar. Punteros específicos relativos a cuestiones que puedan surgir serán discutidos en el texto del protocolo.

Este protocolo es el más apropiado para los investigadores interesados ​​en una investigación a fondo de su sistema de interés, el estudio de múltiples condiciones y repeticiones. El protocolo también es la más adecuada para los investigadores que ya han perfeccionado en (a través de microarrays o RNAseq experimentos) en un subgrupo de 50 a 500 genes de interés, que están interesados ​​en la consulta de forma repetida.

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Protocol

NOTA: El protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad Hebrea de Jerusalén.

1 Preparación de la solución de ACSF

  1. Preparar la solución de ACSF como se describe en la Tabla 1. Hacer 1 L en ddH 2 O (> 18 mW de pureza), con lo que la osmolaridad a ~ 300 mOsm / L con la adición apropiada de agua o NaCl.

2. Equipo y distribución de la habitación

Los equipos para el monitoreo de la conducta locomotora inducida por la cocaína consiste en cámaras de comportamiento (50 x 45 cm) de cable con una fuente de luz interior, el ventilador y la cámara (o sensores infrarrojos), y equipado con una caja de plexiglás interior (30 x 30 cm) en que los ratones se les permite moverse libremente mientras su locomoción es monitoreado. La prueba de comportamiento se debe realizar entre 1 hora después de las luces a 1 hora antes de las luces, en un ciclo de luz / oscuridad regular. Los animales deben ser entrenados constantemente a la misma hora cada día.

  1. Limpiar las cámaras después de cada ensayo con desinfectante proporcionada por las instalaciones del ratón y / o eliminación del olor de reactivo, con el fin de prevenir el sesgo de referencia olfativa y para asegurar una desinfección adecuada.

IMPORTANTE: Si bien el manejo de los ratones sean tranquilo, tranquilo y cuidado.

3. Preparación de los animales

  1. Casa 5 C57BL6 ratones macho (6-12 semanas de edad; ~ 25-35 g de peso) por jaula, en una habitación con una luz de 12 h / oscuridad ciclo y el acceso libre a comida y agua, de acuerdo con las normas y requisitos de animales local Cuidado orientación y protocolos Comité. Antes de iniciar el experimento, sopesar los ratones y registrar los datos. La cocaína se administra después de acuerdo con el peso de los ratones.
  2. Transferir todas las jaulas que contienen los ratones en el comportamiento piezas 30 min antes de iniciar el primer ensayo.
  3. Habituar a toda lalos ratones utilizados en el experimento para experimentador manipulación, inyecciones y controlar la configuración de la conducta. Esto se logra mediante 3 inyecciones intraperitoneales diarias consecutivas de 250 l de solución salina como se describe a continuación.
  4. Administrar una inyección intraperitoneal de 250 l de solución salina. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón en una cámara de comportamiento para supervisar la actividad locomotora durante 15 min. Repita esta acción durante 3 días consecutivos, a la misma hora cada día.
  5. En el cuarto día, divida a los ratones en dos grupos. Preparar una solución madre de cocaína en 2 mg / ml en solución salina. Administrar una única inyección de solución de cocaína (final de 20 mg / kg) al grupo experimental de acuerdo con el peso del ratón (por ejemplo, para un ratón 25 g - inyectar 250 l, mientras que un ratón 30 g recibirá 300 l). Administrar solución salina al grupo de control. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón durante 20 min en una cámara de comportamiento para el seguimiento de la actividad locomotora (typicaliado, los primeros 15 min se supervisan).
  6. Después de la inyección de cocaína, sacrificar los ratones en diferentes puntos de tiempo (0, 1, 2, 4, 8 y 24 h después de la inyección). Es importante destacar que, asegúrese de que los ratones de referencia (0 punto de tiempo) no recibirán ningún tipo de inyección en el día de hoy. Debido a su importancia, es imperativo incluir repeticiones del grupo de referencia.

4. Disección del núcleo accumbens

  1. Anestesiar a los ratones con isoflurano en el momento apropiado después de la inyección de cocaína / solución salina. El isoflurano se debe ventilar directamente fuera de la habitación. Por lo tanto, el procedimiento se debe realizar en una campana para vapores químicos.
  2. Monitorear la profundidad de la anestesia probando el reflejo del pie trasero. Pellizcar la pata para provocar una respuesta de retirada por el animal. Un animal que muestra un reflejo no está a un nivel quirúrgico de anestesia y no en un estado de eutanasia.
  3. Extracción del cerebro:
    1. La eutanasia el ratón por decapitación.
    2. <li> Retire la piel por encima del centro del cráneo y cortó el cráneo con unas tijeras afiladas.
    3. Insertar las tijeras en el punto donde la médula espinal entra en el cerebro (foramen magnum) y hacer dos cortes laterales.
    4. Desde el mismo punto, hacer un corte sagital de largo a lo largo de la sutura sagital. Al alcanzar el bulbo olfatorio, clip hacia la izquierda y hacia la derecha.
    5. Con unas pinzas, quite cuidadosamente el cráneo, agarrando cada mitad del cráneo con firmeza y tirando hacia un lado, teniendo cuidado de no presionar sobre o dañar el cerebro.
    6. Retire el cerebro, mientras que la ruptura de los nervios craneales utilizando un micro espátula cuchara invertida.
  4. Coloque el cerebro en una solución ACSF helada durante 1-2 minutos para enfriar y endurecer.
  5. Eliminar cerebro desde el ACSF, Wick exceso de líquido con una toalla de papel, crear un corte coronal entre el cerebelo y el resto del cerebro y pegar el cerebro, con la parte rostral hacia arriba, en el escenario vibratome.
  6. Cortar el NAc: Mantener soluciones ACSF a temperaturas heladas en la cámara de corte del vibratome. Sección a 200 micras hasta que el núcleo accumbens (NAC) se identifica claramente de acuerdo con la Paxinos y Franklin cerebro de ratón Atlas (aproximadamente 1,8 mm anterior al bregma; prestar atención a la forma del cuerpo calloso, la ubicación y la forma de la comisura anterior y los ventrículos, así como la morfología general de la sección de cerebro). En este punto, crear dos secciones 400 micras, de las cuales se diseccionó el NAc.
  7. Bajo un estereoscopio, utilice una fina lámina de diseccionar la zona NAc fuera de las rodajas. La definición de la NAC es de acuerdo con el atlas del cerebro del ratón Paxinos y Franklin, y convenientemente puede ser diseccionado en las secciones apropiadas por cuatro pases rápidos de la cuchilla en el tejido. (Figura 2).
  8. Coloque las secciones NAC inmediatamente en 900 l Trizol reactivo de lisis en un tubo de microcentrífuga y almacenar a -80 ° C hasta el ARN extracción.

Transcripción 5. Extracción de ARN y ADNc inversa

  1. Descongelar los tubos que contienen núcleo accumbens secciones en Trizol reactivo de lisis a temperatura ambiente y homogeneizar el lisado con una jeringa de 1 ml conectada a la aguja 25 G hasta que el tejido es totalmente homogeneizada (por lo menos 15-20 veces). Las primeras rondas son difíciles, y requieren empujar el tejido contra la pared del tubo con el fin de romper en pedazos pequeños que podrían entrar en la punta de la aguja.
  2. Para asegurar la homogeneización, pipetear el lisado en una columna de centrifugación QIAshredder Mini y centrifugar a 12.000 xg durante 1 min.
  3. Pipetear el lisado en un nuevo tubo de microcentrífuga y extraer el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Guarde el ARN a -80 ° C hasta su uso.
  4. Medir la concentración de ARN, analizar la integridad y la calidad mediante un Bioanalyzer o equipo equivalente. Utilice 100-500 ng de ARN para cada ronda de preparación de ADNc con rcebadores hexámeros Andom.

6. Diseño Primer y Pruebas Primer

  1. Elegir buenos cebadores: Para un par de cebadores óptimo para qPCR de transcripciones de ARNm, siga estos requerimientos (Figura 3):
    1. Cebadores de diseño ya no contienen de 17-28 bases. Evitar repeticiones de nucleótidos ya que promueven mispriming.
    2. Cebadores de diseño con la temperatura de fusión (T m) entre 56-68 ° C (óptima 60-64 ° C). El T m dentro de la pareja de cebadores debe estar dentro de 1 ° C de la otra.
    3. Tenga en cuenta que el tamaño del producto debe ser idealmente entre 80 y 150 pb.
    4. Asegúrese de que al menos uno de los cebadores cubre una unión exón-exón, o el amplicón contiene un gran intrón (intrón-que abarca), para evitar la amplificación de contaminantes de ADN genómico.
    5. Utilice un software fiable basado en Primer3 (para ejemplos véase el cuadro 2) con el fin de mejorar el diseño del cebador.
  2. Prueba de la prIMers: A fin de garantizar la especificidad y la eficiencia de los cebadores, una reacción de qPCR de control deben realizarse:
    1. Utilice una muestra positiva (que contiene cDNA plantilla para todos los pares de cebadores correspondientes) y valorar el ADNc (por ejemplo, ocho diluciones de tres veces a partir de una concentración inicial de ~ 10 ng) en reacciones paralelas duplicados. Incluir un control sin plantilla, que controla la contaminación dentro de las soluciones utilizadas para la reacción.
    2. Calcular la eficiencia de imprimación mediante el uso de la fórmula: (10 (- 1 / pendiente) -1) × 100, de tal manera que la curva de la pendiente óptima es - 3.333 (es decir, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4).
    3. Determinar la especificidad de la amplificación. Amplificación específica se demuestra por un único pico prominente común a todas las curvas de fusión de los productos amplificados, mientras que fuera del objetivo de amplificación aparecería como una desviación obvia from el pico individual grande.

7. análisis qPCR

  1. Pre-amplificación:
    1. Análisis completo qPCR se basa en paralelo de consulta de limitar cantidades de ARN con un gran número de pares de cebadores. Por lo tanto, una etapa de pre-amplificación es esencial. En este paso, el ADNc se somete a 14-18 ciclos de pre-amplificación con una mezcla de todos los cebadores que se utilizarán para la consulta de la muestra en el futuro (hasta 800 pares de cebadores).
    2. Diluir todos los cebadores en TE (bajo EDTA) a 50 m para Target Amplificación Específica (STA).
    3. Piscina junto 1 ml de alícuotas de todo el primario 50 M establece para ser incluidos en la reacción de STA, de hasta 800 ensayos.
    4. Preparar pre-mezcla y muestras para STA como se describe en la Tabla 3. Permitir para el error mediante la preparación de la mezcla para el 110% del número de muestras que deben ser amplificado.
    5. Alícuota de 3,75 l STA pre-mezcla para cada muestra. Añadir 1,25 lde cDNA a cada uno.
    6. Vortex para mezclar las reacciones y centrifugar durante 10 seg.
    7. Colocar las reacciones STA en un ciclador térmico y el ciclo como se indica en la Tabla 4.
  2. Exonucleasa I (ExoI) de tratamiento:
    1. Diluir la Exo I como se indica en la Tabla 5.
    2. Añadir 2 l de ExoI diluido (4 U / l) a cada reacción STA 5 l, vórtice, girar hacia abajo (> 6.000 xg), y meterlo en un termociclador a 37 ° C durante 30 min y luego a 80 ° C durante 15 min.
    3. Diluir los productos finales a una concentración apropiada para la prueba. Uso TE Buffer (añadir 43 l de tampón TE a la muestra TSA 7 l).
    4. Almacene los productos STA diluidas a -20 ° C o utilizar de inmediato.
  3. Primer y configuración de ejemplo para qPCR:
    1. Preparar muestras como se muestra en la Tabla 6. Preparar la mezcla de acuerdo con el chip elegido para el experimento, y añadir muestras según sea apropiado.
    2. Agilitar las soluciones Mezclar la muestra durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (> 6.000 xg) durante al menos 30 seg. Reacciones preparados pueden almacenarse durante duraciones cortas a 4 ° C hasta que el chip está listo para la carga.
    3. Preparar los ensayos tal como se describe en la Tabla 7.
    4. Agite la mezcla de ensayo durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (> 6.000 xg) durante al menos 30 segundos de girar todos los componentes.
      IMPORTANTE: Vortex y centrifugar a fondo todas las soluciones de muestras y ensayos antes de pipetear en las entradas de chips. El no hacerlo puede dar lugar a una disminución de la calidad de los datos.
      NOTA: La concentración final de cada cebador es 5 M en la entrada y 500 nM en la reacción final.
  4. Cebado y carga de la matriz dinámica IFC (circuito de fluido integrado) chip. El chip IFC tiene entradas para muestras y ensayos, así como entradas especificadas (acumuladores) para fluido de la línea de control (aceite mineral) que se utiliza para presurizar las cámaras de microfluidos (Figure 4A).
    1. Inyectar fluido línea de control en cada acumulador en el chip.
    2. Retire y deseche la película protectora azul de la parte inferior de la ficha.
    3. Coloque el chip en el controlador apropiado IFC (controlador MX para el 48,48 IFC matriz dinámica o la HX controlador de la CFI para la 96.96 matriz dinámica IFC), a continuación, ejecute la secuencia de comandos Prime (113x) para el 48,48 IFC matriz dinámica o el Prime (136x) guión de la 96.96 matriz dinámica IFC con el fin de preparar el chip.
    4. Cuando el script haya finalizado, retire el chip imprimada desde el controlador de la CFI.
    5. Pipetear 5 l de cada mezcla de ensayo y 5 l de cada Sample Mix en sus entradas.
    6. Devuelva el chip para el controlador de la CFI.
    7. Utilizando el software de controlador de la CFI, ejecutar la carga Mix (113x) guión para el 48,48 matriz dinámica IFC) o Cargar Mix (136x) guión para el 96.96 matriz dinámica IFC para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando el guión Mix carga ha terminado, quite la cargachip de ed desde el controlador de la CFI.
    8. Cargue el chip en el termociclador, crear una nueva ejecución de chip (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), incluyendo análisis de la curva de fusión. Usando el software termociclador, asegúrese de que las cámaras de reacción se reconocen correctamente, y permiten que la reacción se ejecute por completo.

Análisis de datos 8.

  1. Aseguramiento de la calidad: Con el fin de garantizar la calidad de los datos, verificar la calidad de los cebadores al abordar curvas de dilución (como se describió anteriormente). Monitor de la especificidad de la amplificación mediante la visualización de las curvas de fusión de los amplificados, los picos de los cuales deben estar bien alineados de forma óptima 29.
  2. Visualización: Para la visualización de grandes cantidades de datos obtenidos por el alto rendimiento de qPCR, el uso de software generó mapas de calor, en el que la expresión es un código de color por intensidad. Además, mostrar la dinámica de la transcripción de los genes individuales como diagramas de dispersión alineados.
  3. Publicación: En la publicaciónlos resultados de la expresión génica, se aconseja seguir las Directrices para la publicación de MIQE cuantitativos en tiempo real información experimentos de PCR, que detalla la información mínima que debe ser informada para un experimento de qPCR para asegurar su pertinencia, precisión, interpretación correcta, y la reproducibilidad.

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Representative Results

La calidad de los resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo depende de manera crucial de una serie de parámetros. Planificación experimental adecuado resultará en una mínima perturbación a los ratones experimentales, de tal manera que la experiencia probada (en este ejemplo, el de la exposición a la cocaína) será la experiencia más dominante en su historia reciente, y por lo tanto resultará en una transcripción robusta y específica programa. Figura 1 describe el plan experimental para la sensibilización de comportamiento a la cocaína, la definición de los puntos de tiempo tras la experiencia de la cocaína en la que el núcleo accumbens de los ratones se diseca y se analizaron. El siguiente punto crucial es el de definir los límites precisos para la escisión del tejido adecuado para el análisis. La Figura 2 describe los límites de las núcleo accumbens en las secciones coronal y sagital. Preferiblemente, la disección se debe realizar de tal manera que un margen delgada de tejido NAc se excluye de la región takes para el perfilado. Esto asegura perfiles consistentes sólo del NAc, reducir la variabilidad y el potencial de artefactos resultantes de la inclusión de los tejidos circundantes.

Cuando la amplificación de cantidades limitantes de ARN, como en la disección de pequeños núcleos cerebrales, muchos ciclos de amplificación son necesarios para la detección apropiada de la señal. Por lo tanto, un punto crucial en cualquier experimento de PCR cuantitativa, se amplifica aún más cuando se trabaja con pequeñas cantidades de material de partida, es la caracterización de los cebadores utilizados para la amplificación. Figura 3 describe las características clave en la definición de cebadores óptimos, y la Figura 4 demuestra las curvas de amplificación de cebadores dirigidos contra c-Fos y FosB, lo que demuestra que estos pares de cebadores amplifican su objetivo transcripción con eficiencia ~ 100% en cada ciclo. Tras la validación de imprimación y establecimiento del paradigma experimental adecuado para permitir la evaluación clara de la transcripción de los tiss objetivoue, análisis completo se puede realizar en la plataforma Fluidigm Biomark, que permite hasta 9.216 reacciones paralelas (qPCR en el formato 96,96; Figura 5). Esta plataforma de alto rendimiento permite el análisis en paralelo de múltiples repeticiones experimentales, utilizando condiciones experimentales idénticas en un solo chip. Los datos para las repeticiones experimentales cuádruples, abordando la inducción transcripcional de c-Fos y FosB siguiente experiencia aguda de cocaína, se demuestran en la Figura 6.

Figura 1
Figura 1. paradigma experimental para el análisis transcripcional dinámica siguiente experiencia cocaína. (A) Protocolo experimental - ratones se habitúan a la manipulación y la inyección durante 3 días, mientras que el seguimiento de la actividad locomotora por seguimiento de vídeo en una cámara de comportamiento de atenuación de sonido. Ratonesse someterán a la experiencia de la cocaína; una sola exposición = experiencia aguda de cocaína; 5 inyecciones consecutivas se denominan exposición crónica. Una sola inyección siguiente ≥16 días de abstinencia de la cocaína que se denomina un reto cocaína. Dinámica de la transcripción se abordan en diferentes puntos temporales experimentales siguientes experiencia de la cocaína (1, 2, 4, 8, 24 h). (B) Parcela de la pista del ratón dentro de la cámara comportamiento siguiente de 3 días de inyección de solución salina o de solución salina 3 días + a la exposición aguda de cocaína sola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 Ubicación del núcleo accumbens en el cerebro del ratón. Líneas blancas gruesas marcan la ubicación de los cortes que define la b oundaries del NAc (A) Corte coronal;. (B) Corte sagital. (Fotos adaptado del Atlas Atlas Referencia Allen Cerebro Imágenes:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100 883 869 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. cebadores Planificación qPCR. Directrices para la planificación de cebadores qPCR, con las definiciones de especificidad, estabilidad y compatibilidad. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Evaluación de la eficiencia de imprimación. (A) Los resultados de las curvas de amplificación de Fos y FosB utilizando conjuntos Fluidigm CFI. Una curva estándar fue generado utilizando siete diluciones en serie 3 veces de ARN total extraído de ratón NAc y probaron para la expresión de Fos y FosB. (B) La eficiencia de la pareja de cebadores para Fos y FosB se evaluó mediante el trazado el valor de ciclo umbral ( Ct) en cada dilución frente al logaritmo de la dilución pliegue de la muestra. La eficiencia de los cebadores se calcula a partir de la pendiente de la curva estándar, tal como se define en el texto. Las curvas de amplificación y puntos en la curva de dilución son de color a juego.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Integral de qPCR de perfiles de la aplicación de la plataforma de Fluidigm. (A) 96,96 matriz dinámica IFC para Real-Time PCR cuantitativa. Los cebadores son cargados en las entradas situadas en el lado derecho, y las muestras se cargan en las entradas situadas en el lado izquierdo de la viruta. Esta cifra ha sido modificada con permiso del Manual del usuario de Fluidigm Tiempo real Análisis PCR. Mapa (B) El calor de los resultados qPCR, que representa los valores de Ct para cada bien en el chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. resultados de la muestra de la dinámica de expresión después de una exposición aguda de cocaína. La expresión inducida por cocaína de c-Fos y FosB se muestran como una función del tiempo. Promedios de repeticiones experimentales cuádruples, realizado de acuerdo con el protocolo definido en el presente documento, se muestran, junto con barras de error que retratan error estándar de la media.

Reactivo MW mM g / L
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58.44 119 6.95
De NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
La glucosa (Sigma-Aldrich, G8270) 180.16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d> 74.55 2.5 0.186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137.99 1 0.138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246.5 4 0.99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0.59

Tabla 1. solución ACSF.

Nombre del programa Aplicación ubicación web
Roche Probefinder diseño de cebadores http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI imprimación-blast diseño de cebadores http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Cuadro 2 Lista de software.

Reactivo Volumen / Reacción (l) Volumen por 48 Reacciones + 10% por exceso (mu l) Volumen para 96 ​​Reacciones + 10% por exceso (mu l)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 nM (10X) mezcla de imprimación agrupado 1 52.8 105.6
Agua 0.25 13.2 26.4
cDNA 1.25
Volumen Total 5

Tabla 3. solución de reacción STA.

Condición Sostenga 10-14 Ciclos Sostenga
Temperatura 95 º C 95 º C 60 º C 4 º C
Tiempo 10 min 15 seg 4 min

Cuadro 4 condiciones del ciclo térmico para pre-amplificación.

componente Per 5 l de la muestra (l) 48 muestras con exceso de uso (l) 96 muestras con exceso de uso (l)
Agua 1.4 84 168
Reaction Buffer exonucleasa I 0,2 12 24
Exonucleasa I a 20 unidades / l 0.4 24 48 </ Td>
Volumen Total 2.0 120 240

Tabla 5. solución de reacción ExoI.

</ Tr>
MIX DE MUESTRA Componente Volumen por entrada (l) Volumen por entrada con exceso de uso (l) Volumen de 48.48 matriz dinámica IFC (l) (120 muestras) Volumen de 96.96 matriz dinámica IFC (l) (120 muestras)
2X SsoFast EvaGreen Supermix con Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X ADN vinculante tinte carga de muestras de reactivos (Fluidigm, PN 100 y 3738) gorra verde 0.25 0.3 18 36
Muestra STA y ExoI tratada 2.25 2.7
Total 5 6

Cuadro 6 Muestra solución Pre-Mix.

Tabla 7. solución de mezcla de ensayo.

Componente Volumen por entrada (l) Volumen por entrada con exceso de uso (l) Volumen de 48.48 matriz dinámica IFC (l) Volumen de 96.96 matriz dinámica IFC (l)
2X Ensayo Cargando Reactivo 2.5 3 180 360
Suspensión de ADN 1X Buffer (TE bajo EDTA) 2 2.4 144 288
50 M cada mixta adelante y atrás primers 0,5 0,6
Volumen Total 5 6
Nombre del reactivo / Materiales Empresa Número de catálogo
Virusol Oriek Médico J29D
El isoflurano, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy más universal Mini Kit Qiagene 73404
QIAshredder Qiagene 79654
Alta Capacidad cDNA kit de transcripción reversa Invitrogene AB-4368814
Buffer TE Invitrogene 1355656

Cuadro 8 Lista de productos químicos / reactivos.

Nombre de Equipo Empresa Número de catálogo
Comportamiento Cámara (MDF; 50 x 45 cm) Auto ensamblado
Caja de Perspex interior (30 x 30 cm) Auto ensamblado
Cámara y grabadora Campden Inst CMD-80051
Software Media Recorder Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Tijeras FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies El Agilent 2100 Bioanalyzer
Termociclador Bio-Rad 1852048
Espátula microspun invertidos Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD ReAder Fluidigm BMHD-BMKHD
Chip de matriz dinámica para la expresión de genes 96.96 Fluidigm BMK-M-96.96

Cuadro 9 Equipamiento.

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Discussion

Caracterización acertada de la expresión génica a partir de tejido cerebral después de paradigmas de comportamiento depende de: 1) El manejo cuidadoso de los ratones durante el paradigma de comportamiento; 2) la disección rápida y precisa de tejido de interés; 3) medidas de ARN de seguridad para garantizar la integridad de ARN; y 4) La planificación cuidadosa de los cebadores y el diseño experimental, así como la precisión y la atención al detalle en la preparación para el análisis qPCR.

El objetivo del procedimiento descrito es caracterizar dinámica de los acontecimientos transcripcionales inducidos por una experiencia de comportamiento; por lo tanto, es necesario para la atención cuidadosa para asegurar que el paradigma de comportamiento experimentado por el ratón de hecho representa la experiencia pretendido por el investigador. Por ejemplo, incluso en un paradigma tan simple como la sensibilización conductual a la cocaína, la experiencia del ratón puede estar influenciado por muchos factores de confusión: la experiencia previa del ratón en la casa-jaula antes de la experiment; el método de transferencia a la sala experimental; la luz, el sonido y el olor de la exposición en la sala experimental; la experiencia de manejar por el experimentador; el dolor / malestar causado por la inyección IP; la exposición a un nuevo experimento, y la experiencia siguiente el comportamiento especificado hasta el punto de la eutanasia. Cada una de estas experiencias pueden, de forma aislada, promover la inducción de programas transcripcionales en diversas regiones del cerebro del ratón. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurar que el programa transcripcional mide el paradigma deseada, y no epifenómenos asociado con el paradigma. En el caso de la experiencia de cocaína, esto se logra fácilmente mediante experimentación cuidadosa y atención al detalle, así como un simple experimento de control, en la que todos los parámetros se mantuvieron constantes, pero vehículo (solución salina) se inyecta al ratón en lugar de la cocaína. En nuestra experiencia, la inyección de solución salina induce un programa transcripcional de escala muy limitada en comparación conexposición a la cocaína, lo que demuestra que el paradigma permite abrumadoramente investigación de los fenómenos de interés.

Especial cuidado se debe tomar para limitar el rango de experiencias del ratón mientras todavía está activa, lo que exige un manejo tranquilo y cuidadoso de los ratones. En contraste, después de la anestesia, el trabajo rápido y preciso es esencial debido a la posibilidad de cambios rápidos en la representación de ARN (en la escala de tiempo de minutos) y la labilidad intrínseca de ARN, que puede ser degradado rápidamente una vez que se interrumpen las células, potencialmente interrumpir el perfil transcripcional inducida por la experiencia. Por tanto, es importante quitar el cerebro del cráneo rápidamente a un entorno frío (a menos de 1-2 minutos) y rápidamente diseccionar el NAc en condiciones heladas. Una vez que el cerebro ha estado refrigerada, el potencial de los cambios transcripcionales o la degradación del ARN se redujo significativamente, pero sólo cuando las secciones pertinentes se colocan en el reactivo Trizol y congelado, is la integridad del tejido y la representación del perfil transcripcional garantizada.

En este contexto, vale la pena mencionar que la dinámica de la transcripción de la expresión del gen temprano inmediato se produce en una escala de tiempo rápida, a menudo alcanzando un máximo antes de 1 h después de la estimulación. En el contexto del paradigma experimental descrito, el interrogatorio de la dinámica de la transcripción se limita a la escala de horas con el fin de reducir la variabilidad entre las muestras. Para tiempos más cortos que 1 hr, pequeñas variaciones en el tiempo pueden resultar en gran variación en la magnitud de los cambios observados transcripcional. Por lo tanto el punto de tiempo de 1 hora ha sido elegido para el análisis, ya que este punto de tiempo es más fácil de realizar experimentalmente con precisión, y es menos susceptible a la variación en el nivel de una diferencia de pocos minutos en el experimento.

Tradicionalmente, un micropunch tejido ha sido utilizado por muchos laboratorios para la disección de muestras de tejido. Hayson una serie de razones para preferir microdisección manual de la tejido. El punzón se hace normalmente de acero inoxidable y no es transparente. Por lo tanto el posicionamiento del golpe en una ubicación precisa y consistente puede ser complicado. Por otra parte, el punzón no permite ninguna corrección que debe hacerse si hubo un error en el posicionamiento inicial. Por último, la extracción de tejido desde dentro del punzón a veces puede resultar difícil, y existe la posibilidad de perder tejido, o el traspaso entre las muestras. Microdisección del tejido utilizando un bisturí fino permite al experimentador control más preciso y proporciona seguridad en cuanto a la pureza de las muestras.

Durante la extracción de RNA y hasta la síntesis de ADNc, el entorno de trabajo debe mantenerse libre de fuentes de contaminantes RNasa, y el trabajo debe realizarse con RNasa herramientas gratuitas, desechables y reactivos. En esta etapa, la contaminación más pequeño podría fácilmente corruptos duramente ganado-muestras de ARN. Mantener las muestras ice frío es crucial para minimizar la actividad neural que podrían modificar la lectura de la transcripción, así como para minimizar la actividad enzimática que pudiera afectar la integridad de la muestra. Inhibidores farmacológicos adicionales se agregan a veces para reducir la excitabilidad neuronal, pero a menudo éstas no son esenciales.

Después de transcripción inversa a cDNA, el énfasis se vuelve a asegurar la validez de los resultados obtenidos a partir de la integral de perfiles de transcritos. El primer paso es asegurarse de que se utilizan cebadores qPCR apropiadas, para lo cual es muy recomendable para probar la eficiencia de imprimación y especificidad en las curvas de dilución de una fuente definida de ARN. Cebadores de PCR óptimos proporcionan amplificación específica y eficiente de la diana. Amplificación específica implica que la amplificación es sólo de la secuencia diana, evidente como un solo pico discreto en el análisis de curva de fusión, mientras que una amplificación eficaz implica que en cada ciclo, la cantidad de la secuencia diana esduplicado, con una eficiencia se aproxima a 100%. Debido a la naturaleza de alto rendimiento de los chips de microfluidos qPCR, estos experimentos requieren una planificación cuidadosa para garantizar la inclusión de un número significativo de controles positivos y negativos. Es preferible incluir controles consistentes en cada carrera de chip, lo que permite la comparación directa de los resultados de control y las condiciones experimentales. Durante la instalación del experimento, es crucial no cruzar-contaminar pozos. Desde pequeña cantidad de cebadores en el pozo equivocado podría causar la amplificación del objetivo deseado, mucho cuidado debe ser tomado al pipetear cebadores.

Para la mayoría de muestras de tejido del cerebro es difícil estar seguro de que durante la disección se extrajo sólo el tejido de interés, sin contaminación de regiones cerebrales irrelevantes, lo que podría confundir el análisis de los resultados. Para este fin, un control importante está investigando para genes cuya expresión se espera ser excluido deel tejido de interés. Una herramienta útil para la identificación de los patrones espaciales de la expresión génica es el Allen Atlas Cerebral ( http://www.brain-map.org/ ).

Mientras que una discusión detallada de análisis de datos está más allá del alcance de esta publicación, cabe señalar que la experimentación cuidadosa garantiza un análisis cuidadoso. Es importante asegurarse de que un número de genes de referencia pertinentes están incluidos en cada ronda de qPCR. Estos genes servirán para la normalización con el fin de garantizar que se ensayaron cantidades similares de ARN. La normalización se realizó por primera vez a los genes de referencia dentro de la muestra, y luego a los ratones para el experimento de referencia ("tiempo 0"), aplicando el "método ΔΔCt".

El protocolo se describe en este manuscrito tiene como objetivo el estudio de la dinámica de la transcripción siguiente experiencia de cocaína en el núcleo accumbens de ratones. Sin embargo, es muy fácilmente Adapted para el estudio de cualquier otra experiencia del ratón, siempre y cuando se apliquen los controles adecuados, y el momento de la experiencia está bien definido. Obviamente, este protocolo también podría aplicarse para el estudio de la dinámica de la transcripción en los tejidos fuera del sistema nervioso también.

Cabe destacar que el perfil transcripcional completa utilizando qPCR basado microfluidos-es un método rentable de perfiles de eventos transcripcionales, pero depende del conocimiento previo de los genes diana de interés. Estos normalmente se obtienen a través de métodos de perfiles imparciales, como los microarrays y secuenciación profunda. Por lo tanto, en el flujo de trabajo de un proyecto grande, amplia de perfiles de qPCR podría proporcionar la mayor parte de los datos, pero preferentemente debe seguir una caracterización previa imparcial del sistema.

También vale la pena que indica que el proceso descrito en el presente documento para la obtención de muestras de tejido también se podría implementar hacia el estudioing una variedad de otros eventos celulares - proteómica y modificaciones de las proteínas, la metabolómica, lipidomics y marcas epigenéticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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References

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