Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

Die Codierung von Erfahrungen im Gehirn und der Konsolidierung von Langzeiterinnerungen hängen von Gen-Transkription. Identifikation der Funktion bestimmter Gene bei der Codierung Erfahrung ist eines der Hauptziele der molekularen Neurowissenschaften. Darüber hinaus ist die funktionale Vereinigung von definierten Genen, die mit spezifischen Verhaltensweisen hat Folgen für das Verständnis der Grundlage der neuropsychiatrischen Störungen. Induktion der Transkription robust Programmen im Gehirn von Mäusen nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen beobachtet. Während einige genetische Elemente sind immer wieder nach verschiedenen Verhaltens Manipulationen und in verschiedenen Hirnkerne verwendet werden, sind Transkriptionsprogramme Gesamt einzigartig für die induzierende Stimuli und der Struktur, in der sie untersucht 1,2.

In dieser Veröffentlichung wird ein Protokoll für die robuste und umfassende Transkriptionsprofilierung aus Hirnkerne von Mäusen in Reaktion auf die Verhaltensmanipulation beschrieben. DieProtokoll im Rahmen der Analyse der Genexpression Dynamik im Nucleus accumbens nach akuter Kokain Erfahrung gezeigt. Im Anschluss an eine In-vivo-Erfahrung definiert, die Ziel neuronalen Gewebe seziert; gefolgt von RNA-Reinigung, reverse Transkription und Nutzung von mikrofluidischen Arrays für umfassende qPCR Analyse von mehreren Zielgenen. Dieses Protokoll wird zur umfassenden Analyse (Adressierung 50-500 Gene) zu begrenzen Mengen des Ausgangsmaterials, wie kleine Gehirnproben oder sogar einzelne Zellen ausgerichtet.

Das Protokoll ist für die parallele Analyse von mehreren Proben (zB Einzelzellen, dynamische Analyse folgenden pharmazeutischen, virale oder Verhaltensstörungen) am vorteilhaftesten. Doch das Protokoll könnte auch für die Charakterisierung und Qualitätssicherung der Proben vor der gesamten Genoms Studien dienen durch Microarrays oder RNAseq, sowie die Validierung von Daten aus Gesamtgenom-Studien.

Introduction

Dynamische Organisation des Gehirns ermöglicht kognitive und Verhaltensflexibilität. Erfahrungen werden durch Modifikationen der Struktur und Festigkeit der Verbindungen zwischen Neuronen im Gehirn 3 kodiert. Diese "Erfahrung abhängige Plastizität" ist das Ergebnis der Induktion von spezifischen Mustern der Genexpression, die die notwendigen Proteine ​​enthält zur Modifikation der synaptischen Struktur und Festigkeit 4. Die Identifikation von Gen-regulatorischen Netzwerke der Vermittlung der Bildung von Langzeiterinnerungen ist ein zentraler Grundsatz der molekularen Neurowissenschaften, mit der Erwartung, dass die Identifizierung der dominierenden Elemente der Transkriptionsprogramme Einblick in die Grundprinzipien der Regulierung der Gedächtnisbildung sowie Ziele für bieten Behandlung von neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Störungen. Transkriptionsprogramme entfalten in zeitlich definierten Wellen, die jeweils Gene kodieren unterschiedlichen Charakters, die für different Stufen der Umsetzung der Ergebnisse des Signalisierungsereignis 1,2. Es ist daher wichtig, Transkriptions Dynamik auf einer detaillierten Zeitskala anzugehen, um so das volle Komplement von Genen induziert identifizieren, und einen Einblick in die Potentialfunktion entsprechend der Dynamik der Induktion.

Drogenabhängigkeit ist eine robuste Form der Erfahrung abhängige Plastizität durch die lang anhaltende Wirkung von Drogen auf neuronale Schaltkreise im Gehirn verursacht 5,6. Initial, akute Exposition gegenüber Drogen, kann zur Entwicklung von Sucht und den Übergang zur chronischen Anwendung führen. Kontextinformationen ist ein wesentliches Element in der Entwicklung von Sucht. Drug-assoziierte Umweltreize sind von großer Bedeutung in den Köpfen der Drogenabhängigen zugeordnet. Kontextinformationen erinnert einen Drogenmissbrauch in der Vergangenheit Drogenerfahrung kann Rückfall in Drogenverlangen auslösen, auch nach längerer Abstinenz von Arzneimittelexposition 7,8.Daher die große Herausforderung in der klinischen Sucht - die Neigung zu Rückfällen von Süchtigen auch lange nach Entzugserscheinungen haben 9 nachgelassen.

Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein einfaches Modell von Kokain Erfahrung bei der Untersuchung von Mechanismen der Drogenabhängigkeit. In dieser weit untersuchten Modell für die langfristige Sensibilisierung durch chronische Exposition gegenüber Drogen induziert werden Nagetiere erste Kochsalzinjektionen (intraperitoneale; IP) gewöhnt in einer neuen Umgebung (einem offenen Feld Kammer, in der ihre Bewegungsaktivität wird überwacht) ; dann, tägliche Injektionen von Kokain erhalten sie in den offenen Bereich Kammern während ihrer Tätigkeit überwacht 10 (Abbildung 1). Diese Verhaltens Paradigma führt typischerweise zu einem robusten Sensibilisierung der Bewegungsverhalten (8-12 fach über Grundaktivität) 11, die für einen Zeitraum von Monaten nach Beendigung der Kokain-Injektionen erhalten bleibt, was die Bildung einer PERVasive Speicher Spur von Drogenerfahrung.

Die neuronalen Schaltkreise der Belohnung, natürlich bei der Verstärkung Verhalten wesentlich für den Erfolg einer Spezies (zB Fütterung, Geschlecht) beteiligt sind, wird von Drogenmissbrauch Drogen-assoziierten Verhaltensweisen verstärken 12,13 ausgebeutet. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Erfahrung von Drogen verbessert scheinen ähnlich zu den Mechanismen der Bildung von deklarativen oder semantische Speicher in anderen Gehirnstrukturen 14 zugrunde, sein. Daher ist die Robustheit des Verhaltenssensibilisierung Modell macht es zu einem attraktiven Modellsystem, um Mechanismen der erfahrungsabhängigen Plastizität zu studieren.

Die Nucleus accumbens (NAC) ist eine zentrale Integrator des Gehirns Lohn-Schaltung, und wurde ausgiebig mit der Entwicklung von Sucht 5,6 verbunden. Die Bildung von Sucht hängt Transkription neuer Proteine ​​in dem Nucleus accumbens und robustProduktion von klar strukturierten Transkription Programme ist in der folgenden NAc Kokain Erfahrung 15-19 beobachtet. Die akute Reaktion auf Kokain Transkriptions Gefahr besteht, dass auf mehreren Ebenen, um der starken Induktionsreiz anzupassen und die Produktion neuer Proteine ​​lenken Funktion, die sind für die strukturelle und elektrophysiologische Veränderungen durch die Einwirkung der Droge 6,19-22 induzierte verantwortlich.

Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen der erfahrungsabhängige Plastizität im Gehirn zu fördern, ist ein Protokoll für die umfassende Analyse der Transkription Dynamik der Hirngewebeproben folgenden Verhaltensmanipulation beschrieben. Das Protokoll wird im Rahmen des Verhaltens Erfahrung studierte in den Citri Labor veranschaulicht - Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, Verwendung mikrofluidischen dynamische Arrays für die Transkriptionsanalyse. Das beschriebene Protokoll ist selbstverständlich nicht auf das Studium t begrenzter Nucleus accumbens im Rahmen von Verhaltenssensibilisierung, könnte aber zu einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen und Hirnregionen aufgebracht werden. Tatsächlich könnte dieses Protokoll, um Körpergewebe außerhalb des Gehirns angewendet werden, und eine Vielzahl von Erfahrungen oder Manipulationen des Organismus untersucht.

Das Protokoll wird grob in vier Stufen unterteilt. Im ersten Schritt wird das Tier an den Verhaltensparadigma unterzogen; in der zweiten Stufe das Gewebe microdissected; im dritten Schritt - mRNA gereinigt, revers transkribiert und sondiert, und in einem letzten Schritt werden die Daten analysiert.

Im Rahmen der Untersuchung Transkriptionsdynamik, der genaue Zeitpunkt und die Definition der Erfahrung sind die wohl wichtigsten Versuchsparameter zu steuern. Aus diesem Grund ist, dass der Verhaltens Sensibilisierung auf Kokain, ein System, das hohe Niveau der Experimentator Steuerung ermöglicht über die Parameter der Erfah unsere Verhaltensmodell der Wahlce. Zusätzliche Verhaltensparadigmen, die präzises Timing aktivieren und sprechen verschiedene Modelle der erfahrungsabhängigen Plastizität oder Gedächtnisbildung zur Verfügung stehen. Diese Modelle sind mit Angst Anlage 23, akute Umweltanreicherung 24,25, Roman Objekt Exploration 26 und visuelles Erlebnis folgenden dunklen Aufzucht 27. Noch, Verhaltenssensibilisierung Kokain ist ein konsequent robuste Verhaltensmanipulation, die Schaffung eines hochdurchdringende Gedächtnisspur, die für Monate nach Kokain Erfahrung dauert 28.

Das Gehirn wird geschnitten, gefolgt von einer manuellen Mikrodissektion des Nucleus accumbens. Es ist unsere Erfahrung, dass die manuelle Mikrodissektion aus schnell zubereitet Hirnschnitten bietet die zuverlässige und schnelle Methode der Extraktion der relevanten Verhaltens Paradigma Gewebe und mit der Erfahrung, die Grenzen des Gewebes deutlich werden und ohne weiteres zu erkennen. Alternativ könnte feine Scheiben prepar seinED, gefolgt von Laser-Mikrodissektion. Obwohl dieses Verfahren ermöglicht hoch definierten Abgrenzung des Bereichs von Interesse, es ist langsam (also zu riskieren, die labilen mRNA), mühsam und erfordert teure Spezialausrüstung (ein Mikroskop mit einem Laser-Capture-Einrichtung vorhanden ist). Die hier definierten Protokoll könnte auch auf Einzelzelltranskriptionsanalyse durch manuelle Aspiration von Zytoplasma der Zellen visuell identifiziert mit Patch-Pipetten 29 angepasst werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das beschriebene Protokoll sieht eine Bevölkerung Durchschnitt, ist es sehr wahrscheinlich, dass in den meisten Fällen nur eine Subpopulation von Zellen innerhalb des Gewebes tatsächlich in Reaktion auf die Erfahrung beteiligt. Es ist von Interesse, um die Transkription in selektiver Weise aus bestimmten Zellpopulationen als Reaktion auf die Erfahrungen Profil, aber Diskussion dieser Ansätze ist, über den aktuellen Bereich.

Für die mRNA-Reinigung, Reverse-Transkription und qPCR Abfrage, das Gewebewird, indem es durch feine Nadeln, gefolgt von der Nutzung von kommerziell erhältlichen Kits gestört (für weitere Informationen siehe Tabelle 8). Die Wahl wird von Erfahrungen mit diesen Methoden, die zuverlässige Extraktion von hochwertigen RNA und robuste Ergebnisse von Downstream-Anwendungen zu gewährleisten informiert.

Während das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-qPCR beschriebenen Verwendung dynamische Arrays können Proben für die Genexpression mittels Endpunkt-PCR, geringe Durch qPCR, Genexpression-Microarrays oder tiefe Sequenzierung untersucht werden. Die Präferenz für die Hochdurchsatz-qPCR unter Verwendung dynamischer Anordnungen ist aufgrund der Tatsache, dass die mRNA erhalten aus Hirnkernen folgenden Verhaltensparadigmen ist oft der begrenzende Mengen. Dynamische Arrays eine Plattform, die eine effiziente umfassende Analyse der Transkripte aus einer großen Anzahl von Proben parallel in einem einzigen Experiment ermöglicht. Nach der anfänglichen Erwerb des mikrofluidischen Systems (allgemein institutioneller purchase), sind Experimente relativ preiswert zu laufen. Nach dieser Analyse könnten weitere Abfrage der Proben durchgeführt unter Verwendung teurer Plattformen, um für neue Transkripte (von Microarrays oder RNAseq) mit den dynamischen Arrays eine umfassende Referenz für die Qualitätssicherung zu suchen. Schließlich ist für die Datenanalyse, Standardansätze genutzt. Konkrete Hinweise über Probleme, die auftreten können, werden in dem Text des Protokolls erörtert.

Dieses Protokoll ist für die Ermittler interessiert in einer gründlichen Untersuchung ihres Systems von Interesse, das Studium mehrere Bedingungen und Wiederholungen am besten geeignet. Das Protokoll ist auch am besten geeignet für die Ermittler, die bereits in (durch Microarray-Experimente oder RNAseq) auf einer Teilmenge von 50-500 Gene von Interesse, die sie interessiert sind Abfragen wiederholt geschliffen haben.

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Protocol

HINWEIS: Das Protokoll folgt den Richtlinien der Tierpflege von der Hebräischen Universität in Jerusalem.

1. Herstellung von ACSF-Lösung

  1. Vorbereitung ACSF Lösung wie in Tabelle 1 beschrieben. Stellen L 1 in ddH 2 O (> 18 MOhm Reinheit), womit Osmolarität auf ~ 300 mOsm / l mit geeigneten Zusatz von Wasser oder NaCl.

2. Geräte und Zimmer Set Up

Die Ausrüstung für die Überwachung der Kokain-induzierten Bewegungsverhalten besteht in einem Verhalten Kammern (50 x 45 cm) mit einem inneren Lichtquelle, Ventilator und Kamera (oder Infrarot-Sensoren) verdrahtet und mit einer inneren Plexiglas-Box (30 x 30 cm), der in welche die Mäuse erlaubt, sich frei zu bewegen, während ihre Fortbewegung wird überwacht. Die Verhaltenstests sollte zwischen 1 h nach Lichter auf bis 1 Stunde vor dem Licht aus, auf einer regelmäßigen Licht / Dunkel-Zyklus durchgeführt werden. Die Tiere sollten konsequent zur gleichen Zeit jeden Tag trainiert werden.

  1. Reinigen Sie die Kammern nach jedem Versuch mit Desinfektionsmittel mit der Maus Anlage und / oder Geruch zu entfernen Reagenz, um Geruchs Cue Bias zu verhindern und um eine ordnungsgemäße Desinfektion zu gewährleisten.

WICHTIG: Beim Umgang mit den Mäusen ruhig, ruhig und vorsichtig sein.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Haus 5 C57BL6 männliche Mäuse (6-12 Wochen alt, ~ 25-35 g Gewicht) pro Käfig, in einem Zimmer mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus und den freien Zugang zu Nahrung und Wasser, nach den Normen und Anforderungen der lokalen Tier Care Committee Führung und Protokolle. Vor Beginn des Experiments, wiegen die Mäuse und melden die Daten. Kokain wird später nach dem Gewicht der Mäuse verabreicht.
  2. Übertragen Sie alle Käfige mit Mäusen in den Verhaltens Zimmer 30 Minuten vor Beginn der ersten Studie.
  3. Gewöhnen alle derMäuse im Experiment verwendet Experimentator Handhabung, Injektionen und Überwachen des Verhaltens Setup. Dies wird durch 3 aufeinanderfolgenden täglichen intraperitonealen Injektionen von 250 ul Kochsalzlösung, wie unten beschrieben, erreicht.
  4. Verwalten eine intraperitoneale Injektion von 250 ul Kochsalzlösung. Unmittelbar nach der Injektion, die Maus in einer Kammer, um das Verhalten der Bewegungsaktivität für 15 min überwachen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 3 aufeinander folgenden Tagen, zur gleichen Stunde jeden Tag.
  5. Am vierten Tag, teilen die Mäuse in zwei Gruppen. Bereiten Sie eine Stammlösung von Kokain bei 2 mg / ml in Kochsalzlösung. Verabreichung einer einzigen Injektion von Kokain-Lösung (final 20 mg / kg) an die Versuchsgruppe entsprechend dem Gewicht der Maus (zB für eine 25 g-Maus - 250 ul injiziert, während eine 30 g Maus 300 ul zu erhalten). Kochsalzlösung verabreichen der Kontrollgruppe. Unmittelbar nach der Injektion, die Maus für 20 min in einem Verhalten Kammer zur Überwachung der Bewegungsaktivität (typicVerbündeter, werden die ersten 15 min überwacht).
  6. Nach der Kokain-Injektion, zu opfern die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 1, 2, 4, 8 und 24 h nach der Injektion). Wichtig ist, stellen Sie sicher, dass die Referenz Mäuse (Zeitpunkt 0) wird jegliche Injektion an diesem Tag nicht zu empfangen. Wegen seiner Bedeutung, ist es unerlässlich, Wiederholungen der Referenzgruppe gehören.

4. Präparation des Nucleus accumbens

  1. Betäuben die Mäuse mit Isofluran zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Kokain / Kochsalzlösung-Injektion. Isofluran ist direkt aus dem Raum abgelassen werden. Daher sollte das Verfahren in einem Laborabzug durchgeführt werden.
  2. Überwachung der Narkosetiefe durch die Prüfung der hintere Fuß Reflex. Pinch die Pfote, um einen Rückzugsreaktion durch das Tier hervorzurufen. Ein Tier, das einen Reflex zeigt nicht an einer chirurgischen Narkosetiefe und nicht in einem Zustand zu einschläfern.
  3. Extraktion des Gehirns:
    1. Euthanize die Maus durch Enthauptung.
    2. <li> Entfernen Sie die Haut über der Mitte des Schädels und schneiden den Schädel mit einer scharfen Schere.
    3. Setzen Sie die Schere an der Stelle, wo das Rückenmark ins Gehirn gelangt (Foramen magnum) und machen zwei seitliche Schnitte.
    4. An der gleichen Stelle, machen Sie einen langen sagittalen Schnitt entlang der Pfeilnaht. Bei Erreichen des Riechkolbens, Klammer nach links und nach rechts.
    5. Mit einer Pinzette, entfernen Sie den Schädel sorgfältig, Greifen jeweils die Hälfte der Schädel fest und zog an der Seite, kümmert sich nicht um auf drücken oder das Gehirn schädigen.
    6. Entfernen Sie das Gehirn während Abtrennen der Hirnnerven durch die Verwendung eines umgedrehten Löffel Mikro Spachtel.
  4. Legen Sie das Gehirn in einer eiskalten ACSF-Lösung für 1-2 min zum Chillen und aushärten.
  5. Entfernen Gehirn aus dem ACSF, Wick überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch, erstellen Sie einen koronalen Schnitt zwischen dem Kleinhirn und dem Rest des Gehirns und kleben das Gehirn, mit dem rostralen Teil nach oben, auf die Vibratom Bühne.
  6. Schneiden NAC: Pflegen ACSF-Lösungen bei eiskalten Temperaturen in der Schneidekammer des Vibratom. Schnitt bei 200 um bis Nucleus accumbens (NAC) ist klar nach dem Paxinos und Franklin Maus-Gehirn-Atlas (ca. 1,8 mm vor Bregma identifiziert; achten Sie auf die Form des Corpus callosum, die Lage und die Form der vorderen Kommissur und die Ventrikel als auch die Gesamtmorphologie des Gehirns Abschnitt). An dieser Stelle legen Sie zwei 400 um Abschnitte, von denen der NAC seziert werden.
  7. Unter einem Stereoskop, verwenden Sie eine feine Klinge, um den NAC-Bereich von den Scheiben sezieren. Die Definition des NAC nach den Paxinos und Franklin Maus-Gehirn-Atlas, und konnte bequem in den entsprechenden Abschnitten von vier Schnelldurchläufe der Klinge auf das Gewebe seziert werden. (Abbildung 2).
  8. Zeigen NAc Abschnitte werden sofort in 900 ul Trizol Lyse-Reagenz in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C bis zur RNA-extrAktion.

5. RNA-Extraktion und cDNA Reverse Transkription

  1. Auftauen der Röhrchen accumbens Kern mit Abschnitten in Trizol-Lyse-Reagenz bei Raumtemperatur und Homogenisierung des Lysats mit einer 1 ml Spritze mit 25 G Nadel verbunden ist, bis das Gewebe vollständig homogenisiert (mindestens 15-20 mal). Die ersten paar Runden sind schwierig und erfordern Schieben des Gewebes gegen die Wand des Rohrs, um es in kleine Stücke, die die Spitze der Nadel eintreten könnte brechen.
  2. Homogenisierung zu gewährleisten, pipettieren das Lysat in ein QIAshredder Mini-Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min.
  3. Pipette das Lysat in neue Mikrozentrifugenröhrchen und Extrahieren der RNA nach den Angaben des Herstellers. Bewahren Sie die RNA bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  4. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Bioanalyzers oder gleichwertige Geräte analysieren Integrität und Qualität. Verwenden 100-500 ng RNA für jede Runde von cDNA-Vorbereitung mit rAndom Hexamer Primer.

6. Primer-Design und Primer Testing

  1. Auswahl guter Primer: Für ein optimales Primerpaar für die qPCR der mRNA-Transkripte, folgen diese Anforderungen (Abbildung 3):
    1. Design-Primer enthalten, nicht mehr als 17-28 Basen. Vermeiden-Wiederholungen, wie sie Mispriming fördern.
    2. Design von Primern mit Schmelztemperatur (T m) zwischen 56-68 ° C (optimal 60-64 ° C). Die T m innerhalb der Primerpaar sollte innerhalb von 1 ° C voneinander abweichen.
    3. Seien Sie sich bewusst, dass das Produkt Größe sollte idealerweise zwischen 80 und 150 bp sein.
    4. Sicherzustellen, dass zumindest einer der Primer umfasst eine Exon-Exon-Verbindungsstelle oder das Amplifikat enthält eine große Intron (Intron überspannende), um die Amplifikation von genomischen DNA-Verunreinigungen zu vermeiden.
    5. Verwenden Sie eine zuverlässige Software, basierend auf Primer3 (Beispiele siehe Tabelle 2), um Primer-Design zu verbessern.
  2. Testen des prIMers: Um die Spezifität und Effizienz der Primer zu gewährleisten, sollte eine Steuer qPCR Reaktion durchgeführt werden:
    1. Verwenden einer positiven Probe (enthaltend cDNA-Matrize für alle relevanten Primerpaare) und titriert die cDNA (zB acht dreifache Verdünnungen von einer Anfangskonzentration von ~ 10 ng) in zweifacher Parallelreaktionen. Gehören ein No-Template-Steuerung, die auf Verunreinigungen in den für die Reaktion verwendet Lösungen steuert.
    2. Berechnen Primereffizienz unter Verwendung der Formel: (10 (- 1 / Steigung) -1) x 100, so daß die Kurve der optimalen Neigung - 3.333 (= 10 (- 1 / 3.333) = 2) (Figur 4).
    3. Bestimmen die Spezifität der Amplifikation. Spezifische Amplifikation wird durch einen einzigen prominenten Peak gemeinsam für alle Schmelzkurven der Amplifikate nachgewiesen, während Off-Target-Amplifikation würde als eine offensichtliche Abweichung fr erscheintom die einzigen großen Höhepunkt.

7. qPCR-Analyse

  1. Vorverstärkung:
    1. Umfassende qPCR-Analyse auf parallelen Abfrage Begrenzungs Mengen von RNA mit einer Vielzahl von Primerpaaren basieren. Daher ist ein Schritt der Vorverstärkung wesentlich. In diesem Schritt wird die cDNA erfährt 14-18 Zyklen der Vorverstärkung mit einem Gemisch aller Primer, die für die Abfrage der Probe in der Zukunft (bis zu 800 Primerpaare) verwendet wird.
    2. Verdünnen alle Primer in TE (niedrige EDTA) bis 50 um für bestimmte Ziel Amplification (STA).
    3. Pool zusammen 1 ul Aliquots alle 50 uM Primer-Sets in der STA-Reaktion eingeschlossen werden, bis zu 800 Tests.
    4. Vorbereitung Vormischung und Proben für STA, wie in Tabelle 3 beschrieben. Ermöglichen Fehler durch Herstellen Mischung für 110% der Anzahl der Proben, die verstärkt werden müssen.
    5. Aliquoten 3,75 ul STA Pre-Mix für jede Probe. Fügen 1,25 ulcDNA zu jedem.
    6. Wirbel um die Reaktionen und Zentrifuge für 10 sec mischen.
    7. Legen Sie die STA Reaktionen in einem Thermocycler und Zyklus wie bei Tabelle 4 angegeben.
  2. Exonuklease I (ExoI) Behandlung:
    1. Verdünne die Exo I, wie in Tabelle 5 angegeben.
    2. Add 2 ul verdünnte ExoI (4 U / ul) zu je 5 ul STA Reaktion, Wirbel, Spin-Down (> 6.000 xg) und in einen Thermocycler bei 37 ° C für 30 min und dann bei 80 ° C für 15 min.
    3. Verdünne die Endprodukte auf eine geeignete Konzentration für den Test. Verwendung TE-Puffer (43 ul hinzufügen TE-Puffer auf die 7 ul TSA Probe).
    4. Die verdünnte STA Produkte bei -20 ° C oder sofort nutzen.
  3. Primer und Probe-Setup für qPCR:
    1. Vorbereitung der Proben, wie in Tabelle 6 gezeigt. Planen Mischung nach der für das Experiment ausgewählt Chip und Proben hinzufügen, wie angemessen.
    2. AgiTate Probenmix Lösungen für mindestens 20 Sekunden, und zentrifugieren (> 6000 × g) für wenigstens 30 Sekunden. Bereit Reaktionen können für kurze Zeit bei 4 ° C gelagert werden, bis der Chip zum Laden bereit.
    3. Vorbereitung der Assays, wie in Tabelle 7 beschrieben.
    4. Agitieren Testansatz für mindestens 20 Sekunden und Zentrifuge (> 6.000 xg) für mindestens 30 Sekunden zu drehen Sie alle Komponenten.
      WICHTIG: Vortex gründlich und Zentrifuge den Proben und Testlösungen vor dem Pipettieren in die Chip-Buchten. Andernfalls kann es zu einer Verringerung der Datenqualität führen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration jedes Primers beträgt 5 um in den Einlaß und 500 nm in der endgültigen Reaktions.
  4. Grundieren und Laden der Dynamic Array IFC (Integrated Fluidic Circuit)-Chip. Die IFC-Chip verfügt über Einlässe für Proben und Assays, sowie bestimmte Einlässe (Akkumulatoren) für Steuerleitung Flüssigkeit (Mineralöl) verwendet, um die Mikrofluid-Kammern unter Druck (FiguWieder 4A).
    1. Injizieren Steuerleitung Flüssigkeit in jedem Akkumulator auf dem Chip.
    2. Entfernen Sie den blauen Schutzfolie von der Unterseite des Chips.
    3. Platzieren Sie den Chip in der entsprechenden IFC Controller (Controller MX für den 48.48 Dynamic Array IFC IFC Controller oder der HX für den 96.96 Dynamic Array IFC), dann führen Sie den Prime (113x) Skript für den 48.48 Dynamic Array IFC oder dem Prime (136x) Skript für die 96.96 Dynamic Array IFC, um prime dem Chip.
    4. Wenn das Skript fertig ist, entfernen Sie die grundierte Chip von der IFC Controller.
    5. Pipette 5 ul jeder Assay-Mischung und 5 ul jeder Probe Mix in ihren Einlässen.
    6. Bringen Sie den Chip an den IFC-Controller.
    7. Mit Hilfe der IFC-Controller-Software, führen Sie den Last Mix (113x) Skript für den 48.48 Dynamic Array IFC) oder laden Mix (136x) Skript für die 96.96 Dynamic Array IFC, die Proben und Assays in den Chip laden. Wenn die Last Mix Skript fertig ist, entfernen Sie die Lasted-Chip von der IFC Controller.
    8. Laden Sie den Chip auf dem Thermocycler, erstellen Sie eine neue Chip-Lauf (nach Herstellerrichtlinien), einschließlich Schmelzkurvenanalyse. Verwendung des Thermocycler-Software, dass die Reaktionskammern richtig erkannt, und die die Reaktion vollständig ablaufen.

8. Datenanalyse

  1. Qualitätssicherung: Um die Datenqualität zu sichern, prüfen die Qualität der Primer durch die Auseinandersetzung mit Verdünnungskurven (wie oben beschrieben). Überwachung der Spezifität der Amplifikation durch Betrachten der Schmelzkurven von Amplikons, sollten die Spitzen der optimal eng ausgerichtet werden 29.
  2. Visualisierung: Zur Visualisierung von großen Mengen von Daten, die von Hochdurchsatz-qPCR erhalten, erzeugt bedienende Software Heatmaps, in denen die Expression ist farblich gekennzeichnet durch Intensität. Darüber hinaus zeigen die Transkriptionsdynamik einzelner Gene als gesäumt Streudiagramme.
  3. Veröffentlichung: In Verlagsdie Genexpressionsergebnisse, ist es ratsam, die Richtlinien für die Veröffentlichung MIQE der quantitativen Echtzeit-PCR-Experimente folgen, detailliert die Mindestangaben, die für eine qPCR-Experiment berichtet, muss um seine Relevanz, Genauigkeit, korrekte Interpretation und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

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Representative Results

Die Qualität der durch die Anwendung dieses Protokolls erhaltenen Ergebnisse entscheidend, hängt von einer Anzahl von Parametern. Ordnungsgemäße Versuchsplanung in minimaler Störung der Versuchsmäuse, führen, so dass die Erfahrung getestet (in diesem Beispiel, daß der Kontakt mit Kokain) wird die dominierende Erfahrung in der jüngsten Vergangenheit ist, und daher wird in einem robusten und spezifische Transkriptions führen Programm. Abbildung 1 beschreibt den Versuchsplan für die Verhaltens Sensibilisierung gegen Kokain, die Festlegung der Zeitpunkten nach der Kokain-Erlebnis, bei dem der Nucleus accumbens von Mäusen seziert und analysiert. Der nächste entscheidende Punkt ist, dass der Festlegung der genauen Grenzen für die Exzision des richtigen Gewebe für die Analyse. Abbildung 2 beschreibt die Grenzen des Nucleus accumbens im koronalen und sagittalen Abschnitte. Vorzugsweise ist die Präparation sollte so ausgeführt werden, dass ein dünner Rand NAc Gewebe aus dem Bereich ausgeschlossen taken für die Profilerstellung. Dies stellt sicher, konsequente Profilierung nur der NAK, die Verringerung Variabilität und das Potenzial für Artefakte sich aus der Einbeziehung des umgebenden Gewebes.

Beim Verstärken limitierende Mengen an RNA, wie in der Präparation von kleinen Hirnkerne sind viele Zyklen der Amplifikation für die richtige Erkennung des Signals erforderlich. Daher ein entscheidender Punkt in jedem quantitative PCR Experiment weiter verstärkt, wenn die Arbeit mit kleinen Mengen des Ausgangsmaterials, ist die Charakterisierung der für die Amplifikation verwendeten Primer. Abbildung 3 beschreibt wichtige Funktionen bei der Definition optimaler Primer und Abbildung 4 zeigt die Verstärkungskurven von Primern gerichtet gegen c-Fos und FosB, was zeigt, dass diese Primerpaare verstärken ihre Ziel Transkript mit ~ 100% Wirkungsgrad in jedem Zyklus. Folgenden Primer Validierung und Etablierung der richtige experimentelle Paradigma klare Bewertung der Transkription von den Ziel tiss zu ermöglichenue, können umfassende Analyse auf der Plattform durchgeführt Fluidigm Biomark werden, so dass bis zu 9.216 parallel qPCR Reaktionen (in der 96.96-Format; Abbildung 5). Diese Hochdurchsatz-Plattform ermöglicht die parallele Analyse von mehreren experimentellen Wiederholungen mit identischen Versuchsbedingungen auf einem einzigen Chip. Daten für Vierfach-Versuchswiederholungen, der Bewältigung der Transkriptions Induktion von c-Fos und FosB nach akuter Kokain Erfahrung, sind in Abbildung 6 gezeigt.

Figur 1
Abbildung 1. Versuchs Paradigma für dynamische Transkriptionsanalyse folgende Kokain Erfahrung. (A) Versuchsprotokoll - Mäuse werden, um die Handhabung und Einspritzung für 3 Tage gewöhnt, während die Überwachung der Bewegungsaktivität von Video-Tracking mit einem Schalldämpfungsverhalten Kammer. Mäuseunterliegen dann Kokain Erfahrung; eine einzige Forderung = akute Kokainerfahrung; 5 aufeinander folgenden Injektionen werden chronische Exposition bezeichnet. Eine einzige Injektion folgenden ≥16 Tagen der Abstinenz von Kokain ist ein Kokain Herausforderung bezeichnet. Transkriptionsdynamik bei verschiedenen Versuchszeitpunkten nach der Kokain-Erfahrung (1, 2, 4, 8, 24 h), gerichtet. (B) Auftragung der Maus Spur innerhalb des Verhalten Kammer folgenden 3 Tage der Kochsalzinjektion oder 3 Tage von Kochsalzlösung + a Einzel akute Kokain-Exposition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Position des Nucleus accumbens im Gehirn der Maus. Dicken weißen Linien markieren die Lage der Schnitte der Definition der b oundaries des NAC (A) Frontalschnitt;. (B) Sagittalschnitt. (Bilder angepasst von der Allen-Gehirn-Atlas Atlas Referenzbilder. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100.883.869 ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Planung qPCR Primer. Richtlinien für die Planung qPCR-Primer, mit Definitionen für Spezifität, Stabilität und Kompatibilität. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Bewertung der Primer Effizienz. (A) Ergebnisse der Verstärkungskurven von Fos und FosB mit Fluidigm IFC-Arrays. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von sieben serielle 3-fachen Verdünnungen von Gesamt-RNA aus Maus-NAc extrahiert und auf die Expression von Fos und FosB sondiert erzeugt. (B) Die Effizienz der Primerpaar für Fos und FosB wurde durch Auftragen der Zyklusschwellenwert (ausgewertet CT) bei jeder Verdünnung gegen den Logarithmus des fache Verdünnung der Probe. Die Effizienz der Primer aus der Steigung der Standardkurve berechnet, wie im Text definiert. Die Verstärkungskurven und Punkte auf der Verdünnungskurve sind farblich aufeinander abgestimmt.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Umfassende qPCR Profiling der Anwendung des Fluidigm Plattform. (A) 96.96 Dynamic Array IFC für Real-Time quantitative PCR. Die Primer werden in die Einlässe in der rechten Seite geladen, und die Proben werden in die Einlässe in der linken Seite des Chips angeordnet ist geladen. Diese Zahl hat sich mit Genehmigung von Fluidigm Echtzeit-PCR-Analyse Benutzerhandbuch geändert. (B) Wärmekarte der qPCR Ergebnisse, was Ct-Werte für jede Vertiefung auf dem Chip. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Die Ergebnisse der Proben des Ausdrucks Dynamik nach einer akuten Exposition Kokain. Kokain-induzierte Expression von c-Fos und FosB werden als eine Funktion der Zeit angezeigt. Durchschnittswerte von Vierfachversuchswiederholungen durchgeführt gemäß dem hierin definierten Protokoll werden angezeigt, zusammen mit Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts.

Reagens MW mM g / l
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58,44 119 6,95
NaHCO 3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84,01 26 2,18
Glucose (Sigma-Aldrich, G8270) 180.16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d> 74,55 2.5 0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137,99 1 0,138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246,5 4 0,99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0,59

Tabelle 1. ACSF-Lösung.

Name der Software Anwendung Ihr Standort
Roche Probefinder Primer-Design http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI-Primer-Explosion Primer-Design http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Tabelle 2. Software-Liste.

Reagens Volumen / Reaktion (ul) Volumen für 48 Reaktionen + 10% Überschuss (ul) Volumen für 96 Reaktionen + 10% Überschuss (ul)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 nm (10X) vereinigt Primer-Mischung 1 52,8 105,6
Wasser 0,25 13.2 26,4
cDNA 1,25
Gesamtvolumen 5

Tabelle 3. STA Reaktionslösung.

Zustand Halten 10-14 Zyklen Halten
Temperatur 95 ° C 95 ° C 60 ° C 4 ° C
Zeit 10 min 15 Sekunden 4 min

Tabelle 4. Thermische Zyklusbedingungen für die Prä-Amplifikation.

Komponente Pro 5 ul Probe (ul) 48 Proben mit Überschreitungs (ul) 96 Proben mit Überschreitungs (ul)
Wasser 1.4 84 168
Exonuklease I Reaktionspuffer 0,2 12 24
Exonuklease I bei 20 Einheiten / ul 0,4 24 48 </ Td>
Gesamtvolumen 2.0 120 240

Tabelle 5. ExoI Reaktionslösung.

</ Tr>
SAMPLE MIX Komponente Volumen pro Inlet (ul) Volumen pro Inlet mit Überschreitungs (ul) Volumen für 48.48 Dynamic Array IFC (ul) (120 Proben) Volumen für 96.96 Dynamic Array IFC (ul) (120 Proben)
2X SsoFast EvaGreen Supermix mit Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X DNA-bindenden Farbstoff Probenaufgabe Reagenz (Fluidigm, PN 100-3738) grüne Kappe 0,25 0,3 18 36
STA und ExoI behandelten Probe 2,25 2.7
Gesamt 5 6

Tabelle 6. Beispiel Pre-Mix-Lösung.

Tabelle 7. Assay Mix-Lösung.

Komponente Volumen pro Inlet (ul) Volumen pro Inlet mit Überschreitungs (ul) Volumen für 48.48 Dynamic Array IFC (ul) Volumen für 96.96 Dynamic Array IFC (ul)
2X Assay Ladungsreagenz 2.5 3 180 360
1X DNA Suspensionspuffer (TE niedrigen EDTA) 2 2.4 144 288
50 uM jeder gemischten Forward und Reverse-Primer 0,5 0,6
Gesamtvolumen 5 6
Name des Reagenz / Material Firma Katalognummer
Virusol Oriek Medical J29D
Isofluran, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy Mini Kit Plus Universal- QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit Invitrogene AB-4368814
TE-Puffer Invitrogene 1355656

Tabelle 8. Liste der Chemikalien / Reagenzien.

Name der Ausstattung Firma Katalognummer
Verhalten Kammer (MDF, 50 x 45 cm) Selbstorganisierte
Innen Perspex-Box (30 x 30 cm) Selbstorganisierte
Kamera und Videorekorder Campden Inst CMD-80051
Media Recorder Software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Schere FST FST-14062-09
Vibratom Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzers Agilent Technologies Der Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermocycler Bio-Rad 1852048
Invertiert microspun Spachtel Bochem Instrumente GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamische Array-Chip für 96,96 Genexpression Fluidigm BMK-M-96.96

Tabelle 9. Ausrüstungsliste.

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Discussion

Erfolgreiche Charakterisierung der Genexpression von Hirngewebe folgenden Verhaltensparadigmen ist abhängig von: 1) Sorgfältige Behandlung von Mäusen während der Verhaltens Paradigma; 2) Schnelle und präzise Präparation von Gewebe von Interesse; 3) RNA-Safe-Maßnahmen, um die Integrität der RNA zu gewährleisten; und 4) Sorgfältige Planung von Primern und experimentelle Layout sowie Präzision und Liebe zum Detail in der Vorbereitung für die qPCR-Analyse.

Das Ziel der beschriebenen Vorgehensweise ist es, die Dynamik des Transkriptionsereignisse durch eine Verhaltens Erfahrung induziert charakterisieren; Daher ist eine sorgfältige Aufmerksamkeit, um sicherzustellen, daß die Verhaltens Paradigma von der Maus erlebt in der Tat stellt die Erfahrungen der Forscher gedacht. Zum Beispiel, auch in einer so einfachen Paradigma als Verhaltens Sensibilisierung gegen Kokain, die Erfahrung der Maus konnte von vielen Störfaktoren beeinflusst werden: die vorherige Erfahrung mit der Maus in die Heimat-Käfig vor dem ExExperiment; Das Verfahren der Übertragung auf dem Versuchsraum; das Licht, Ton und Geruch Exposition in der Versuchsraum; die Erfahrung der Handhabung durch den Experimentator; die Schmerzen / Beschwerden durch die IP-Injektion verursacht werden; Exposition gegenüber einem neuartigen Experiment und die Erfahrung in der angegebenen Verhalten bis zu dem Punkt der Euthanasie. Jede dieser Erfahrungen kann in Isolation, Induktion von Transkriptions fördern Programme in verschiedenen Hirnregionen der Maus. Deshalb muss darauf geachtet werden, dass die Transkriptionsprogramm misst den gewünschten Paradigma und nicht Begleiterscheinungen mit dem Paradigma assoziiert. Im Falle von Kokain Erfahrung ist dies leicht durch sorgfältige Versuche und Detail, sowie eine einfache Kontrollexperiment, bei dem alle Parameter konstant gehalten werden, sondern Fahrzeug (Kochsalzlösung) erreicht wird, um die Maus nicht Kokain injiziert. Nach unserer Erfahrung Kochsalzinjektion induziert eine Transkriptionsprogramm sehr begrenztem Umfang im Vergleich zuKokain Exposition, die zeigen, dass das Paradigma, mit überwältigender Mehrheit ermöglicht Erforschung der Phänomene von Interesse.

Höchste Vorsicht ist geboten, um den Bereich der Erfahrungen der Maus zu begrenzen, während es immer noch aktiv ist, erfordern Ruhe und der sorgfältige Umgang mit den Mäusen. Im Gegensatz dazu nach der Anästhesie, schnell und präzise Arbeit wesentlich aufgrund des Potenzials für schnelle Änderungen in der Darstellung der RNA (auf der Zeitskala in Minuten) und die intrinsische Labilität der RNA, die schnell abgebaut werden könnte, nachdem die Zellen aufgebrochen werden, potentiell Störung des Transkriptionsprofils durch Erfahrung induziert. Es ist daher wichtig, um das Gehirn aus dem Schädel schnell zu einer gekühlten Umgebung (innerhalb von 1-2 min) zu entfernen und schnell zerlegen NAC in eiskaltem Bedingungen. Sobald das Gehirn wurde gekühlt werden das Potential für Transkriptionsänderungen oder RNA-Abbau wesentlich reduziert, aber nur, wenn die betreffenden Abschnitte sind in Trizol-Reagenz gegeben und eingefroren, is die Integrität des Gewebes und die Darstellung des Transkriptionsprofils gewährleistet.

In diesem Zusammenhang lohnt es sich, zu erwähnen, dass Transkriptions Dynamik der immediate-early Genexpression erfolgt auf einer schnellen Zeitskala, die oft Höchststand vor 1 Stunde nach Stimulation. Im Rahmen des beschriebenen experimentellen Paradigma wird die Abfrage des Transkriptions Dynamik auf das Ausmaß der Stunden, um die Variabilität zwischen den Proben zu reduzieren beschränkt. Für Zeiten, die kürzer als 1 Stunde, konnten geringe Schwankungen in der Zeitsteuerung in großen Variation in der Grße beobachtet Transkriptionsänderungen führen. Daher hat die 1 h Zeitpunkt für die Analyse ausgewählt, da dieser Zeitpunkt experimentell leichter mit Präzision durchzuführen, und ist weniger anfällig für eine Variation in der Höhe von wenigen Minuten Differenz in dem Experiment.

Traditionell ist ein Gewebe von vielen Labors micropunch für die Präparation von Gewebeproben verwendet wurde. Dagibt eine Reihe von Gründen zur manuellen Mikrodissektion des Gewebes bevorzugen. Der Stempel wird in der Regel aus Edelstahl und ist nicht transparent. Daher Positionierung des Stempels in einer präzisen und konsistenten Lage kann tückisch sein. Darüber hinaus bedeutet der Stempel nicht zulassen, dass eine Korrektur vorgenommen werden, wenn ein Fehler in der Anfangspositionierung da war. Schließlich kann die Extraktion von Gewebe aus dem Stempel manchmal als schwierig, und es gibt Potenzial für den Verlust Gewebe oder Übertrag zwischen den Proben. Mikrodissektion mit einem feinen Skalpell das Gewebe ermöglicht der Experimentator eine genauere Kontrolle und gibt Sicherheit hinsichtlich der Reinheit der Proben.

Während der RNA-Extraktion und cDNA-Synthese bis, muss die Arbeitsumgebung frei von Verunreinigungen RNase Quellen gehalten werden, und die Arbeit sollte mit RNase kostenlose Tools, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien durchgeführt werden. In dieser Phase, die kleinste Verunreinigung kann leicht beschädigt hart verdientes RNA-Proben. Halten die Proben ice kalt ist entscheidend für die Minimierung neuronalen Aktivität, die Transkriptionsauslese ändern könnte, sowie die enzymatische Aktivität, die die Integrität der Probe beeinflussen können, zu minimieren. Zusätzliche pharmakologische Inhibitoren werden manchmal hinzugefügt, um neuronale Erregbarkeit verringern, aber oft sind diese nicht wesentlich.

Nach der reversen Transkription in cDNA, wird der Schwerpunkt auf die Gewährleistung der Wirksamkeit der von der umfassenden Profilierung Transkripten erhaltenen Ergebnisse. Der erste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass geeignete qPCR-Primer verwendet werden, für die es sehr empfehlenswert, Primer Effizienz und Spezifität an Verdünnungskurven einer definierten RNA-Quelle zu testen. Optimaler PCR-Primer enthalten spezifische und effiziente Amplifikation der Ziel. Spezifische Amplifikation beinhaltet, dass Amplifikation nur der Zielsequenz, offensichtlich als eine einzige diskrete Peak der Schmelzkurvenanalyse, wobei eine effiziente Verstärkung impliziert, dass in jedem Zyklus ist die Menge der Zielsequenz,dupliziert, mit einer Effizienz von 100% annähert. Wegen der hohen Durchsatz Natur des mikrofluidischen Chips qPCR diese Experimente erfordern eine sorgfältige Planung, um die Aufnahme von einer erheblichen Anzahl von positiven und negativen Kontrollen zu gewährleisten. Es ist vorzuziehen, konsequente Kontrollen in jedem Chip Lauf enthalten, um so einen direkten Vergleich der Ergebnisse aus Kontrolle und Versuchsbedingungen. Während der Einrichtung des Experiments ist es wichtig, nicht zu kreuzkontaminieren Brunnen. Seit winzige Menge von Primern in der falschen gut könnte die Verstärkung der unerwünschten Ziel verursachen kann, sollte besonders vorsichtig beim Pipettieren Primer genommen werden.

Für die meisten Gewebeproben aus dem Gehirn ist es schwierig, sicher zu sein, dass bei der Präparation nur das Gewebe von Interesse extrahiert wurde, ohne Kontamination irrelevant Hirnregionen, die die Analyse der Ergebnisse verwirren könnten. Zu diesem Zweck ist ein wichtiger Steuer Sondieren für Gene, deren Expression voraussichtlich von auszuschließendas Gewebe von Interesse. Ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung von räumlichen Mustern der Genexpression ist die Allen-Gehirn-Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Während eine gründliche Diskussion der Datenanalyse geht über den Rahmen dieser Publikation ist zu beachten, dass eine sorgfältige Experimente garantiert sorgfältige Analyse werden. Es ist wichtig sicherzustellen, daß eine Anzahl von entsprechenden Bezugs Gene in jeder Runde der qPCR enthalten. Diese Gene werden für die Normalisierung, um zu dienen, um sicherzustellen, dass ähnliche Mengen an RNA untersucht werden. Die Normalisierung wird zuerst auf die Referenzgenen in der Probe mit den Referenz Mäuse für den Versuch ("Zeit 0") durchgeführt und dann unter Anwendung des "ΔΔCt Methode".

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll ist die Erforschung Transkriptions Dynamik folgenden Kokain Erfahrung in den Nucleus accumbens von Mäusen ab. Jedoch ist es sehr leicht adapted für die Untersuchung von jedem anderen Erfahrungen der Maus, solange geeignete Kontrollen werden durchgeführt, und der Zeitpunkt der Erfahrung gut definiert ist. Offensichtlich Dieses Protokoll kann auch für die Untersuchung der Dynamik der Transkription in Geweben außerhalb des Nervensystems implementiert werden.

Es sollte betont werden, dass umfassende Transkriptionsprofiling unter Verwendung mikrofluidischer Basis qPCR ist ein kostengünstiges Verfahren zur Profilierung Transkriptionsereignisse, sondern hängt von Vorwissen der Zielgene von Interesse. Diese werden normalerweise durch unvoreingenommene Profiling Methoden wie Microarrays und deep sequencing erhalten. Daher wird in der Workflow eines großen Projekts, umfassende qPCR Profiling konnte den Großteil der Daten zur Verfügung stellen, aber vorzugsweise sollte eine vorherige unvoreingenommene Charakterisierung des Systems zu folgen.

Es lohnt sich auch die besagt, dass die hier für den Erhalt von Gewebeproben beschriebenen Verfahren könnte auch in Richtung Studie umgesetzt werdening eine Vielzahl von anderen zellulären Ereignissen - Proteomics und Proteinmodifikationen, Metabolomics, Lipidomics und epigenetische Markierungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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