In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

Neuroscience

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Summary

Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.

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Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A. M., Pearn, M. L., Mobley, W. C., Wu, C. Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51899, doi:10.3791/51899 (2014).

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Abstract

BDNF svolge un ruolo importante in molti aspetti della sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la funzione. Deficit strutturali e funzionali in assoni sono visti sempre più come una caratteristica precoce di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e la malattia di Huntington (HD). Per quanto ancora poco chiaro è il meccanismo (s) di cui danno assonale è indotta. Abbiamo riportato lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Quantum dot-marcato BDNF (QD-BDNF) è stato prodotto da coniugando quantum dot 655 a mBtBDNF. Un dispositivo di microfluidica è stato utilizzato per isolare gli assoni da corpi cellulari dei neuroni. L'aggiunta di QD-BDNF al compartimento assonale consentito l'imaging dal vivo di trasporto BDNF negli assoni. Abbiamo dimostrato che QD-BDNF spostato in sostanza esclusivamente retrograda, con pochissime pause, ad una velocità di spostamento di circa 1,06 micron / sec. Questo sistema può essere usato per studiare mechanisms di perturbato funzione assonale in AD o HD, così come altre malattie degenerative.

Introduction

I neuroni sono cellule altamente polarizzate i cui processi lunghi e spesso altamente elaborati sono fondamentali per stabilire e mantenere la struttura e la funzione dei circuiti neurali. L'assone svolge un ruolo fondamentale nel portare carichi da e sinapsi. Le proteine ​​e organelli sintetizzati nel soma cellulare devono essere trasportati attraverso gli assoni per raggiungere il terminale presinaptico per supportare la funzione neuronale. Di conseguenza, i segnali ricevuti assoni distali devono essere trasdotte e convogliati al soma. Questi processi sono essenziali per la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la manutenzione. In tale trasporto assonale in alcuni neuroni deve essere condotta attraverso distanze più di 1.000 volte il diametro del corpo cellulare, la possibilità è facilmente previsto che anche i piccoli deficit potrebbero avere un impatto marcatamente funzione neuronale e del circuito.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membro della famiglia dei fattori di crescita neurotrofina, è presente in maregioni cerebrali ny, tra cui l'ippocampo, la corteccia cerebrale, e prosencefalo basale. BDNF svolge un ruolo cruciale nella formazione conoscenza e la memoria sostenendo la sopravvivenza, la differenziazione e la funzione dei neuroni che partecipano a circuiti cognitivi. BDNF si lega al suo recettore, il TrkB tirosina chinasi, al terminale dell'assone dove attiva vie di segnalazione TrkB-mediata, tra cui la proteina chinasi attivata da mitogeni / extracellulare proteina chinasi segnale-regolata (MAPK / ERK), fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) e fosfolipasi C-gamma (PLCγ). Le proteine ​​che partecipano a queste vie di segnalazione sono confezionati su strutture vescicolari endocitiche per formare il BDNF / TrkB segnalazione endosome 1-6 che vengono poi retrograda trasportato al soma neuronale.

La camera di coltura microfluidica è una piattaforma molto utile per studiare biologia assonale in condizioni normali sia in ambito di lesioni e malattia 7,8. Con assoni isolantidai corpi cellulari, il dispositivo ha permesso di studiare un trasporto specificatamente assoni 8-10. Le piattaforme basate microfluidica PDMS con 450 micron barriere microsolchi utilizzati in questo studio sono stati acquistati in commercio (vedi tabella Materials). Per esaminare i trasporti BDNF, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per la produzione di monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Abbiamo approfittato del peptide biotina accettore, AP (noto anche come AviTag). Si tratta di una sequenza di acido 15 aminoacidi che contiene un residuo di lisina che possono essere specificamente ligato ad un biotina dal coli ligasi enzima biotina Escherichia, Bira. Abbiamo fuso il AviTag al C-terminale del mouse pre-proBDNF cDNA mediante PCR (Figura 1A). Il costrutto è stato clonato nel vettore di espressione di mammifero, pcDNA3.1-myc suo vettore. Abbiamo anche clonato il DNA batterico Bira nel pcDNA3.1-myc suo vettore. I due plasmidi sono stati transitoriamente co-trasfettate in cellule HEK293FT di esprimere entrambe le proteine. Bira catalizzata la legatura di Biotin particolare per la lisina risiedere nel AviTag al C-terminale di BDNF in un rapporto 1: 1 per produrre monobiotinylated BDNF monomero. Biotinilato, maturo BDNF con una massa molecolare di circa 18 kDa è stato recuperato e purificato dal supporto utilizzando Ni-resina (Figura 1C). La biotinilazione di BDNF era completa, come giudicato dalla incapacità di rilevare non modificato BDNF mediante immunoblotting (Figura 1D). Streptavidina punti quantici coniugati QD 655, sono stati usati per etichettare mBtBDNF per fare QD-BDNF. La presenza del AviTag non interferisce con l'attività di BDNF come mBtBDNF era in grado di attivare TrkB fosforilata (Figura 1E) e stimolare la crescita dei neuriti (Figura 1F) nella misura del BDNF umano ricombinante (rhBDNF). Immunostaining dimostrato che QD-BDNF colocalizzava con TrkB in assoni ippocampali, indicando che QD-BDNF è bioattivo (Figura 1G). Per studiare il trasporto BDNF, QD-BDNF è stato aggiunto al compartimento assonale distale diculture microfluidica contenenti ratto E18 neuroni dell'ippocampo (Figura 2A). QD-BDNF trasporto retrogrado all'interno di assoni è stato catturato da in tempo reale di immagini dal vivo del tag fluorescente rossa (supporto video S1, S2). Analizzando il chimografo generato, QD-BDNF è stato osservato per essere trasportato retrograda ad una velocità di movimento intorno 1,06 micron / sec (Figura 3A). GFP o mCherry-tagged BDNF sono stati utilizzati per tracciare il movimento assonale di BDNF. I principali svantaggi sono che non sono abbastanza luminose per gli studi di singola molecola. Inoltre, la presenza di entrambi anterograda e movimenti retrogradi BDNF rende difficile valutare se il BDNF retrograda trasportato era in un complesso neurotrofina / recettore.

In questo video, dimostriamo le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari. Il ultrabrightness ed eccellente fotostabilità dei punti quantici makes 'possibile effettuare il monitoraggio a lungo termine del trasporto BDNF. Queste tecniche possono essere sfruttati per migliorare gli studi di funzione assonale in AD, HD, e altre patologie neurodegenerative.

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Protocol

Le procedure chirurgiche e animali sono eseguite rigorosamente secondo la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti che comportano l'uso di animali sono approvati dal UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.

1 plasmidi clonazione, espressione e purificazione di Mono-biotinilato BDNF (mBtBDNF)

NOTA: Construct pre-proBDNFavi e Bira cDNA in pcDNA3.1 vettoriale e coesprimere nelle cellule HEK293FT 10. Purificare mBtBDNF utilizzando Ni-NTA perline secondo il metodo precedentemente pubblicata di produrre fattore maturo e biologicamente attiva di crescita nervoso monobiotinylated (mBtNGF) 10.

2 Preparazione di microfluidici Chambers

Microfluidic dispositivo neurone coltura rende possibile isolare fluidicamente assoni provenienti da corpi cellulari dei neuroni. Montare camere con vetrini rivestiti di fresco giusto prima di ogni dissezione. Camere di microfluidica usatein questo protocollo sono regolarmente acquistati (vedi Materiali e tabella di attrezzature). Lavare a mano e riutilizzati camere di commercio acquistati fino a 5-6x.

  1. Lavaggio a mano camere di microfluidica in 1% Alconox. Risciacquare tre volte con acqua Milli-Q per 30 minuti ciascuno. Camere di lavaggio a mano di nuovo in etanolo al 70%.
  2. Stendere camere ad asciugare su Parafilm in cappa a flusso laminare. Irradiare e sterilizzare entrambi i lati delle camere per 20 minuti sotto UV. Conservare sterilizzato camere in un piatto 15 centimetri sterile sigillato con Parafilm a temperatura ambiente.
  3. Mettere 24 x 40 mm N. 1 vetrini in un contenitore di vetro. Mettere a bagno i coprioggetti in 35% acido cloridrico durante la notte su un rotatore. Il giorno seguente, sciacquare i vetrini tre volte per 30 minuti ciascuno con acqua.
  4. Sterilizzare i coprioggetti uno per uno per immersione ogni coprioggetto in 100% etanolo e fiammeggiante su un becco Bunsen. Conservare coprioggetto secco in una capsula di Petri sterile e tenerlo a temperatura ambiente fino al rivestimento.
  5. Lay out i coprioggetti in un piatto di coltura 15 cm. Coat ogni coprioggetto con 0,7 ml di 0,01% di poli-L-lisina (PLL) e incubare nel cappuccio a temperatura ambiente.
  6. Dopo 1 ora, sciacquare i vetrini tre volte con acqua sterile. Coprioggetto secco con vuoto e posto ogni coprioggetto in un piatto di cultura 6 cm.
  7. Per assemblare la camera microfluidica, posizionare la camera con il lato microsolchi in basso sul coprioggetto rivestito PLL con cautela per non toccare i microsolchi. Premuto delicatamente verso il basso la camera con un puntale per garantire la camera è stata ermeticamente chiusi.

3. Dissezione di Cultura neuronale e piastra su Chambers

  1. Posizionare due ippocampi E17-E18 ratto (un cervello) sezionato in un tubo da 15 ml contenente 2 ml di tampone di dissezione (HBSS, no calcio, no magnesio, con 1% pen / strep e HEPES 10 mM. Sciacquare i tessuti 3x con 5 ml dissezione tampone ogni volta. Rimuovere il buffer dissezione per quanto possibile e aggiungere 900 ml di di frescotampone ssection.
  2. Per digerire il tessuto, aggiungere 100 ml di tripsina 10x (2,5%) nel buffer dissezione per rendere concentrazione di lavoro 1x. Posizionare il tubo conico in un bagno di 37 ° C Acque. Dopo 10 min di digestione, aggiungere 100 ml di 10 mg / ml di DNasi I a una concentrazione finale di circa 1 mg / ml.
  3. Usando una pipetta Pasteur di vetro lucidati a fuoco, triturare delicatamente i tessuti pipettando su e giù 5-10x. Subito dopo triturazione, placare la tripsina con 2 ml di placcatura medio (Neurobasal con 10% FBS, 2 Glutamax mM, 2% B27).
  4. Lasciare il campione nella cappa per 5 minuti per consentire eventuali detriti dei tessuti di stabilirsi sul fondo. Rimuovere con cautela 2 ml di surnatante in una sterile tubo da 15 ml pulito e centrifugare a 200 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere il pellet in 50 microlitri mezzi placcatura
  5. Contare le cellule con emocitometro. Carico 15-20 microlitri di sospensione cellulare (~ 40.000 cellule) in uno scomparto della camera microfluidica. Posizionare la camerain incubatrice per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare alla coprioggetto. Dopo 10 minuti, aggiungere i media più in piastra per riempire entrambi i comparti della camera.
  6. Il secondo giorno della dissezione, sostituire completamente i terreni in piastra con i media manutenzione (Neurobasal con 2 Glutamax mM, 2% B27), sia nel corpo cellulare e il vano assone. Gli assoni dei neuroni dell'ippocampo iniziano a varcare i microsolchi in giorno 3 e raggiungere il vano assone tra il giorno 5-7. Durante questo periodo di tempo, sostituire la metà dei mezzi di coltura con terreno di mantenimento fresco ogni 24 ~ 48 ore.

4 assonale Trasporto di QD-BDNF

  1. Prima di vivere l'imaging di QD-BDNF trasporto assonale, esaurire BDNF sia dal corpo cellulare e assone compartimenti della camera microfluidica da sciacquare entrambi i comparti con BDNF-liberi, siero media liberi Neurobasal ogni 30 min per 2 ore.
  2. Durante BDNF esaurimento, preparare i coniugati QD-BDNF. Mescolare 50 nM di mono-biotinilato BDNF dimero con 50 Nm coniugati QD655-streptavidina nei media Neurobasal e incubare in ghiaccio per 60 min.
  3. Rimuovere il supporto nel vano assone e aggiungere 300 microlitri QD-BDNF con una concentrazione finale di 0,25 nM per 4 ore a 37 ° C. Per ridurre al minimo la diffusione del QD-BDNF nel vano corpo cellulare, è molto importante mantenere sempre un livello superiore di supporto nel vano corpo cellulare che nel vano assone. Lavare non legato QD-BDNF dopo incubazione prima di imaging dal vivo.
  4. Eseguire l'imaging dal vivo di trasporto QD-BDNF utilizzando un microscopio invertito dotato di un olio lente obiettivo 100X. Scaldare la portata e la camera ambientale collegato ad esso per una temperatura costante (37 ° C) e CO 2 (5%). Utilizzare un set di Texas cubi rossi di eccitazione / emissione di visualizzare il segnale QD655.
  5. Acquisire e catturare immagini time-lapse all'interno dei assoni centrali alla velocità di 1 fotogramma / sec per un totale di 2 min con una camera CCD. Utilizzare microscanalature senza assoni that non hanno QD e quindi nessun segnale di come controllo per l'infiltrazione.
  6. Analizzare il trasporto BDNF utilizzando qualsiasi software di analisi dell'immagine o NIH ImageJ.

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Representative Results

Produzione e purificazione di biologicamente attivi BDNF Mono-biotinilato

Il vettore di espressione di BDNF fuso con una sequenza AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) è stato creato secondo un protocollo già pubblicato 10. La massa molecolare della proteina di lunghezza completa di fusione è stato previsto per essere ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated BDNF maturo con una massa molecolare prevista di 18 kDa (Figura 1A) è stato prodotto nelle cellule HEK293FT e purificato da mezzi condizionati come descritto 10.

Diverse frazioni sono state raccolte e separate su 15% SDS-PAGE. Utilizzando un coniglio anti-Avi tag anticorpo, un gruppo con un peso molecolare di circa 18 kDa è stata rilevata nella prima frazione (Figura 1B). Per testare la purezza della preparazione, i campioni sono stati separati su SDS-PAGE e sono state colorate da sIlver-colorazione. Come mostrato nella figura 1C, la banda 18 kDa è stata la specie predominanti nella prima eluizione. Perline streptavidina-agarosio saggi a discesa sono stati eseguiti per valutare l'entità del biotinilazione della preparazione mBtBDNF. In seguito a tendina con perline streptavidina-agarosio, proteine ​​che sono rimasti nel surnatante sono stati precipitati con acido tricloroacetico 7% (TCA). Questi campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e le macchie sono stati sondati sia con anticorpi anti-Avi (in alto) per rilevare la proteina totale o HRP-streptavidina per rilevare le proteine ​​biotinilate. I nostri risultati dimostrato che tutti i segnali sono stati associati con le perline mentre nessun gruppo è stata rilevata nel surnatante (Figura 1D). Abbiamo quindi concludere che mBtBDNF stato biotinilato ad un rendimento> 99,9%.

Per testare l'attività biologica di mBtBDNF nel legare e attivare il recettore TrkB, abbiamo trattato una linea cellulare che esprime 3T3 TrkB sia con rhBDNF (20 ng / ml) o purified mBtBDNF (20 ng / ml) per 10 min. Le cellule che hanno ricevuto alcun trattamento sono stati raccolti anche come controllo. I lisati sono stati separati su un 4-12% SDS-PAGE e un anticorpo anti-pTrkB coniglio è stato utilizzato per sondare il TrkB fosforilata. Come mostrato in Figura 1E, simile a rhBDNF, mBtBDNF era in grado di indurre la fosforilazione di TrkB ad un livello simile. Abbiamo anche trattati neuroni dell'ippocampo di ratto sia con rhBDNF (20 ng / ml) o purificato mBtBDNF (20 ng / ml) per 48 ore. Purificata mBtBDNF è stato in grado di stimolare la crescita dei neuriti ippocampale nella misura di rhBDNF (Figura 1F). Per esaminare la co-localizzazione di QD-BDNF con recettore TrkB, QD-BDNF è stato aggiunto al ratto assone ippocampale per 4 ore a 37 ° C. I neuroni sono stati poi fissati e immunostained per TrkB. Come mostrato in Figura 1G, QD-BDNF co-localizzato con TrkB. Abbiamo quindi concludere che mBtBDNF è pienamente attivo nella sua funzione biologica.

Immagini dal vivo di trasporto assonale di QD-BDNF in neuroni dell'ippocampo

Primari embrionali neuroni dell'ippocampo di ratto (E17-18) sono stati sezionati e placcato nel vano corpo cellulare della camera microfluidica. Al giorno 4 o 5, assoni estesi attraverso le microscanalature nel vano assone. Al giorno 7, la maggior parte degli assoni cresciuti nel vano assone. QD-BDNF è stato effettuato incubando il QD655 streptavidina con mBtBDNF in un rapporto 1: 1 (QD: BDNF dimero) in ghiaccio per 1 ora. QD-BDNF (0,25 nM) è stata quindi aggiunta al compartimento assonale e incubate per 4 ore a 37 ° C prima di imaging (Figura 2A).

Dopo l'incubazione, QD-BDNF è stato trovato per legarsi specificamente assoni nel vano assone. Nel vano corpo cellulare, segnali QD sono stati accumulati nella maggior parte degli assoni prossimali e corpi cellulari che indicano il QD-BDNF è stato interiorizzato le assoni e retrograda trasportato i corpi cellulari. Time-lapse serie di immagini di segnali QD-BDNF all'interno assoni sono state effettuate nei microsolchi. QD signals stati osservati nella maggior parte dei microscolpiture con assoni mentre nessun segnale QD può essere visto nelle microscolpiture in assenza di assoni, indicando una scarsa o nessuna diffusione di segnale QD dal vano assone al vano corpo cellulare (Figura 2B).

Nella Figura 2C, un lungo segmento di 80 micron di assoni dei neuroni dell'ippocampo sono stati fluorescente registrati per 100 sec. Totale di 6 segnali QD-BDNF erano chiaramente visto durante la registrazione video. Tre QD segnali registrati spostati unidirezionalmente verso il corpo cellulare (lato sinistro). L'evento QD marcato da una freccia bianca (t: 31 sec a t: 101 sec) si trasferisce gradualmente verso il corpo cellulare che attraversa tutto il campo in ~ 70 sec. Un altro evento QD marcato da una freccia verde (t: 1 sec a t: 61 sec) si trasferì retrograda prima. A t: 21 sec, il QD-BDNF spostato anterogradely per 10 a 20 secondi, e poi cambiò di nuovo direzione verso il corpo cellulare. L'evento QD marcato da una freccia gialla (t: 1 sec a t: 71 sec) anche spostato retrogrado ely, ma si fermò per ~ 20 secondi durante il movimento. QD-BDNFs che non si muovevano in questo 100 sec stati considerati fissi. Solo gli oggetti in movimento sono stati successivamente analizzati per calcolare la velocità in movimento, velocità media, e il tempo pausa.

Analisi dei dati in QD-BDNF Trasporti chimografo

Kymographs sono stati creati da ogni filmato registrato utilizzando il software Metamorph. Come mostrato nelle kymographs rappresentativi di trasporto QD-BDNF (Figura 3A), movimenti QD-BDNF sono stati registrati durante 120 sec 80 micron in un lungo segmento di assoni. In chimografo rappresentante 1, QD-BDNF spostato veloce e senza intoppi verso sinistra (corpo cellulare), ha attraversato il campo (80 micron) in ~ 60 sec, con brevissime pause (Supporting Video S1). Mentre in chimografo rappresentativo 2, un QD-BDNF viaggiato ~ 50 micron di 120 sec retrograda, con almeno tre segmenti di pause più lunghe (indicato dalle frecce) (Supporto Video S2).

contenuto "> Figura 3B è il diagramma a dispersione di velocità, velocità media mobile, e si fermò il tempo di ogni singolo QD-BDNF. La velocità di movimento del QD-BDNF è stato relativamente veloce, che vanno 0,47-1,97 micron / sec con la media di 1.06 ± 0.05 micron / sec. La velocità media di QD-BDNF è stato calcolato come viaggiare distanza / tempo impiegato. E poiché BDNF in pausa durante il trasporto, velocità media era molto più basso di muoversi con velocità media di 0,48 ± 0,03 micron / sec (che vanno 0,17-1,59 micron / sec). tempo di pausa è stato anche analizzato come una caratterizzazione del movimento BDNF. La durata media delle pause era 15,88 ± 1,30 sec (che vanno 6-33 sec) (Tabella 1).

Figura 1
Figura 1 Purificazione di biologico attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) Un disegno schematico mostra la produzione di mBtBDNF. Sia il pre-proBDNFavi e Bira sono stati clonati nel pcDNA3.1myc-il suo vettore, come descritto 10. (B) diverse frazioni di eluisce da Ni-resina sono stati raccolti e separati su un gel SDS-PAGE 15%. Un tag anti-Avi anticorpo di coniglio è stato utilizzato nella macchia. Una band con un peso molecolare apparente di ~ 18 kDa è stata rilevata nel eluire, coerente con la massa molecolare prevista per la proteina matura mBtBDNF. (C) Un argento gel colorazione mostra il 18 kDa mBtBDNF era la specie predominante nella frazione di eluizione. (D) purificata mBtBDNF è stata incubata con perline streptavidina-agarosio. Le perle sono state lavate e bollite in tampone di caricamento SDS mentre il surnatante è stato precipitato con TCA prima analisi SDS-PAGE. La macchia è stato sondato sia con anticorpo anti-Avi o con HRP-streptavidina. (E) 20 ng / ml di purificato mBtBDNF o rhBDNF è stato aggiunto a una linea di cellule 3T3 che l'expresses TrkB per 10 min. I lisati sono stati raccolti e separati su un 4-12% SDS-PAGE. Lisato cellulare di controllo è stata anche analizzata. La macchia è stato sondato con un anticorpo anti-pTrkB coniglio. TrkB totale è stato rivelato utilizzando un anticorpo anti-topo TrkB. (F) 20 ng / ml di purificato mBtBDNF o rhBDNF è stato aggiunto al ratto neuroni dell'ippocampo per 48 ore. Sono state scattate le immagini DIC analizzare crescita dei neuriti. (G) QD-BDNF è stata incubata con il ratto assoni dei neuroni dell'ippocampo per 4 ore (barra della scala 5 micron). I neuroni sono stati poi fissati e immunostained per TrkB.

Figura 2
. Figura 2 singola molecola di imaging di trasporto retrogrado di QD-BDNF in assoni (A) Vista dall'alto: Un disegno schematico della camera di microfluidica con i neuroni primari placcati nel vano corpo cellulare. Gli assoni sono cresciuti attraverso il microgtetti nel vano assone. QD655 etichettato BDNF è stato aggiunto al vano assone. Vista laterale: Il livello di supporto nel vano assone è stata mantenuta inferiore al compartimento corpo cellulare per ridurre al minimo la diffusione del segnale QD. (B) le immagini fluorescenza rossa e le immagini DIC di compartimento corpo cellulare, microscanalature e vano assone. QD-BDNF legato specificamente al assoni, interiorizzato, e retrograda trasportato i corpi cellulari lungo gli assoni. Nessun segnale QD è stata osservata nei microsolchi assenti di assoni. (C) Time-lapse video serie di immagini di trasporti QD-BDNF lungo l'assone. Entrambi i segnali QD-BDNF fisse e in movimento erano presenti nella maggior parte dei film. Al tempo t: 1 sec, almeno 4 QD può essere visto. Dopo 10 secondi, due QD (indicati dalle frecce verdi e gialli) si stanno muovendo verso il corpo cellulare (a sinistra dell'immagine). Questi due QD si muovono e si fermano nei primi due immagini e poi passare fuori le immagini a sinistra (a ~ 70 sec). Un altro QD spostato nel campoal t: 31 sec (indicato dalla freccia bianca) e si è trasferito molto velocemente senza pause a sinistra.

Figura 3
Figura 3 QD-BDNF chimografo e dati di analisi trasporto. (A) kymographs Rappresentante di trasporto QD-BDNF in neuroni ippocampali primarie. In KYMO 1, un luminoso QD attraversò il campo a velocità relativamente veloce con poche pause brevi. In KYMO 2, la velocità di movimento dei QD era più lento, e il movimento è stato interrotto con più frequenti e più lunghe pause. (B) Diagramma di dispersione dei QD-BDNF velocità di movimento, velocità media (calcolata come viaggiare distanza / tempo impiegato) e si fermò il tempo. La media velocità di movimento di QD-BDNF era 1.06 ± 0.05 micron / sec (che vanno 0,47-1,97 micron / sec. La velocità media di QD-BDNF era 0,48 ± 0,03 micron / sec (che vanno da 0. 17-1,59 micron / sec). La durata media delle pause era 15,88 ± 1,30 sec (che vanno 6-33 sec).

Sostenere Video S1 . Rappresentante QD-BDNF video di trasporto 1 Diversi QD-BDNF muoversi velocemente verso il lato sinistro (corpo cellulare) con pochissime pause brevi.

Sostenere Video S2 . Rappresentante QD-BDNF video di trasporto 2 Diversi QD-BDNF muoversi relativamente lenta verso il lato sinistro (corpo cellulare) con pause frequenti e lunghi.

88px; "> Std errore.
Minimo Massimo Dire
Velocità Moving (micron / sec) 0.47 1.97 1.06 0.05
Velocità media (micron / sec) 0.17 1.59 0.48 0.03
Tempo di pausa (sec) 6 33 15.88 1.30

Tabella 1 L'analisi dei dati del trasporto QD-BDNF.

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Discussion

In questo studio, riportiamo lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Con coniugando la proteina di quantum dot streptavidina, e l'utilizzo di una camera microfluidica, il metodo permette di rilevare il trasporto assonale di BDNF in neuroni primari con sensibilità singola molecola, in tempo reale e con risoluzioni spaziali e temporali. Gli strumenti utilizzati in questo documento forniscono un mezzo per studiare le macchine molecolari che mediano il trasporto assonale di BDNF / TrkB segnalazione endosomi in neuroni nella salute e nella malattia.

BDNF-GFP, o -mCherry sono stati utilizzati per tracciare il movimento assonale di BDNF in diverse culture neuronali in vitro. Questi reagenti offrono una opzione per l'esame il trasporto anterogrado e, eventualmente, di esaminare l'attivazione autocrina di TrkB. Tuttavia, esistono notevoli inconvenienti per studiare il trasporto retrogrado, il più salienti del WHIch è che GFP o mCherry non sono abbastanza luminose per gli studi di singola molecola. Precedenti studi hanno dimostrato che in concentrazioni fisiologiche di NGF, un solo dimero NGF è stato interiorizzato 11 e retrograda trasportato 8. È importante sottolineare che l'uso di QD BDNF permette anche di definire la localizzazione subcellulare in cui il BDNF lega suoi recettori TrkB. Utilizzando GFP o proteine ​​mCherry-tag, espressione Somal comporterà la presenza all'interno del assone di proteine ​​sottoposti anterograda e pure il trasporto retrogrado. Come tale, può essere difficile valutare se o dove retrograda trasportato BDNF incontrato il suo recettore prima del trasporto retrogrado. In effetti, come una speculazione, trasporto retrogrado entro assoni di BDNF-GFP o BDNF-mCherry ottenuto nello stesso neurone può differire da quello conseguente al legame BDNF nel target di innervazione.

Sebbene reticolazione chimica è stata utilizzata per la produzione di fattore di crescita nervoso biologicamente attiva(NGF), il metodo presentato qui è superiore. In primo luogo, è difficile controllare con precisione l'entità del biotinilazione; per esempio, ogni NGF è stato etichettato con 5-9 porzioni di biotina 8,9,12. In secondo luogo, la reticolazione può inattivare la proteina. Nel caso di NGF, reticolazione reso necessario l'attaccamento di gruppi carbossilici 13. Nel caso di BDNF, l'attività è spesso persa dopo reticolazione chimica alla biotina. Infine, il grado di reticolazione può essere incompleta. Un recente rapporto ha mostrato che ~ 0,8 biotina / BDNF molecola è stato prodotto da reticolazione chimica; come tale ~ 20% di BDNF non è stato etichettato 9. La presenza di BDNF non marcato potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati.

La nostra tecnica offre i vantaggi unici che le molecole di BDNF sono tutti etichettati con un unico biotina nello stesso sito, costituendo così un preparato omogeneo di biotinilato BDNF. Con coniugando alle particelle nanofluorescent quali punti quantici, mBtBDNF può essereutilizzati per il monitoraggio dei percorsi e processi che BDNF è interiorizzato, vittime di tratta all'interno dei neuroni: in dendriti, in assoni e in corpi cellulari. Questo metodo rende possibile l'uso di tag alternativi per BDNF. Lo sviluppo di altri tipi di nanoparticelle promette ulteriori vantaggi.

Difetti di traffico e segnalazione di BDNF assonale sono stati implicati nelle malattie neurodegenerative. Forte evidenza ha legato il trasporto difettoso di BDNF a atrofia cortico-striatale nella malattia di Huntington 14,15. Proteina huntingtina mutante interferisce con l'interazione tra huntingtina-associati proteina-1 (HAP1) e il motore dineina in neuroni simpatici, inibisce il trasporto BDNF, e si traduce in perdita di supporto neurotrofico e tossicità neuronale 16-18. Le nostre tecniche di rilevamento movimento assonale di BDNF può servire come un valido strumento per studiare la funzione assonale nelle malattie neurodegenerative.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit per la loro assistenza tecnica. Lo studio è supportato da NIH concedere (PN2 EY016525) e da un finanziamento di Down Syndrome Research Foundation e il trattamento e la Larry L. Hillblom Fondazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Platinum pfx DNA polymerase  Invitrogen 11708021
EcoRI  Fermentas FD0274
BamHI  Fermentas FD0054
HEK293FT cells Invitrogen R70007
DMEM-high glucose media Mediatech 10-013-CV
D-biotin  Sigma B4639
TurboFect  Fermentas R0531
PMSF   Sigma P7626
Aprotinin Sigma A6279
Ni-NTA resins Qiagen 30250
Protease inhibitors cocktail Sigma  S8820
Silver staining kit  G-Biosciences 786-30
Human recombinant BDNF Genentech
Microfluidic chambers Xona SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips  VWR 48393-060
Poly-L-Lysine  Cultrex 3438-100-01
HBSS Gibco 14185-052
DNase I Roche 10104159001
Trypsin Gibco 15090-046
Neurobasal  Gibco 21103-049
FBS  Invitrogen 16000-044
GlutaMax  Invitrogen 35050-061
B27   Gibco 17504-044
QD655-streptavidin conjugates Invitrogen  Q10121MP
anti-Avi tag antibody GenScript A00674
streptavidin-agarose beads  Life Technology  SA100-04
Trichloroacetic acid Sigma T6399
HRP-streptavidin  Thermo Scientific N100
anti-pTrkB antibody a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody BD Science 610101

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References

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