Imaging intracellulär Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Astrocyter är allestädes närvarande och rikliga gliaceller i hjärnan. Det är väl etablerat att astrocyter tjänar ett viktigt stöd och homeostatiska roller inklusive buffring av K + koncentrationen i det extracellulära utrymmet, upptag av neurotransmittorer och ger näring. Men nya studier visar att de också visa [Ca2 +] i signaler, som uppträder spontant och ökade med nervaktivitet 1. Förekomsten av astrocyternas [Ca2 +] i signalering har i allt högre grad tänkt att utlösa sin kommunikation med nervceller, och som sådan har tolkats som en form av "Ca2 + retbarhet" i astrocyter. Tillgängliga data under de senaste två decennierna föreslå två miljöer där astrocyter och nervceller kan kommunicera, kanske i ett dubbelriktat sätt. Först astrocyter svarar ofta med en ökning av [Ca2 +] i när den aktiveras av signalsubstanser ochneuromodulatorer frigörs från neuroner 2. För det andra, [Ca2 +] i prishöjningarna astrocyter orsakar frisättningen av signalmolekyler från astrocyter som i sin tur kan påverka nervceller och blodkärl. Uppgifter tyder på att molekyler som frigörs från astrocyter leda till förändringar i funktioner synapser, kretsar och slutligen beteendet 3-5 via astrocyternas-to-neuron signalering. Dock återstår det en snabbt växande forskningsområde, och det har hävdats att en bättre och detaljerad förståelse av astrocyternas [Ca2 +] i behövs för att lösa en del av den rådande osäkerheten 6.

I tidigare arbete, visades att bulk lastning av organiska Ca 2 + indikator färgämnen i astrocyter inte tillförlitligt detektera [Ca2 +] i signaler inom hela astrocyter i kultur och in situ 7-10. Dessa fynd har diskuterats av oss och andra 6,11,12. Den emerging bilden är att [Ca2 +] i signaler inom astrocyternas processer (t.ex., grenar och grenarna), som är de främsta platser för interaktioner med nervceller och blodkärl, har sällan undersökts i detalj. Nyligen, användningen av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) såsom cytosoliskt GCaMP3, GCaMP5G och GCaMP6 och plasmamembran bundna versioner (t.ex. Lek-GCaMP3) har gjort det möjligt att studera [Ca2 +] i signaler i små fack i astrocyter sådana som tunna processer, nära plasmamembranet och inom hela territorier 7,8. Men GECIs har en nackdel över organiska Ca 2 + indikator färgämnen och det är kravet på genetiska metoder för att leverera kodningsgener selektivt till astrocyter in vivo under perioder av veckor för GECIs vara lämpligt uttryck. Expression in vivo uppnås normalt genom att använda transgena möss, knock-in möss eller med virus baserad leverans appkackerlackor. I föreliggande JUPITER artikeln rapporterar vi metoder och förfaranden som används för att leverera GECIs till striatala astrocyter som använder adenoassocierade virus. Vi fokuserar på cyto-GCaMP3 som ett exempel, men samma grundläggande procedur fungerar för alla andra Geci eller fluorescerande protein baserad reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprotokoll var enligt amerikanska National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid UCLA.

1.1) Förbered Mikropipett och AAV2 / 5 Virus Loading

  1. Använd fin borosilikatglas mikropipetter för insprutning av viruset. Dra mikropipett med hjälp av en tvåstegs drar programmet med en vertikal avdragare. Bevel pipetten i en vinkel på 40 ° med hjälp av en pipett kvarn. Pipetten som är idealisk för användning kommer att ha en spetsdiameter av 20-40 pm och en skaftlängd av 6-7 mm. Autoklav pipetten och kirurgiska instrument. Borren steriliseras genom att torka med 70% etanol.
  2. Lagra viruset AAV2 / 5-GfaABC en D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 GC / ml), vid -80 ° C i 10 | il alikvoter. Strax före operation, ta ut delmängder ur frysen och förvara på is tills det används för att fylla the mikropipett.
  3. Fyll mikropipett med virus med användning av en sprutpump. Tätt ansluter du ena änden av en bit slang, genom en lämplig storlek slang kompressionskoppling, till en glasspruta med en förstärkt kolv. Fäst autoklaveras mikropipett till den andra änden av slang genom en lämpligt dimensionerad avtagbar nål kompressionskoppling.
  4. Innan du laddar den virala vektorn, ta bort luftbubblor från pumpsystemet inklusive slang, spruta och mikropipett genom att fylla systemet med mineralolja färgad med Sudan röd IV (~ 1 mg / 50 ml) i en 1 ml spruta med en nål (27 G ).
  5. Placera en ren bit parafilm under glasmikropipett och fördela 5 - 10 ul av den virala vektorn på parafilm.
  6. Suga den virala vektorn genom att förflytta sprutkolven bakåt vid 0,5 | il / min och markerar gränsen mellan vektorn och oljan på glaspipett.

1.2) Anestesi, klippning, HEAD Fixering och Förberedelse för Kraniotomi

  1. Sätta en mus (P49-63, C57BL / 6) i kammaren fylld med N 2 O och O 2, och 5% isofluran. Bedöma djupet av anestesi genom förlust av målmedveten rörelse och en saktade andningsfrekvensen (~ 60-90 / min). Klipp håret på huvudet när musen bedövas.
  2. Montera musen i stereotaktisk ram, med huvudet fast med trubbiga örat barer och nosen placeras i en narkos och ventilationssystem. Upprätthålla kontinuerlig isofluran vid 2 - 3%. Applicera artificiella tårar salva i båda ögonen eftersom möss förlorar sin blinkreflex under narkos.
  3. Administrera 0,05 ml av Buprenorfin (0,1 mg / ml) subkutant för smärtlindring.
  4. Rengör operationsområdet med 10% povidon jod och 70% alkohol tre gånger, omväxlande mellan de två lösningarna och börjar med povidonjodid. Börja framifrån och torka bakåt för att avlägsna eventuella redan skurna hårstrån.
  5. Gör ett snitt i huden på topp of huvudet som startar mellan ögonen och slutar mellan öronen.

1,3) Kraniotomi och microinjections

  1. Ta benhinnan genom att dra med en bomullstuss och sedan torka ytan av skallen med tandbomullstussar. Gör en markering runt injektionsstället, och borra runt kanten av varumärket med hjälp av en liten stål burr drivs av en höghastighetsborr.
  2. Ta bort ben och rengör ytan med koksaltlösning.
  3. Placera pipetten i vänstra dorsala laterala striatum med följande koordinater (mm): främre-bakre 0,8, medial-lateral: +2,0, dorsal-ventral från pial ytan: -2.4 13. Notera att dessa koordinater innebär att spetsen på mikroinjektion nålen sitter precis ovanför dorsolaterala striatum (Figur 1A, B), vilket innebär att det bara något tränger inom denna kärna. Undvik skadliga blodkärl. Om pipetten råkar vara rätt på ett blodkärl, något justerakoordinater från ~ 0,1-0,2 mm.
  4. Börja injektion med injektionshastighet inställd på 0,2 | il / min och typiskt injicera 1-1,5 il av viruset.
  5. Låt pipetten på plats efter injektion under 10 minuter, och sedan dra tillbaka pipetten långsamt.
  6. Avsluta genom att stänga operationssåret med kontinuerlig sutur extern nylonsutur.

1,4) Återhämtning

  1. Placera musen i en ren bur på en värmedyna för 24 h. Skicka inte tillbaka en mus som har opererats för sällskap med andra djur förrän återhämtat sig helt. Lämna inte musen utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala VILA.
  2. Lägg Trimetoprim Sulfamethoxiazole (5 ml per 500 ml vatten, som innehåller 40 mg trimetoprim och 200 mg sulfamethoxiazole) i vattnet i en vecka. Administrera Buprenorfin två gånger per dag i upp till 3 dagar efter operationen.
  3. Behåll musen på en 12 timmar ljus-mörker-cykel, utfodras och vattnas dagligen, ennd viktas en gång per dag i upp till tre dagar efter operationen. I dessa 3 dagar, varje mus med en förlust av mer än 10% kroppsvikt betraktas som äventyras, och kommer att avlivas i stället för att utsättas för experimenterande.
  4. Separat ändra musen buren två gånger per vecka, och övervaka för allmän hälsa minst en gång per dag. Typiskt musen används inom 2-3 veckor efter det stereotaktiska microinjections.

2. Akut Brain Slice Förberedelser för Confocal Ca 2 + Imaging

2.1) Beredning av Cutting och Recording Solutions.

  1. Förbereda skär lösning innefattande (mM): 194 sackaros, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-glukos, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, och 26 NaHCOs 3, mättades med 95% O2 och 5% CO2.
  2. Förbered inspelning lösning innefattande (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glukos, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 3; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm, mättades med 95% O2 och 5% CO2. Fyll hjärnan skiva håller bägare med inspelning lösning, och hålla den vid 34 ° C.

2,2) Skivning

  1. Två till tre veckor efter stereotaktiska microinjections, djupt och obotligt söva musen, och sedan halshugga den.
  2. Utdrag hjärnan, och använda ett blad för att ta bort icke injicerade högra hjärnhalvan, och montera den vänstra på vibratome brickan med hjälp av superlim. Fyll vibratome facket med iskall skär buffert, och hålla mättar den med 95% O2 och 5% CO2.
  3. Skär koronalt eller sagittal striatala hjärnan skivor på 300 ìm tjocklek. Vanligtvis 4-5 koronala, eller 6 - kan 7 sagittal striatala skivor samlas.
  4. Överför skivorna till segmentet håller bägaren värms vid 34 ° C, och hålla dem där i 30 minuter innan du förvarar dem i rumstemperatur för efterföljande recording.
  5. Inkubera hjärnan skivor i syresatt inspelning buffert vid rumstemperatur i minst 30 min innan [Ca2 +] i bildbehandling.

3. Immunohistokemi (IHC)

  1. Två veckor efter virusinjektion, BEGJUTA musen transkardiellt med PBS, följt av 10% formalin i PBS.
  2. Ta bort, efter fixa över natten och cryoprotect hjärnan i buffrad 30% sackaros under minst två dagar.
  3. Förbered 40 ìm sektioner med en kryostatmikrotom.
  4. Skölj avsnitt 3 gånger med PBS vid 10 min intervall.
  5. Inkubera sektioner för 1 h i PBS med 10% normalt getserum och med 0,5% Triton X-100.
  6. Inkubera sektioner över natten vid 4 ° C i primära antikroppen framställd i PBS med 0,5% Triton X-100. De primära antikropparna som användes var följande: kyckling anti-GFP-1: 1000, mus-anti-S100β 1: 400, mus-anti-NeuN 1: 600, mus-anti-glutaminsyntetas 1: 300.
  7. Skölj avsnitt 3 gånger med PBS vid 10 mi intervaller.
  8. Inkubera sektioner med de sekundära antikropparna framställda i PBS med 10% normalt getserum under 2 timmar vid rumstemperatur. De andra antikropparna var följande: get-anti-mus-Alexa546 1: 500, get-anti-kyckling Alexa488 1: 500.
  9. Montera avsnitten om glasskivor, torra och applicera flera droppar av antifade monteringsmedium, sedan sakta täcka sektioner med ett täckglas. Lagra objektglasen vid 4 ° C.
  10. Ta bilder på en konfokalmikroskop med 40X oljeimmersionslins med en numerisk bländare på 1,3.

4. Confocal [Ca2 +] i Imaging

OBS: [Ca2 +] i imaging utfördes med hjälp av en konfokalmikroskop med 40X vatten nedsänkning objektiv med en numerisk bländare på 0,8.

  1. Mellan 1 och 5 h efter skivning, plats skiva i inspelningen kammaren och superfuse med syresatt inspelning buffert vid rumstemperatur med flödeshastighet av 1-2 ml permin. Placera sedan en platina harpa med nylonsträngar ovanpå slice för att minimera rörelser under experimentet.
  2. Visualisera och lokalisera dorsala striatum med ljusa fält luminiscens under 10X nedsänkning i vatten mål.
  3. Växla till 40X nedsänkning i vatten objektiv, och slå på 488 nm linje Argon laser. Genom att ändra fokalplanet, hitta celler som ligger ca 20 nm under slice ytan, visar basal fluorescens i soma, grenar och grenarna. Att notera, komprometterade celler visar oftast fluorescens nivå över genomsnittet, vilket bör undvikas.
  4. Använd "frame scan" läget för att börja skanna. Vanligtvis laserintensiteten justeras till 0,5 - är tillräckligt för att bilden [Ca2 +] i med cyto-GCaMP3 5% av maximal effekt. För övervakning [Ca2 +] i dynamiken inom hela territorium astrocyter, den "frame scan" med en skanningshastighet på 1 sek per ram eller snabbare är rekommendernded, men detta måste beslutas beroende på experimentet i fråga.
  5. Om det behövs, för att bilden [Ca2 +] i i processer använda digital förstoring av 2-3 gånger för att övervaka 1 - 2 astrocyter i hela synfältet.
  6. För att undvika mättade pixlar under inspelning, använd "Hilo" lookup läget att pseudo cellerna. Börja alltid med en "pilotinspelning" för ca 5 min, för att testa om röd färg visas som tecken på mättnad. Om så är fallet, sänker laseruteffekten, eller sänka PMT / Gain / offset värden och utföra en annan pilotinspelning för att testa pixelvärdena är i den icke mättade sortimentet. Typiskt, de kombinerade parametrar som används för avbildning astrocyt [Ca2 +] i i striatum är följande: laser uteffekt 0,5-5% (10 mW), PMT 550-650 volt, Gain 2,0 - 3,5X, och offset 0 - 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För astrocyt specifikt uttryck av cyto-GCaMP3 i striatum, använde vi adeno-associerat virus (AAV) i 5 serotyp och GFAP GfaABC en D-promotorn (Figur 1 A), som tidigare har visat sig driva robust GCaMP3 och reportergen uttryck i hippocampus och kortikala astrocyter 8,14. Två veckor efter virusmikroinjektion i musen striatum, var musen (~ 10 veckor) perfusion och IHC utfördes på tunna hjärnan sektioner för att utvärdera cyto-GCaMP3 uttryck i striatum (Figur 1B). Vi upptäckte cyto-GCaMP3 hjälp av GFP antikroppar och även färgas skivorna med känd astrocyternas markör, S100β. Cyto-GCaMP3 uttryck bara i S100β positiva celler. Inget uttryck återfanns i neuroner visualiserade med NeuN (figur 2A och 2B), vilket antyder astrocyt specifik expression. Viktigt var cyto-GCaMP3 uttryck detekteras i ~ 60% av S100β positiva celler (Figur 2C).

Astrocyter svarar på hjärnan förolämpningar såsom skada, ischemi och infektion genom att visa förändringar som har blivit känd som astrocyternas reaktivitet, som representerar ett spektrum av potentiella förändringar från mild till svår 15. Vi försökte utvärdera om virusmikroinjektion orsakade öppen astrocyternas reaktivitet. Det har tidigare visats att reducerade expressionsnivåer av glutaminsyntetas (GS) var associerade med de reaktiva astrocyterna 16,17. Därför var GS uttryck i striatum hos WT och virus injicerade möss jämförs. Vi fann inga signifikanta förändringar i GS uttryck i striatala astrocyter efter virus injektion (Figur 3A - C), vilket tyder på någon uppenbar astrocyternas reaktivitet använder GS nivåer som en måttenhet. Denna allmänna strategi skulle kunna utökas i det fortsatta arbetet för att utvärdera astrocyternas reaktivitet med hjälp av andra markörer för reaktivitet. Observera dock att GFAP-nivåer inte kan vara ett lämpligt sätt att mäta reaktiviteten i striatal astrocyter, eftersom GFAP inte uttrycks på detekterbara nivåer i de flesta striatala astrocyter under basala förhållanden 18. Sammanfattningsvis, med hjälp av IHC vi konstatera cyto-GCaMP3 uttryck var robust och specifik för astrocyter i striatum, och att virus injektion orsakade inte astrocyternas reaktivitet enligt bedömning av GS förändringar uttrycksnivå.

Vi nästa beredda akut hjärnan skivor från virus injicerade möss till bild [Ca2 +] i i striatum astrocyter. Akuta 300 um tjocka sagittala eller frontala skivor var beredda, och efter en period av återhämtning skivorna placerades i en inspelning kammare på ett konfokalmikroskop för [Ca2 +] i avbildning med hjälp av 488 nm linje en Argon laser. Striatala astrocyter uttrycker cyto-GCaMP3 skulle lätt kunna identifieras i de flesta (oftast alla) av de striatala skivor (~ 6-7 skivor per mus), eftersom de visade synliga grön fluorescens i celler med tydligt buskig morfologi (Figur 4 fig 4A; minst 10 astrocyter visar cyto-GCaMP3 kunde avbildas och plottas i figur 4A som områden av intresse (ROI). Högre förstoring avbildning med en extra digital zoom av 2,0-3,0 var nödvändigt för att identifiera enskilda astrocyter (Figur 4B). Under dessa omständigheter var hela astrocyternas territorier avslöjades av cyto-GCaMP3 uttryck, som visas i figur 4B. Ades Spontana Ca2 + signaler lätt mätas i somata liksom i grenar och grenarna av astrocyter 6.

Figur 1
Figur 1: Viral leverans av GECIs (t.ex. cyto-GCaMP3) genom AAV2 / 5 i den vuxna musen striatum. A. Schematisk illustrerar protokollet för AAV2 / 5 microinjections i dorsolaterala striatum.B. Visar den ungefärliga positionen för mikroinjektion nålen i förhållande till striatum och koordinaterna som används för stereotaktiska injektioner. Bilden av en Nissl-färgade skiva i panel B var ned från ALLEN BRAIN ATLAS.

Figur 2
Figur 2: Cyto-GCaMP3 uttryck var specifik för striatala astrocyter. A - B. Bilderna visar att cyto-GCaMP3 uttryck colocalizes med en markör för astrocyter (S100β) (B), men inte med en markör för neuroner (NeuN) (A) C. Sammanfattning stapeldiagram för colocalization experiment som de visas. i A och B.

Figur 3
Figur 3: Cyto-GCaMP3 uttryck inom striatala astrocyter inte orsaka förändringar i uttrycket av GS.A - B. Bilderna av GCaMP3 och GS IHC från möss som hade fått AAV2 / 5 för GCaMP3. Bilder för kontroll icke injicerade möss visas också. C. Stapeldiagram sammanfattar resultat från experiment som de i A och B (ns tyder inte signifikant med hjälp av ett oparat Students t-test, p <0,05).

Figur 4
Figur 4: Representativa exempel på [Ca2 +] i signaler som spelats in från striatala astrocyter med cyto-GCaMP3. A. En tillplattad z-stack bild som visar 10 astrocyter (numrerade 1 - 10) .Den spår nedan visar [Ca2 +] i signaler noterats under 5 min från 10 celler som visas i A B. En tillplattad och zoomas in z. -stack bilder för ett enda astrocyte.The spårar nedan visar [Ca2 +] isignaler noterats under 5 min för enskild cell som visas i B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som beskrivs här har gett oss möjlighet att uttrycka cyto-GCaMP3 i striatala astrocyter in vivo för efterföljande [Ca2 +] i avbildning på plats. Denna metod har fördelar jämfört med att använda transgena eller knock-in möss, däribland robust uttryck av det riktade protein, snabbhet och flexibilitet i experimentell implementering och anatomiska specificitet. Uttrycket av GCaMP3 använder AAV2 / 5 befanns vara specifika och robust. Kombinationen av GFAP GfaABC 1 D-promotorn med AAV av serotyp 5 är avgörande för att uppnå specificitet. En begränsning av den teknik som beskrivs här är att virusinfektion och kirurgi förfarande kan orsaka astrocyternas reaktivitet, speciellt med hög titer virus 19. Viktigt i den aktuella studien, AAV2 / 5 microinjections med en relativ låg titer orsakade inte sänkningar av GS som har förknippats med astrocyternas reaktivitet 19. Liknande kontroller har rapporterats för hippocampal astrocyter 8. Det är emellertid viktigt att betona nödvändigheten av dessa kontroller för varje hjärna område som skall undersökas, inte minst på grund astrocyter är heterogena 20, och eftersom de sannolikt har olika funktioner i distinkta regioner av hjärnan.

En av de viktigaste faktorerna som kan påverka robusthet riktade genuttryck användande virus mikroinjektion är koordinaterna i bruk, vilket varierar mellan olika musstammar och förändringar under utvecklingen av djuren. Endast C57BL / 6-möss av ~ 8 veckor gamla användes i hela denna studie. Det har också visat sig att viral uttryck av GFP i striatala nervceller och astrocyter i råttor kunde detekteras 4 dagar efter injektionen, nått en platå med 2 - 4 veckor efter injektion, och sedan förblev stabila under 9 månader efter injektion 21. Tidsförloppet av cyto-GCaMP3 uttryck inte exakt fastställt här, men åtminstone två veckor för virusuttryck ärrekommenderas.

Kan nu användas Metoden med AAV2 / 5-medierad uttryck av GECIs i striatala astrocyter att bättre förstå astrocyt [Ca2 +] i signalering i striatum. Specifikt är cyto-GCaMP3 uttrycksnivå är tillräckligt hög för att tillåta avbildning av [Ca2 +] i signaler i små populationer av astrocyter (~ 10 celler) och inom hela territorier enstaka astrocyter. Den detaljerade analysen av [Ca2 +] i signaler pågår fortfarande, men hittills [Ca2 +] i signaler har upptäckts från distala processer så långt ~ 50 pm från soma (Figur 4). Detaljerade experiment på astrocyt [Ca2 +] i signaler och deras korrelat och orsakande funktioner inom striatum är genomförbara. I framtiden, raffinerade metoder (dvs, promotorer) behövs för att leverera GECIs genetiskt definierade populationer av astrocyter, så att man kanutforska kalciumsignalering i olika populationer av astrocyter 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Huvuddelen av arbetet och den personal som stöddes av NIH bidrag NS060677, dels av NIH bidrag MH099559 och MH104069 (BSK). En del av arbetet har också stöd av CHDI Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. Waltham, MA. (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics