Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

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Neuroscience

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Summary

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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Abstract

A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.

Introduction

Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser mantidos durante pelo menos algumas semanas in vitro, e durante este tempo o desenvolvimento neuronal precoce pode ser seguido pela experiências bioquímicas, funcionais e morfológicas. Para as culturas primárias, ela pode ser benéfica para os neurónios em placa de baixa densidade; isso faz com que seja possível visualizar a somata indivíduo, dendrites, eixos axonal e termi nervonais em alta resolução espacial. No entanto, a sobrevivência e diferenciação de neurónios a baixa densidade, tipicamente requer que eles são plaqueadas numa camada alimentadora de células gliais, a co-cultura com células gliais, na ausência de contacto físico com eles, ou cultivadas em meio condicionado por células gliais 1.

O estabelecimento de culturas neuronais de baixa densidade em camadas alimentadoras gliais pode ser dependente de genotipagem rápida e fiável de antemão - dentro de algumas horas, em contraste com alguns dias. A velocidade é especialmente importante quando o genótipo neuronal precisa de ser compensada com o de uma camada alimentadora glial preparado de antemão. Como um exemplo mais prático, pode ser necessário decidir qual das crias que genótipo de usar na geração de culturas, para optimizar a eficiência de uma experiência.

Aqui demonstramos o protocolo de trabalho que tenha sido utilizado para rápido, simplificado e fiável genotipagem rato em publicações anteriores 2-6. Rabos de rato eum kit disponível comercialmente são usados. Este protocolo inclui a extracção de passo único de ácidos nucleicos a partir do tecido, e não exige nem um passo de purificação de ácido nucleico que nem o uso de um tampão de terminação ('solução parar'). A fiabilidade deste método de genotipagem é ilustrada, apresentando os resultados de uma série de testes em que são introduzidas diferenças no que diz respeito à quantidade de partida das amostras, a idade dos animais e do comprimento dos produtos de amplificação de PCR. Este kit oferece as vantagens de extracção e fiabilidade automatizado.

Por causa de ser abrangente, a utilização de tatuagem para identificação de longo prazo dos ratinhos cujo genótipo é também demonstrada. A tatuagem é conseguido pela aplicação de tinta para tatuagem a derme da pele (epiderme sob as) 7. Um procedimento é descrito para tatuar as almofadas das patas de ratos recém-nascidos ou 1 dias de idade, embora tatuagens pode ser aplicado a outras partes do corpo, tais como as caudas e os dedos do pé, e a Animals de todas as idades. Além disso, os procedimentos será demonstrada para o plaqueamento e a cultura de neurónios de rato, a uma densidade baixa, com base na preparação optimizado de diferentes tipos de camadas alimentadoras gliais 2,8.

Nós usamos um modelo genético do rato da desordem neurológica DYT1 distonia herdada - uma desordem de movimento autossômica dominante, causada por uma mutação no gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. A proteína codificada, torsinA, pertence aos "ATPases associadas a diversas atividades celulares" (AAA +) família de proteínas, cujos membros geralmente desempenham funções semelhantes a chaperonas, auxiliando em: proteínas que se desdobram, desmontagem proteína do complexo, o tráfico de membrana e fusão das vesículas 10-13. Os resultados de mutação em uma deleção em enquadramento de um codão para ácido glutâmico, e pode conduzir a manifestação de "início precoce generalizada isolado distonia '14,15. No entanto, o caminhomecanismos ophysiological responsáveis ​​por esta desordem permanecem pouco compreendidos. Em um modelo de rato knock-in, o alelo mutante é Tor1a tm2Wtd, mencionados a seguir como Tor1a AE. Heterozygous AE-torsinA knock-nos ratos são pacientes humanos viáveis ​​e geneticamente mímica com DYT1 distonia, enquanto homozigoto knock-in ratos morrerem após o nascimento 16,17, com a latência para a morte pós-natal afetados por fundo genético 18. A morte prematura de homozigose camundongos knock-in exige que tanto a genotipagem dos animais eo estabelecimento de culturas neuronais são concluídas rapidamente. Como outro exemplo de genotipagem, Tfap2a (fator de transcrição AP-2α, ativando obrigatório 2α proteína potenciador) será usado. A proteína codificada por este gene é importante na regulação de vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose 19.

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Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Iowa animal Institucional.

1. Identificação de longo prazo de ratos usando Tatuar as almofadas das patas

  1. Imobilizar a pata com (superfície plantar) a almofada da pata de frente para o experimentador. Segurar a pata com o polegar e o dedo indicador. Tenha cuidado para não apertar a pata.
    NOTA: a imobilização estável é importante para garantir que o pigmento tatuagem é colocado na derme da almofada da pata, e assim é permanente 7.
  2. Limpar a almofada da pata com 70% de etanol em uma esponja ou um chumaço de gaze.
  3. Aplique óleo de pele para um aplicador com ponta de algodão, e pressione suavemente a ponta contra a superfície do pad pata várias vezes. Use apenas uma pequena quantidade de óleo da pele; quando presentes em grandes quantidades, vai impedir que o pigmento tatuagem de atingir a pele.
  4. Mergulhar as pontas das agulhas de tatuagem na tinta imediatamente antes tatuagempara tatuagem. Use limpa, asséptica e agulhas de tatuagem afiadas, para diminuir a dor e a possibilidade de infecção, e também para aumentar a eficiência de tatuagem.
  5. Enquanto a superfície da almofada da pata é coberto com o óleo da pele, pressione as pontas das agulhas de tatuagem verticalmente e levemente contra a pele no centro da almofada da pata, e injetar a tinta várias vezes. Veja a tabela de materiais / equipamentos para obter informações sobre o sistema de tatuagem elétrica.
  6. Spray de etanol a 70% em uma gaze, pressione-a contra a pata para remover o pigmento da tatuagem extra na superfície da pele, e inspecionar a qualidade da tatuagem. Verifique se o meio de almofada pata tem uma mancha escura, redonda que difere da pigmentação normal da pele. Se a tatuagem não é escuro ou grande o suficiente para facilitar a visualização, repita os passos de tatuagem anteriores.

2. Ratos Genotipagem neonatal, recorrendo a uma rápida Kit PCR Genotipagem

  1. Desinfectar a extremidade distal de uma cauda de rato com etanol a 70%, cortadas em 5 mm ou menos da caudaponta e transferi-lo para um tubo de uma tira de 8 tubo, do tipo utilizado para a PCR. Use uma lâmina de barbear usadas-un para cada cachorro para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. Em alternativa, usar um par de tesouras, mas, neste caso, com cuidado e remover completamente o tecido remanescente sobre as lâminas utilizando etanol a 70%. Verifique se há sangramento. Se ocorrer sangramento, aplique pressão à parte corte da cauda com uma gaze até sangramento parou.
  2. Adicionar 200 uL de solução de ADN A extracção a cada tubo de PCR contendo um espécime. Veja a tabela de materiais / equipamentos para a sua composição e informações sobre o kit.
  3. Colocar a tira tubo num termociclador de PCR, e iniciar a extracção de ADN utilizando o seguinte programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, e mantendo a 4 ° C.
    NOTA: Este é o mesmo termociclador PCR que é usado mais tarde para PCR.
  4. Após a extração de DNA for concluído, remova a tira tubo do reciclador uma térmicand inverter 5 vezes.
  5. Transferência de 4 mL da solução (extracto de ADN) de cada amostra para um tubo de un-utilizado de uma tira de 8 tubo, e misturar-se com: 10 ul de 2X PCR Ready Mix II, 2 ul de mistura para a frente & iniciadores reverse (recomendado pelo 0,5 m; veja a tabela dos materiais / equipamentos para as sequências), e 4 l de livre de nuclease H 2 O, para cada espécime. Mexer um pouco (por exemplo, 3 segundos) usando uma centrífuga de bancada. Manter os tubos em gelo em todos os momentos, exceto quando do manuseio.
  6. Executar ciclos térmicos. Ver Tabela de materiais / equipamentos para o programa térmico.
  7. Detectar os produtos de ADN amplificados. Carregar a solução de reacção total a partir do PCR (20 uL) directamente dentro de um poço de um gel de agarose. Carregar os marcadores de peso molecular em um poço separado. Aplicar um campo eléctrico.
  8. Adquirir imagens de fluorescência das bandas com luz ultravioleta.

3. cultura primária de cérebro do rato Neurons em glial Feeder Camada

NOTA: Os procedimentos para a dissecação do cérebro e de dissociação de células (3,1) são comuns a todos os procedimentos subsequentes. Os procedimentos para as culturas do mouse gliais (3.2), culturas gliais de rato (3,3), e do rato culturas neuronais (3.4) são descritos separadamente mais tarde.

  1. Cérebro Dissection e Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar um rato ou ratazana filhote por decapitação, remove-se rapidamente o cérebro, e colocá-lo em solução de Hanks (ver Tabela 1 para a composição) + 20% de soro fetal bovino (FBS) numa placa de 35 mm (mantido em gelo).
    2. Corte o cérebro através da linha média em dois hemisférios. Remover a região de interesse (por exemplo, do córtex cerebral, corpo estriado e hipocampo) de cada hemisfério do cérebro. Retire as meninges e os principais vasos sanguíneos a partir da superfície. Corte a região do cérebro em 10/04 fatias finas usando uma lâmina cirúrgica.
    3. Enxaguar as fatias de cérebro num tubo de centrifugação de 15 ml, uma vez wit'solução de + 20% de FBS, em seguida, 3 vezes, com o Hanks h Hanks solução (isto é, sem soro) (todos a 4 ° C). Para enxaguar, adicionar 5-10 ml de solução, deixe o cérebro fatias assentar no fundo do tubo, aspirar a solução a partir do topo, e adicionar uma solução fresca. Finalize o procedimento de lavagem por aspiração da solução.
    4. Filtro de 2 ml da solução de digestão contendo tripsina (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente no tubo que contém as fatias de cérebro. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min à temperatura ambiente.
    5. Neutraliza-se a solução de tripsina primeiro aspirando a maior parte dela e, em seguida, pela adição de 7-10 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C).
    6. Enxaguar as fatias de cérebro, duas vezes com Hanks solução de + 20% de FBS, e depois três vezes com o Hanks solução (ou seja sem soro) (todos a 4 ° C). Finalize o procedimento de lavagem, aspirando a solutde iões.
    7. Filtro de 2 ml da solução de dissociação (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para o tubo com as fatias de cérebro.
    8. Mecanicamente dissociar as células por trituração suavemente 10-20 vezes, até que pedaços de tecido visível desaparecer. Use um, fogo-polido Pasteur pipeta conectado-algodão e evitar fazer bolhas durante a trituração.
    9. Espere 3 min para as pequenas peças para sossegar.
    10. Transferir a maioria da solução (~ 1,5 mL, deixando alguma solução na parte inferior) para um tubo de centrifugação de 15 ml, que contém 3 ml de solução de Hanks solução de FBS + 20% (4 ° C), utilizando-se conectado a-algodão, fogo pipeta Pasteur polida. Não transferir toda a solução, porque a inclusão de qualquer sedimento no fundo tipicamente resulta na deterioração da cultura.
    11. Centrifugar durante 13 minutos a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente,adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento médio (37 ° C) para o sedimento, e ressuspender que pipetando suavemente várias vezes usando o ligado-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur.
      NOTA: Três tipos diferentes de plaqueamento media são utilizados para fins de cultura diferentes: chapeamento de médio 1 para células gliais do mouse, chapeamento de meio-2 para os neurônios de rato, e plaqueamento de médio 3 para os neurônios de ratos e células gliais (ver Tabela 1 para composições) .
    13. Retire 10 ul da suspensão celular, misturá-la com 10 ml de solução de azul de tripano a 0,4%, e medir a densidade de células vivas, utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
  2. Cultures Rato da glia
    1. Lave as lamelas para ajudar a estabelecer culturas de células de ratos saudáveis.
      1. Mergulhe lamelas de vidro (redondo, 12 mm de diâmetro) em ácido nítrico a 70% em uma placa de Petri de vidro. Proteger da luz usando papel alumínio e coloque-o em um shaker orbital O / N.
      2. Lavar o coversli vidrops na placa de Petri, pelo menos, três vezes com água destilada. Mergulhe-os em água destilada. Coloque o prato em um shaker orbital O / N.
      3. Seque as lamelas em um papel de filtro Whatman 150 milímetros na cabine de segurança biológica.
      4. Autoclave as lamelas.
      5. Coloque as lamelas em 24 poços cultura prato.
    2. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    3. Obter as células do cérebro dos filhotes de rato, de acordo com a etapa 3.1.
      NOTA: O uso do córtex cerebral é típico para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o hipocampo e estriado, funcionará após o ajuste adequado da densidade celular devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    4. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 para a suspensão final de células (~ 1 mL). Por meio de cultura de pré-aquecimento, coloque a solução na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C) S / N, apermitir que os valores de temperatura e pH para estabilizar.
    5. Transferir a suspensão celular a um balão de cultura T25 não revestido, utilizando o plugado-algodão, fogo-polido Pasteur pipeta. Colocar o balão na incubadora cultura.
    6. Fim de 1 dia in vitro (DIV), lavar as células cultivadas no frasco T25 duas vezes com meio de plaqueamento-1 (4 ° C). Colocar o balão de volta na incubadora. Realizar a lavagem por aspiração do meio dentro do frasco completamente com uma pipeta de Pasteur, a adição de ~ 5 ml de meio fresco e inclinando gentilmente o balão várias vezes em um movimento giratório.
    7. Em 6-9 DIV, (isto é, um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas, em passos 3.2.8-3.2.13), 100 ul de colocar o material de revestimento com proteínas da matriz extracelular (ver Tabela de Materiais / Equipamento para comentários sobre o material de revestimento) sobre as lamelas de vidro em um prato de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
    8. Em 7-10 DIV, quando as células são 20-40% confluentes (espacialmente contínua), trypsinize eles.
      1. Lavar o balão de uma só vez, por aspiração de toda a solução dentro do frasco e adicionando ~ 13 ml de solução de Hanks (4 ° C), incline suavemente o frasco várias vezes em um movimento giratório, e aspirar a solução completamente.
      2. Adicionar 40 ul de solução de ADNase (concentração final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solução de tripsina-EDTA, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para as células do frasco.
      3. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min a 37 ° C na incubadora.
      4. Neutraliza-se a solução de tripsina por adição de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) para o balão.
      5. Transferem-se as células tratadas com tripsina para um tubo de centrifugação de 15 ml usando um de 5 a 10 ml de pipeta, adicionar ~ 4 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C), centrifugar a ~ 185 g e 4 ° C durante 13 min e aspirar o sobrenadante.
    9. Ressuspender o sedimento em 1 ml de pré-warmemeio-1 d chapeamento.
    10. Medir a densidade das células de acordo com o passo 3.1.13.
    11. Aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro, e a placa de ~ 50 ul de células gliais ressuspensas em lamelas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    12. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora.
    13. 20-60 min mais tarde, adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora. Nota: Embora o meio de revestimento é adicionada, será útil para utilizar outra pipeta para pressionar para baixo da periferia da lamela (onde não existem células plaqueadas), de modo que a lamela não irá flutuar no meio.
    14. Em 1 DIV da camada alimentadora glial (ou seja, na lamela de vidro), substituir o meio com 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1, aspirando-se toda a solução em um poço e depois enchendo-a com meio fresco.
    15. Em 2-3 DIV da camada alimentadora da glia, quando o cells são 80-100% confluentes, adicionar inibidor mitótico (10 ul de uma mistura de 5-fluoro-2'-desoxiuridina + uridina; concentrações finais de 81,2 e 204,8? M, respectivamente) a cada poço, para inibir a replicação do ADN e, por conseguinte, a suprimir a proliferação de células gliais.
    16. Em 7-9 DIV, quando as células são 90-100% confluentes (1-2 h antes do plaqueamento neurónios na camada alimentadora glial), substituir o meio de cultura com pré-aquecido plaqueamento meio-2 (37 ° C).
      NOTA: Os neurónios vai ser revestida no mesmo dia, utilizando o passo 3.4.
  3. Cultures Rat gliais
    1. Bata de um frasco de cultura T25 com o mesmo material de revestimento.
      NOTA: É necessário para posterior remoção das células não aderentes no passo 3.3.5.
      1. Adicionar 2.0 ml do material de revestimento para o balão, e colocar o balão no incubador de cultura.
      2. Após 2-3 h, aspirar o material de revestimento completo, de tal modo que o piso do frasco torna-se seca.
    2. Obter as célulasdas crias de rato, de acordo com o passo 3.1.
      NOTA: A região CA3-CA1 do hipocampo é usado para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o córtex cerebral e corpo estriado, vai funcionar depois de se ajustar para diferenças na densidade das células, devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    3. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-3 para a suspensão de células final (~ 1 mL).
    4. Transferir a suspensão de célula para o balão de cultura T25 revestidos, utilizando-se conectado a-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur. Colocar o recipiente na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C).
    5. Em 2-3 DIV, quando as células são 20-40% confluentes, remover não-aderente ou fracamente células aderentes, fechando a tampa firmemente, agitando vigorosamente ~ 10 vezes, aspiração da solução, e a adição de 4-5 ml de chapeamento 3-forma (a 4 ° C). Repita este procedimento uma vez. Examine as células cultivadas em todo o piso balão (por exemplo,usando microscópio de contraste de fase) para confirmar que as que aparecem neuronal (ou seja, aqueles para os quais a borda exterior do corpo da célula aparece fase brilhante) são completamente removidas. Repita o procedimento quantas vezes for necessário para eliminar essas células, e em seguida, retornar o frasco para a incubadora.
      NOTA: A força e o número total de "shakes" necessários podem variar entre experimentadores individuais. O importante é não manter o número total de shakes para um número definido, mas para confirmar que as células neuronais-like são eliminados.
    6. No 6-8 DIV, quando as células são 90-100% confluentes, a passagem das células gliais por trypsinizing-los como no passo 3.2.8.
    7. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), adicionam-se 10 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), transferência das células tratadas com tripsina para um balão T75 não revestida, e em cultura deles a incubadora.
      NOTA: as células gliais Rato será passadas duas vezes; em contraste, as células gliais de rato are passadas apenas uma vez, porque eles se tornam insalubres após várias passagens. Células gliais de rato vai ser passadas em frascos T75 que não são revestidas com qualquer material de revestimento. O revestimento permite que as células da glia de ratos a crescer muito rapidamente e produzem muitas células ciliadas (células ependimárias putativos), que irá deteriorar-se a condição de cultura neuronal mais tarde.
    8. Em 17-19 DIV de cultura num balão de glial (isto é, 11 dias após passaging e um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas de cobertura por passos 3.3.9-3.3.14), 100 ul de colocar o material de revestimento em lamelas de vidro não lavadas ( redondo, 12 mm de diâmetro) numa placa de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
      NOTA: Para as culturas da glia de ratos, a diferença não foi notado nos resultados de cultura com ou sem lavar as lamelas.
    9. Em 18-20 DIV da cultura glial no frasco (ou seja, 12 dias após passaging), prepare a camada de alimentação glial por trypsinizing as células cultivadas, de acordo com step 3.2.8.
    10. Durante a centrifugação, aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro.
    11. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), e medir a densidade de células, de acordo com o passo 3.1.13.
    12. Ajustar a densidade de 10 4 glial vivo células / ml, e a placa 100 uL da suspensão de células glial nas lamelas de vidro revestidas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    13. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora por 20-60 min.
    14. Adicionar 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C) a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora.
    15. Em 3-4 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células na lamela são 40-80% confluentes, adicionar 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ver Tabela 1 para a composição) que contém citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentração final de 4 mM) para parar a proliferação de células gliais. Placa neurônios a 7-9 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células são 60-80% confluente, utilizando o passo 3.4.
  4. Cultures Rato Neuronal
    1. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    2. Use os filhotes de rato para o passo 3.1.
    3. Ajuste a densidade da suspensão de células ao vivo para ~ 2,0 x 10 5 células / ml, utilizando pré-aquecido chapeamento meio-2 para plaqueamento em células gliais do mouse, ou usando o plaqueamento meio-3 para plaqueamento em células gliais de rato.
    4. Placa as células na camada alimentadora glial, adicionando suavemente a suspensão de células para o meio de cultura de cada poço. Nota: O volume da suspensão celular a ser adicionada é determinada pelo número de células alvo num poço de cultura. Por exemplo, a placa de ~ 60 ul de suspensão de células para atingir 12.000 células / poço.
    5. Note-se que não há solução muda são necessárias após os neurônios são banhados. Ter cuidado para evitar a evaporação da solução das cavidades ao longo do curso da cultura, por humedecimento do o interiorf incubadora de cultura.

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Representative Results

Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais.

Tatuagem

Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem ('recém-nascido' na Figura 1). Os rótulos permaneceu claramente visível em 3 semanas 32 semanas de idade ('3 semanas de idade) e ('32 -week-old'). A ratinhos individuais pode ser identificada exclusivamente por uma combinação de tatuagens nos quatro patas (números 1-16) e por as informações sobre a gaiola de animais, ou esquemas de numeração mais complexas (não mostrado).

Genotipagem

Um exemplo representativo de genotipagem é mostrado (Figura 2). O gene Tor1a de tipo selvagem (Tor1a (Tor1a + / AE) e homozigoto (Tor1a AE / AE) AE-torsinA knock-nos ratos foi amplificado a partir do DNA genômico isolado de clips da cauda de filhotes recém-nascidos. Genotipagem neste exemplo específico é baseada na presença de um único sítio loxP de 34 pares de bases no alelo mutante após Tor1a sucesso a recombinação Cre e eliminação de uma cassete de resistência à neomicina 16,18.

DNA genômico foi extraído com as mãos sobre o mínimo de tempo, e muitas amostras foram processadas simultaneamente. Os volumes de extracção foram mantidas constantes, e, por conseguinte, qualquer ajustamento do volume foi necessário para acomodar as alterações nas condições testadas. A fiabilidade de genotipagem foi testada em quatro condições, como detalhado abaixo.

Em primeiro lugar, o efeito de diferenças na quantidade de partida de tecido foi examinada (Figura 3). As caudas de diferentes comprimentos erampreparado a partir do heterozigoto AE-torsinA knock-nos ratos (Tor1a + / AE) ao desmame (~ 3 semanas). Comprimentos de cauda de 2 a 5 mm, o intervalo tipicamente recomendada em protocolos de genotipagem, deram o mesmo resultado de genotipagem de alta qualidade. As duas bandas correspondem ao tipo selvagem e os alelos mutantes (Tor1a + Tor1a e AE, respectivamente).

Em segundo lugar, os efeitos da variabilidade na idade dos animais foram examinados (Figura 4). As caudas foram obtidos a partir de recém-nascidos, com 3 semanas de idade e ~ 24 semanas de idade, AE-torsinA heterozigótica ratinhos knock-in (Tor1a + / AE). Homozigotos não foram utilizados porque morrem alguns dias após o nascimento 16-18. As duas bandas esperadas para o tipo selvagem e genes mutados Tor1a eram visíveis, independentemente da idade do animal (Figura 4A). A aplicabilidade geral deste resultado foi testada usando um segundo gene, Tfap2a 19 em wild-tratinhos Ype (Tfap2a + / +) (Figura 4B).

Terceiro, os efeitos das diferenças no comprimento dos amplicões PCR foram testados (Figura 5). Para este efeito, os diferentes pares de iniciadores foram sintetizados por um determinado gene, de tal forma que os DNAs amplificados são de comprimentos diferentes dos pares de bases. O gene Tfap2a foi consistentemente detectados com diferentes comprimentos amplicon.

Em quarto lugar, dois métodos de extracção de ADN foram comparadas (Figura 6). Num método, foram utilizados tubos de tiras de PCR e o termociclador de PCR (descrito no passo 2). Este é um, multi-tubos método de extracção paralela automatizada ("Automático" na Figura 6). Uma vez que vários tubos podem ser feitos simultaneamente, em formato de tira, e uma máquina de PCR é utilizado com um programa para operar em quatro passos de temperatura, não há necessidade de transferir os tubos, manualmente alterar a temperatura durante a extracção ou utilizar várias peçasde equipamento. Assim, é fácil de processar muitas amostras. Este resultado foi comparado com o segundo método, com base, extracção de um único tubo manual ("Manual" na Figura 6). Este utiliza tubos individuais de PCR e máquinas não-PCR separadas (blocos de calor e banhos de água) para controlar a temperatura durante a extração de DNA. Neste caso, múltiplos, tubos individuais foram transferidas para uma nova temperatura após cada passo, que exige múltiplos aparelhos de controlo da temperatura. Em ambos os casos, o gene Tor1a foi analisada no tipo selvagem, heterozigóticos e homozigóticos AE-torsinA ratinhos knock-in (Figura 6A), e o gene Tfap2a foi analisado em ratinhos do tipo selvagem (Figura 6B). Os dois protocolos de extracção produziu resultados de genotipagem equivalentes.

Em resumo, os resultados apresentados nas Figuras 3 a 6 demonstram que o método de genotipagem é robusta, a obtenção de resultados fiáveis ​​e reprodutíveis, apesar de variations em quantidade de tecido, a idade do animal, comprimento amplicon, e do protocolo de extração utilizado.

Culturas neuronais

Para a cultura de neurônios de rato na camada de alimentação do rato glial, a ordem dos procedimentos é: (a tatuagem recém-nascido camundongos → genotipagem para a cultura glial →) cultura glial → tatuagem recém-nascido camundongos → genotipagem para a cultura neuronal → cultura neuronal. Para culturas estabelecidas na camada de alimentação glial rato, os procedimentos em parênteses são ignorados.

Examinamos o efeito favorável da camada de alimentação glial pré-semeado na sobrevivência neuronal e crescimento. Os neurónios foram obtidos a partir da região CA3-CA1 do hipocampo, a região do motor do córtex cerebral e o corpo estriado de ratos recém-nascidos de tipo selvagem. Eles foram plaqueadas a baixa densidade em camada alimentadora de células gliais de rato que tinha sido obtido a partir da região CA3-CA1 do hipocampo e semeados antes da metalização neuronal, conformeo esquema ilustrado na Figura 7 (resumo simplificado dos procedimentos). Culturas de baixa densidade são ótimas para a imagem dos dendritos individuais, somata 4,6, terminais nervosos 2,3,5,8 e 5 eixos axonal em alta resolução espacial. As células do hipocampo (contendo ambos os neurónios e células da glia) foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas, ou com (Figura 8A) ou sem uma camada alimentadora glial pré-estabelecido (Figura 8B, C) ​​e observada com óptica de contraste de fase. Na presença de uma camada alimentadora glial quase confluentes, os neurónios (em cada painel, uma ponta de seta indica um neurónio representante) foram relativamente disperso 3 e 7 dias após o plaqueamento (dias in vitro, DIV) (Figura 8A). Eles também mostraram sinais de boa saúde, como uma clara margem de somata neuronal, dendrites estendidos, a falta de somata agrupado, e uma falta de neurites empacotados (imag de grande ampliaçãoes em inserções). Aos 14 DIV, esses neurônios formou uma densa rede caracteriza-se por neurites longas (dendritos e axônios). Note-se que a proliferação da glia foi inibida antes neurónios foram plaqueados, pela adição de meio de crescimento contendo o AraC inibidor mitótico (passo 3.3.15).

Em contraste, na ausência da camada alimentadora glial no momento do plaqueamento neurónios do hipocampo, o crescimento dos neurónios do hipocampo em cultura foi prejudicada, mesmo na ausência de AraC. Aos 3 DIV, as células gliais (incluídos nas células do hipocampo recém-banhado) não formaram uma folha confluente (asterisco no painel superior da Figura 8B). As culturas mostraram vários sinais que não são apropriados para estudos de imagiologia de alta resolução, tais como áreas largas sem células gliais subjacentes (asterisco), a presença de somata agrupado e a presença de neurites agrupados em algumas áreas (dados não mostrados). Até 7 de DIV, as células gliais formada uma folha confluente (painel do meio da Figura 8C). However, os neurônios foram em menor número do que quando os neurônios foram semeadas em uma camada de alimentação pré-estabelecida glial. Os neurônios sobreviventes também não dispunha, neurites de formação de rede de longa (no detalhe). As células da glia estavam mais heterogéneo em curvatura e espessura do que os da cultura camada alimentadora, aparecendo assim fase brilhante. A fim de testar o efeito de suprimir a proliferação de células gliais em neurónios, foi aplicado AraC contendo meio de crescimento. Quando AraC foi adicionado em 3 ou 7 e DIV as células foram cultivadas até 14 DIV e observado neste dia (Figura 8B e C, painéis inferiores), as células gliais cobriam a maior parte da superfície da lamela. No entanto, os neurônios ainda eram poucos em número, especialmente quando AraC foi aplicada em 7 DIV. Os neurônios sobreviventes tinha apenas processos curtos e não foram amplamente conectado. Assim, a adição tardia de AraC permitiu uma camada uniforme para formar gliais, mas não promoveu a viabilidade neuronal ou a extensão de neurite; em vez do crescimento glial descontroladateve efeitos deletérios sobre os neurônios.

Estes dados mostram que a camada alimentadora glial é crítico para a sobrevivência e crescimento dos neurónios plaqueados a baixa densidade, e que a camada glial deverá estar presente na altura do plaqueamento neuronal, em vez de mais tarde, durante a cultura neuronal. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando culturas de cortical cerebral (Figura 9) e neurónios do estriado (Figura 10).

A observação qualitativa sobre a sobrevivência neuronal foi confirmada por análise quantitativa. Especificamente, o número de neurónios sobreviventes em 14 DIV foi contado, com base em imagens de contraste de fase das culturas (Figura 11). O número foi maior para neurônios cultivados em uma camada de alimentação glial (ie., Banhados na camada de alimentação glial). O número foi inferior no caso dos neurónios cultivados na ausência de uma camada alimentadora de células gliais. O número foi ainda mais reduzido quando as células foram tratadas com AraC numatempo mais tarde. Essas diferenças foram estatisticamente significantes, e foram observados em culturas de neurônios obtidos a partir de todas as três regiões do cérebro.

Foram identificados os tipos de células sobreviventes aos 14 DIV no rato culturas do hipocampo banhado na camada rato alimentador do hipocampo. Duplo-imunocitoquimica foi efectuada utilizando anticorpos contra o marcador neuronal, a proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2), e o marcador de células gliais de astrócitos, a proteína glial fibrilar ácida (GFAP). As células com processos avançados foram positivas para MAP2, enquanto que as células na camada de alimentação subjacente glia foram positivas para GFAP (dois campos de imagem representativos, Figura 12A). Esta coloração não era um artefacto de uma combinação específica de anticorpos primários e secundários, uma vez que o mesmo padrão foi obtido quando um conjunto diferente de anticorpos secundários foi utilizado (Figura 12B).

Em contraste, quando a mesma coloração foi performou sobre as culturas que consistem em apenas uma camada de alimentação glial, ou seja, na ausência de células de camundongo adicionado (dois campos de imagem representativos, Figura 13a), sem células foram positivas para MAP2. As células da camada de alimentação foram consistentemente positivas para GFAP. Para um controlo negativo, ambos os anticorpos primários foram omitidos do processo imunocitoquímico (Figura 13B). Sem coloração foi detectado nestas amostras, embora as células estavam presentes, como é evidente a partir da ótica de luz transmitida (contraste de interferência diferencial, DIC) e de coloração nuclear com corante Hoechst. Assim, a coloração não específica dos canais de MAP2 e GFAP era muito fraco.

Estes dados de imunocitoquímica também foram analisados ​​quantitativamente (Figura 14). Em cada imagem de 8-bit, intensidade foi medida e representada graficamente ao longo de uma linha. Parcelas sobrepostas revelar coloração MAP2 quando células de camundongo (amostras contendo neurônios) foram cultivadas em uma camada de alimentação glial (Neuron +,glia +, o anticorpo primário (1 ° Ac) +), ao passo que tal coloração estava ausente em culturas de células de alimentação glial sozinho (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). Em um controle negativo, sem anticorpos primários, a coloração foi insignificante em culturas de células de alimentação glial sozinho (neurônio -, glia +, 1 ° Ab -). Coloração GFAP era aparente na camada alimentadora glial, independentemente do facto de as células de rato foram plaqueadas (Neuron +, células gliais +, 1 ° Ab +) ou não (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). Mais uma vez, a coloração no controle negativo foi insignificante (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Estes resultados mostram que a camada de rato alimentador gliais era composta principalmente de astrócitos, e que os neurónios estavam presentes apenas quando foram adicionadas células de ratinho. Eles também indicam que os neurónios presentes nestas culturas origem apenas a partir de rato.

A seção de resultados do vídeo on-line também mostra as imagens DIC e MAP2 de neurônios cultivados banhado em uma camada de alimentação glial, both preparado a partir da região do hipocampo CA1-CA3 de ratinhos de tipo selvagem.

Para um controlo minucioso da cultura de células, é recomendado para medir a densidade de células vivas, tanto para avaliar a qualidade geral do cérebro e dissecção passos de dissociação celular, e para o plaqueamento das células a uma densidade pré-determinada. Listados abaixo são quatro conjuntos de medidas de densidade típicos. Note-se, contudo, que esses números podem variar dependendo das condições de cultura e reagentes. Por exemplo, mesmo diferentes lotes de soro provenientes do mesmo fornecedor podem afectar os resultados. Assim, estes números devem ser considerados um indicador geral, em vez de uma orientação absoluta.

Para dissociação celular (passo 3.1.13), os valores típicos para a densidade de células ao vivo obtida a partir de um filhote de cachorro são: ~ 2 x 10 5 células / ml (rato do córtex motor e mouse CA3-CA1 do hipocampo), ~ 5 x 10 5 células / ml (córtex cerebral do rato e rato hipocampo CA3-CA1) e ~ 1 x 10 6 cells / ml (rato estriado). Em todos estes casos, as fracções de células vivas foram> 90% (viabilidade, definido como a razão entre o número de células vivas para que do número total de células). O córtex motor é vagamente definida como a região do córtex cerebral que jaz dorsal imediatamente para o estriado 20. Para as culturas de hipocampo, as regiões CA3 e CA1 do hipocampo apropriada são preferidos. Todo o hipocampo inclui adicionalmente o giro denteado, a inclusão de qual conduz à formação de terminais nervosos grandes de células granulares e introduz heterogeneidade nas propriedades sinápticos 21. A cultura do estriado inclui o caudado-putâmen e globus pallidus, mas não inclui o nucleus accumbens, ou medial ou núcleos septais laterais nas estruturas vizinhas.

Para a cultura de células gliais de rato (passo 3.2.11), a densidade de revestimento é ~ 10.000 células gliais em cada lamela rodada de 12 mm, usando ~ 50 ul de suspensão de células a uma densidade de 2 x ~10 5 células / ml. Normalmente, a densidade medida no sobrenadante é relativamente constante e não necessita de ajustamento. Para converter a densidade em áreas diferentes, a informação é útil que a lamela tem um diâmetro de 1,20 centímetros e uma área de 1,13 cm2. Assim, ~ 10.000 células / lamela = ~ 8800 células / cm 2 sobre uma lamela.

Para rato cultura glial (passo 3.3.12), a densidade de revestimento é ~ 1.000 células gliais em cada lamela rodada de 12 mm, usando ~ 100 ul de suspensão de células a uma densidade de 1x10 ~ 4 células / ml. Assim, 1.000 células / lamela = ~ 900 células / cm2 em lâminas.

Por rato de baixa densidade de cultura neuronal (passo 3.4.4), a densidade de revestimento varia entre 2.000 e 48.000 células por poço de uma placa de 24 poços. Os valores típicos quando chapeamento neurônios em células gliais de rato são: 10,000-24,000 células / poço para os neurônios do córtex cerebral, 12,000-24,000 células / poço para CA3-CA1 neurônios do hipocampo e 24,000-48,000 células / poço para neurónios do estriado. Quando plaqueamento em células gliais de rato, o número é reduzido, por exemplo, 2.000 células / poço para CA3-neurónios do hipocampo CA1. Como uma nota lateral, para chapeamento rato CA3-CA1 neurônios do hipocampo em uma camada de alimentação glial rato, a densidade de revestimento é 1,000-6,000 células / poço. Para converter a densidade de um poço para a densidade sobre uma lamela, a informação útil é que o diâmetro interno bem na parte inferior é 1,56 centímetros e a sua área é 1.91 cm2. Assim, por exemplo, 12.000 células / poço = 7100 células / lamela = 6300 células / cm2 em lâminas. Estas densidades foram escolhidos com o objetivo de cultivar neurônios relativamente escasso em alta resolução de imagem celular. Os pesquisadores devem escolher seus números que melhor atendam seus objetivos experimentais.

Figura 1
Figura 1. almofadas das patas Tattooed de camundongos. Ncamundongos ewborn foram marcados por uma tatuagem as almofadas das patas. Eles foram fotografados imediatamente após a tatuagem (recém-nascido), com 3 semanas de idade (com 3 semanas de idade) e com 32 semanas de idade (32 semanas de idade). Os rótulos permaneceu facilmente visível durante a vida adulta. As imagens foram colhidas de diferentes animais. Eles não são mostrados na mesma escala. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A genotipagem do tipo selvagem (Tor1a + / +), heterozigótico (Tor1a + / AE) e homozigóticos (Tor1a AE / AE) AE-torsinA ratinhos knock-in. Os alelos do gene Tor1a foram analisadas em tipo selvagem e mutante formas, utilizando DNA extraído das caudas dos filhotes recém-nascidos. Tdicas foram ail ~ 4 mm de comprimento. DNA foi corado com SYBR Seguro DNA Gel Stain. Veja a Tabela de materiais / equipamentos para as informações sobre os primers e programa de ciclos térmicos para gene Tor1a. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Detecção do ADN genómico no contexto da variação na quantidade de material de partida. Pontas de cauda de diferentes comprimentos foram usadas. Animais testados foram de 3 semanas de idade, heterozigotos AE-torsinA knock-nos ratos (Tor1a + / AE). Lanes representam os comprimentos da cauda de 2, 3, 4 e 5 mm, em duplicado (a partir da esquerda). As pontas da cauda foram obtidos a partir de ratos diferentes. Marcadores de tamanho peso molecular na faixa mais à esquerda representam DNA comprimentos em sPET de 100 pares de bases. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Detecção de ADN genómico no contexto da variação na idade do animal. Gene (A) Tor1a. Lanes representam pontas da cauda obtidos a partir de AE-heterozigótica torsinA ratinhos knock-in (Tor1a + / AE) com as seguintes fases: recém-nascidos, 3-semanas de idade, e ~ 24 semanas de idade (em duplicado a partir da esquerda) (B). Tfap2a gene. Lanes representam pontas da cauda obtidos a partir do tipo selvagem (Tfap2a + / +) ratos, das seguintes fases: recém-nascido, 3 semanas de idade, e ~ 24 semanas de idade (em duplicado a partir da esquerda). Ambos os genes foram amplificados a partir de caudas ~ 4 mm de comprimento. O fragmento de PCR esperado é 498 pb. O wa programa PCR é o mesmo que o utilizado para gene Tor1a. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Detecção de ADN genómico no contexto da variação do comprimento do fragmento amplificado por PCR. O gene Tfap2a foi analisada com comprimentos amplicon de PCR de 498 pb (pistas da esquerda), 983 bp (faixas centrais) e 1990 pb (colunas da direita) em duplicatas. O gene foi amplificado a partir de caudas de ratinhos de 3 semanas de idade. Marcadores de tamanho de peso molecular nas pistas mais à esquerda e mais à direita do gel representam comprimentos de ADN em passos de 100 e 200 pares de bases, respectivamente. Veja a Tabela de materiais / equipamentos para obter informações sobre os primers para diferentes amplicons. "Target =" _ 879fig5highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Detecção de ADN genómico no contexto da variação do método de extracção de ADN. Os resultados para o manual, único tubo de extracção (manual) e os métodos de extracção automatizadas, multi-tubos paralelos (Auto) são comparados. O último método foi utilizado ao longo deste relatório. Os genes foram amplificados a partir de caudas ~ 4 mm de comprimento, recolhidos a partir de recém-nascidos. (A) do gene Tor1a em crias recém-nascidas de AE-torsinA ratinhos knock-in. Lanes representam ADNs extraídos a partir do tipo selvagem (manual e automatizado), heterozigótico (manual e automatizado), e os ratinhos homozigotos (manual e automatizado) (a partir da esquerda). (B) do gene Tfap2a em 3 semanas de idade, os ratinhos do tipo selvagem. O fragmento de PCR esperado é 498 pb."target =" _ jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. simplificado, ilustração esquemática dos processos de plaqueamento em neurónios de rato de ratinho (A) e de rato (B) camadas alimentadoras gliais. Os números de dias (dias in vitro) referem-se aos dias acumulados após as células gliais são plaqueadas pela primeira vez em cultura frascos. Eles servem apenas como uma estimativa aproximada. Para mais informações práticas, ver os procedimentos seção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8. efeito de suportede camada alimentadora glial no crescimento de neurónios do hipocampo em cultura de baixa densidade. Os neurónios foram obtidos a partir da região CA3-CA1 do hipocampo do recém-nascido, ratinhos de tipo selvagem. As células do hipocampo (A) do rato foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas, as quais tinha sido previamente semeada com uma camada alimentadora de células gliais de rato obtido a partir da região CA3-CA1 do hipocampo. Os neurônios foram dispersos uniformemente em uma maneira saudável. As culturas foram observadas nos dias 3, 7 e 14 DIV. As células do hipocampo (B, C) ​​do rato foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas, que não tinham qualquer camada de alimentação pré-estabelecida. As culturas foram observadas em 3 DIV (painel superior em B) e 7 DIV (painel do meio em C), sem tratamento AraC. Em outros conjuntos de culturas, as células foram tratadas com AraC em 3 DIV (painel inferior em B) e 7 DIV (painel inferior em C), e observado em 14 DIV. Todas as imagens representam as culturas irmãs obtidos a partir do mesmo cachorro, cujos neurónios foram semeadas no mesmo dia. Veja o texto para mais detalhes. Para cada painel, um examplo de um neurônio é indicado por uma seta branca e ampliada em uma aposta. Os neurônios têm corpos celulares cujo perímetro parece brilhante quando visto pela óptica de contraste de fase, e eles também têm processos de espessura. Os asteriscos indicam áreas sem células gliais. As culturas foram fotografadas ao vivo em um microscópio invertido usando óptica de contraste de fase com 20X lente objetiva (abertura numérica de 0,45) sem uma lente intermediária (ou seja, em 1x). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9
Figura 9. efeito de suporte de camada alimentadora de crescimento glial em neurónios do córtex cerebral em uma cultura de baixa densidade. Resultados semelhantes aos da Figura 8, mas com os neurónios obtidos a partir da região do motor de ccórtex erebral. As condições sob as etiquetas AC correspondam aos da Figura 8. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10
Figura 10. Efeitos de suporte de camada alimentadora glial sobre o crescimento de neurónios do estriado, de uma cultura de baixa densidade. Resultados similares como nas figuras 8 e 9, mas com os obtidos a partir de neurónios do estriado. As condições sob as etiquetas AC correspondam aos da Figura 8. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. efeito de suporte de camada alimentadora glial na sobrevivência neuronal. O número de neurónios sobreviventes foi contado nas experiências mostradas na Figura 8, utilizando imagens obtidas por microscopia de contraste de fase. Imagens para 14 DIV são mostrados aqui novamente, mas com setas apontando para exemplos de neurônios contados. O gráfico de barras mostra o número de neurônios por campo de imagem (449,0 mm x 335,5 mm) (média ± erro padrão da média, n = 24/07 campos para cada condição de cultura). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas de «camada alimentadora glial (-), em 3 de AraC DIV" e "camada alimentadora glial (-), AraC em 7 DIV 'de' camada da glia alimentador (+) '(* p <0,05, ** p <0,01, teste t de Student não pareado). Os números acima das barras indicam a densidade neuronal medido em montagens de vários campos de imagem. Imagens eramadquiridos utilizando uma lente objetiva de 20X. Para evitar tendências de aquisição, todas as imagens foram adquiridas ao longo de uma faixa vertical completo, a partir do topo para o fundo de uma lamela e passando através do centro aproximado da lamela. Imagens individuais tinham alguma sobreposição (por exemplo, de 1/6 a 1/4 de um campo de imagem na parte superior e na parte inferior). Dois métodos foram utilizados para a análise. Em um deles, os neurônios foram contados em imagens alternadas para garantir que os neurônios individuais não foram contados mais de uma vez. Os números resultantes foram utilizados para gerar o gráfico de barras. No segundo método, um único conjunto foi criado a partir das imagens individuais. Eles foram costurados usando o Composite Editor Microsoft imagem ou manualmente usando o Photoshop. As montagens também excluídos múltiplas contagens de os mesmos neurônios. Os números resultantes estão listados acima das barras. Em ambos os métodos, vastas áreas na periferia lamela que não continham todas as células foram excluídos. As células foram contadas como se tivessem neurónios corpos celulares que apareceram brilhantepor microscopia de contraste de fase, assim como os processos celulares prolongados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12
Figura 12. imunocitoquímica identificação de tipos de células em culturas neuronais. A condição de cultura corresponde à imagem inferior esquerdo da Figura 8A. Os neurónios foram obtidos a partir da região CA3-CA1 do hipocampo de ratinhos do tipo selvagem, e plaqueadas sobre uma camada alimentadora de células gliais gerada a partir da região CA3-CA1 do hipocampo de ratos do tipo selvagem. As células em cultura foram analisados ​​por imunocitoquímica para o marcador neuronal MAP2, e o marcador de células gliais de astrócitos GFAP. Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) foi utilizado para revelar a morfologia geral dos campos fotografados, 14-17dias depois de os neurônios foram colocadas sobre a camada de alimentador glial. coloração (A) Três cores, incluindo contracoloração com o marcador nuclear Hoechst 33342 corante. Dois campos de imagem representativos são mostrados. Coloração (B) de duas cores, com diferentes combinações de anticorpos secundários conjugados com diferentes fluoróforos. Nestas experiências, as células em cultura foram fixadas com paraformaldeído a 4% e 4% de sacarose na solução de Tyrode (contendo, em mM: 125 de NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 de MgCl 2, 30 em D-glucose, 25 de HEPES, pH 7,4 ajustada com NaOH 5 M, ~ 310 mOsm sem ajuste) durante 30 min a 4 ° C. Depois de ter sido lavada com solução de Tyrode, que foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em solução de Tyrode durante 10 min. Eles foram novamente lavadas com solução de Tyrode e, em seguida, bloqueadas com 2% de soro normal de cabra em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (solução de bloqueio) durante 60 min à temperatura ambiente. Em seguida eles foram tratados com o poli coelhoanticorpo clonal anti-MAP2 (AB5622; 400x diluição em solução de bloqueio), e anticorpo monoclonal anti-GFAP cocktail (NE1015; 1.000x diluição) O / N (15-21 horas) a 4 ° C. Após lavagens com PBS, as células foram incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho e o anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa Fluor 405 (500x diluição em solução de bloqueio), Alexa Fluor 488 (1.000X) ou Alexa Fluor 568 corante (500x) de 60 min à temperatura ambiente. Eles foram lavadas com PBS e observados directamente em PBS. Em algumas culturas, após a lavagem final nos procedimentos acima, as células foram tratadas com Hoechst 33342 a 0,5 ug / ml em PBS durante 10 min à temperatura ambiente, e lavados com PBS antes da observação. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da presente figura.

Figura 13
Figura 13. Immunocytochemical identificação de tipos de células gliais em culturas de camadas alimentadoras. filiais culturas das camadas alimentadoras gliais de rato como na Figura 12, mas sem o revestimento de neurónios de rato. (A) coloração imunocitoquímica utilizando os procedimentos descritos na Figura 12A. Dois campos de imagem representativos são mostrados. (B) Coloração da camada alimentadora glial utilizando os procedimentos descritos no imunocitoquímicos A, mas com os anticorpos primários omitido. Todas as imagens MAP2 nas Figuras 12A e 13A, B foram adquiridas sob as mesmas condições de imagem, e são mostrados ao mesmo contraste de imagem para permitir a comparação de intensidade. Os mesmos procedimentos foram utilizados para imagens GFAP nas Figuras 12A e 13A, B. A cultura camada alimentadora glial foi representada por imagem no mesmo dia em que as culturas na Figura 12. Assim, as camadas alimentadoras em gliais 13 foram cultivadas in vitro para a mesma quantidade de tempo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14
Figura 14. A intensidade da coloração imunocitoquímica. Linhas foram desenhadas nas imagens mostradas nas Figuras 12 e 13, e a intensidade ao longo destes foi plotado. Inserções mostram imagens da linha de cima da figura 12A. As três condições foram: 1) chapeamento de células de camundongo (contendo neurônios) em uma camada de alimentação de ratos e coloração com os anticorpos primários (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +), 2) camada de alimentação glial apenas (sem chapeamento neuronal) e coloração com os anticorpos primários (neurônio -, glia +, 1 ° Ab +), e 3) alimentação glialer camada única (sem chapeamento neuronal) e coloração sem anticorpos primários (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Coloração neuronal (MAP2) estava presente apenas quando as células de rato foram plaqueadas (condições 1 versus 2), e a coloração da glia (GFAP) estava presente em ambos os conjuntos de condições de culturas (1 versus 2). A coloração immunocytochemical era específico para ambos os anticorpos primários (condições 1 vs. 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

SOLUTIONS
Tampão TAE (50x solução)
Base de Tris, 486 g
Ácido acético glacial, 114,2 ml
EDTA 0,5 M, pH 8,0, 200 ml
Adiciona-se água destilada para levar o volume total a 2 L
Certifique-se em um exaustor química.
Diluir 50 vezes antes de usar.
Solução de Hanks
Sais Equilibrada de Hanks, sem cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e bicarbonato de sódio (para 1 L)
NaHCO3, 350 mg (4,17 mM de concentração final)
HEPES, 2,38 g (concentração final, 10 mM)
Ajustar a pH 7,4 usando NaOH 5M.
Ajuste osmolaridade para 310 mOsm usando sacarose (Osmolaridade tende a ~ 290 mOsm sem nenhum ajuste).
Adiciona-se água destilada para levar o volume total a 1 L
Solução de digestão (para o tratamento de tripsina de tecido cerebral)
NaCl, 800,6 mg (concentração final, 137 mM)
KCl, 37,3 mg (fconcentração inal, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (concentração final, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (concentração final, 25 mM)
Glucose, 97,3 mg (concentração final, 5,4 mM)
Ajustar a pH 7,2 usando NaOH 5M.
Osmolaridade tende a ~ 310 mOsm sem nenhum ajuste.
Adiciona-se água destilada para levar o volume total a 100 ml.
Logo antes de utilização, adiciona-se 20 mg de tripsina (concentração final de 10 mg / ml) e 20 ul de ADNase (concentração final de 750 unidades / ml) a 2 ml de solução de digestão.
Solução de dissociação (por dissociação mecânica do tecido cerebral)
Solução de Hanks
MgSO4 · (7H 2 O), 295,1 mg (concentrati definitivaem, 11,97 mM)
Ajustar a osmolaridade a 310 mOsm utilizando sacarose.
O volume total é de 100 ml.
Logo antes de utilização, adicionar 20 ul de ADNase (concentração final de 750 unidades / ml) a 2 ml de solução de dissociação.
Chapeamento de médio 1 (para células gliais do mouse)
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
O volume total é de 500 ml.
Chapeamento meio-2 (para os neurônios de rato)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentração final, 2 mM)
O volume total é de 500 ml.
Chapeamento meio-3 (para os neurônios de ratos e células gliais)
Mídia Essencial Mínimo (MEM, sem vermelho de fenol)
Glucose, 2,5 g (concentração final, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (concentração final, 2,38 mM)
Transferrina, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentração final, 2 mM)
A insulina, 12,5 mg
O volume total é de 500 ml.
O meio de crescimento (por neurônios de rato e células gliais)
MEM (sem vermelho de fenol)
Glucose, 2,5 g (concentração final, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (concentração final, 2,38 mM)
Transferrina, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (concentração final, 0,5 mM)
B27 ou ns21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Citosina β-D-arabinofuranósido (AraC), 0,56 mg (concentração final de 4 | iM)
O volume total é de 500 ml.
Comentários gerais
Nossos meios de cultura não contêm antibióticos, porque eles poderiam exercem efeitos citotóxicos em células cultivadas gliais e neurônios (referência 70, 71). Isto torna especialmente importante aderir a estéril procedimentos em trabalhos relacionados com a cultura.
Veja a Tabela de reagentes para as fontes detalhadas de produtos químicos.

Tabela 1. Solutions

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Discussion

O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, ​​e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento do nascimento dos filhotes para o revestimento de culturas neuronais - em menos de um único dia de trabalho (com a exceção de preparação prévia de camadas alimentadoras da glia).

Tatuagem

Identificação de longo prazo de animais é necessário para fins de reprodução e estudos científicos tais como análises de histologia, a função das células e comportamento animal. Tatuar animais recém-nascidos é vantajosa, pois pode ser efectuada rapidamente e dura muito da vida do animal, 7,22-25. Tattooing nas almofadas da pata pode ser melhor do que o dedo do pé de recorte 23 com respeito à preservação comportamentos testáveis, por exemplo em suspensão ou preensão 22,26, embora alguns estudos não têm observado que essas irregularidades (por exemplo, 25). Não houve casos de mães que rejeitaram ou canibalização filhotes depois de tatuar. Para outros métodos de identificação de longo prazo de animais, ver revisões recentes 7,23,24.

Genotipagem

Uma característica crítica no nosso protocolo é a utilização de um método de genotipagem rápido. Embora os métodos de genotipagem semelhantes foram descritos em relatórios anteriores (por exemplo, 27,28), o sistema aqui descrito tem, pelo menos, duas melhorias. Em primeiro lugar, pode tolerar certas variações na quantidade de tecido de partida, a idade dos animais, e comprimento de fragmento amplificado. Assim, a genotipagem pode ser alcançada utilizando ratinhos jovens como 1 dia e como idade de 6 meses de idade, e pode ser levada a cabo utilizando umampla variedade de pares de iniciadores. Em segundo lugar, este método não necessita de uma solução de paragem para o passo de extracção de ADN. Isto elimina a manipulação excessiva tubo e pipetagem, e permite a automatização de vários tubos paralelos do processo com uma máquina de PCR. O número de amostras podem ser ampliados (por exemplo, 96 amostras) ainda processado facilmente e simultaneamente. Além disso, o tipo de amostra não é limitada aos grampos de cauda; outros tipos de amostras que podem ser utilizados incluem punções da orelha, recortes de dedo do pé, embriões inteiros, e os tecidos placentários 2-4,29,30. Diferentes espécies de animais podem também ser utilizados. Assim, os procedimentos de genotipagem são confiáveis ​​(repetível com baixa variação intra-ensaio) e reprodutível (baixa variação inter-ensaio entre as execuções ou entre laboratórios), e têm a vantagem de alta escalabilidade.

Note-se que é necessária alguma precaução para atingir a qualidade esperada dos resultados. Em primeiro lugar, durante a extracção do ADN, uma grande variação no protocolo pode degradar os resultados.Por exemplo, uma redução significativa do volume de Solução Extractiva ADN (por exemplo, de 200 para 100 ul na etapa 2.2) ainda permite a genotipagem, mas pode reduzir a fiabilidade e resultar na variação nos resultados de PCR. Sob tais condições, recomenda-se a reduzir o volume do extracto de DNA de 4 para 2 mL, e aumentar o volume de H 2 O 2 a 4 ul para compensar a variação de volume durante as reacções de PCR (passo 2.5). Em segundo lugar, no final da extracção de ADN, a solução pode ser utilizada imediatamente para PCR sem centrifugação na maior parte dos casos, embora a cauda irá reter a sua estrutura global e não irá ser completamente decomposta. No entanto, a inversão dos tubos descrita é essencial para a finalidade de se dissociar do ADN genómico a partir do tecido (passo 2.4). É também importante a utilização de topo, parte clara da solução, excluindo os detritos na parte inferior do tubo, porque a inclusão desta última conduzirá a resultados inconclusivos PCR. Estesetapas será eficaz com o tempo e esforço mínimo. Igualmente bons resultados podem ser obtidos com vortex activamente o espécime (no lugar das inversões) seguido por centrifugação e o sobrenadante de uso. Em terceiro lugar, depois da extracção do ADN, o ADN pode ser armazenada para a longo prazo (por exemplo,> duas semanas). Recomenda-se a centrifugar a solução usando uma microcentrífuga (por exemplo, 3,000-13,000 g a 4 ° C durante 2 min), transferir os sobrenadantes para novos tubos, e armazená-las a -80 ° C. Quando o extracto é armazenada para ser utilizada para a genotipagem Centrifugar brevemente o espécime após a descongelação, e utilizar o sobrenadante.

Culturas neuronais

Outra característica crítica do nosso protocolo é o uso de uma camada alimentadora de células gliais para estabelecer culturas neuronais a uma densidade de plaqueamento baixa. Tipicamente, em culturas primárias de neurónios do cérebro de mamíferos, as células foram semeadas com uma densidade relativamente elevada, em lamelas revestidas sem um gliacamada alimentadora l (por exemplo, 31-39). Quando a densidade do revestimento de neurónios é reduzido usando este método, a falta de folha inicial glial leva ao crescimento neuronal e extensão pobre dendrítica (painéis B, C nas Figuras 8-10), como relatado anteriormente 40-42, provavelmente devido à fraca glial 43,44 crescimento.

, De baixa densidade culturas neuronais de sucesso pode ser gerada por, pelo menos, três grandes tipos de métodos. Numa abordagem, Neurobasal médio é utilizado como meio de cultura. Isto torna possível a cultura de neurónios na ausência de uma camada alimentadora de células gliais, e pode ser utilizado para as culturas de baixa densidade neuronal 45,46. Em uma segunda abordagem (do tipo "Banker" e sua modificação), as células gliais são co-cultivadas com neurônios no mesmo poço, mas são fisicamente separados deles. Neste contexto, as células gliais fornecer "apoio trófica" para os neurônios, sem contato com eles diretamente1,41,42,47-49. Na terceira abordagem, os neurónios são plaqueadas sobre uma camada alimentadora de células gliais pré-estabelecido que suporta o crescimento neuronal (por exemplo, 50-53) (Figuras 8-10). Especificamente, os neurónios do cérebro do rato são plaqueadas sobre uma camada alimentadora glial preparados a partir de murganhos ou ratos 8,34,54 41,55,56.

Nós preferimos o último dos três abordagens para a cultura de baixa densidade, porque o Neurobasal Médio pode afetar a sobrevivência neuronal 57, as células da glia astrocitárias será essencial na regulação das funções neuronais 8,58, e o contato físico entre os neurônios e células gliais pode ser importante. Os procedimentos para a cultura das células de rato e gliais do rato são semelhantes 59,60, mas nós modificamos-los um pouco para acomodar o mais rápido crescimento in vitro de rato vs. células gliais do mouse. Os procedimentos para a cultura de células de ratos foram modificados 61-63. O uso de um alimentador Laye glialr para culturas neuronais de baixa densidade faz com que seja necessário realizar genotipagem rápida, a fim de coincidir com o genótipo da camada de alimentação para que os neurónios no interior do período entre os nascimentos dos filhotes e as mortes neonatais ou o final da janela de cultura (1 -2 dias após o nascimento).

Cultura de baixa densidade em uma camada de alimentação glial também é um método importante quando se tenta neurônios cultura de pequenos núcleos no cérebro (por exemplo, o locus coeruleus de liberação de noradrenalina e da substantia nigra de liberação de dopamina). Esses núcleos contêm apenas um pequeno número de neurônios e, inevitavelmente, produzir culturas de baixa densidade 64-67.

As culturas primárias são preparadas rotineiramente no nosso laboratório a partir da região CA3-CA1 do hipocampo, a região do motor do córtex cerebral e o corpo estriado de ratos. Os mesmos procedimentos podem ser usados ​​para preparar culturas de neurónios representando outras regiões do cérebro, por exemplo, o conjunto hipocampo (including giro dentado), e todo o córtex cerebral. Rato neurônios de regiões do cérebro como o hipocampo e locus coeruleus são cultivadas de forma semelhante, usando a camada de rato alimentador glial. Estes neurónios em cultura são normalmente utilizados em 1-4 semanas in vitro, com a idade exacta da cultura, dependendo do objectivo da experiência. É digno de nota que alguns neurônios cultivados em uma camada de alimentação glial pode sobreviver por mais de 10 semanas 34,68.

Um problema potencial de culturas neuronais de baixa densidade é que as propriedades neuronais podem ser diferentes daqueles em culturas de alta densidade ou em neurónios in situ. A comparação destes sistemas proporciona uma oportunidade interessante estudar como neuronal desenvolvimento e maturação são afectadas por vários factores, tais como a densidade neuronal, os factores solúveis segregadas a partir de neurónios, de neurónios contacto para neurónio, e interacções glia-neuronal.

Em resumo, o tattooirotulagem rato com base em ng é de longa duração, o método de genotipagem é rápido, e o método de cultura para o plaqueamento permite neurónios de rato a uma densidade baixa. O protocolo aqui descrito pode ser aplicado na sua totalidade para outras espécies animais, que albergam outras mutações genéticas. Além disso, os passos individuais do protocolo pode ser utilizado para outros fins. Assim, o protocolo pode ser utilizado numa vasta gama de aplicações com base nas necessidades do experimentador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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