Orofasial fenotipleri Niceleme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Xenopus kraniyofasiyal gelişimi ve kusurları yöneten mekanizmaların diseksiyon için önemli bir araç haline gelmiştir. Orofasyal gelişimini ölçmek için bir yöntem olup, genetik veya moleküler gen ekspresyonunu ve protein işlevini değiştirmek mümkün olan maddeler ile kaldırılması üzerine orofasial fenotipleri daha titiz analizi için izin verir. Embriyonik başkanlarının iki boyutlu görüntülerini kullanarak, geleneksel boyutların-gibi orofasyal genişlik, yükseklik ve alan-ölçülür. Buna ek olarak, embriyonik ağız açıklığı bir yuvarlaklık ölçü ağız şeklini tarif etmek için kullanılır. Bu iki boyutlu görüntü Geometrik Morfometri da oral bölgede şeklindeki değişiklikler arasında daha sofistike bir görünüm temin etmek üzere gerçekleştirilir. Merkezi orofasial bölgedeki belirli noktalara atanan ve koordinatlar oluşturulur. Bir ilke bileşen analizi, daha sonra tedavi ayrımcılık ilkesi bileşenleri dönüm koordinatları azaltmak için kullanılırgrupları. Bu sonuçlar benzer orofasiyal şekilleri ile bireylerin birlikte küme hangi bir dağılım grafiği olarak gösterilir. Ayrıca istatistiksel olarak iki tedavi grubu arasındaki yerlerinden pozisyonlarını karşılaştıran bir diskriminant fonksiyon analizi yapmak için yararlıdır. Bu analiz, dönüm pozisyonda değişiklikler vektörler olarak görülen bir transformasyon ızgara üzerinde gösterilir. Bir ızgara, bir eğirme düzeni önemli bir merkezi nokta pozisyonları değişti yeri göstermek için görüntülenen ve böylece bu vektörlerin bindirilir. Ayırt edici fonksiyon analizinde, şekil değiştiren bir istatistiksel ölçüme dayanmaktadır ve bu nedenle, bir p-değeri ile değerlendirilebilir. Bu analizi sadece bir Stereoskop ve ücretsiz bir yazılım gerektirmeden, basit ve erişilebilir ve böylece değerli bir araştırma ve öğretim bir kaynak olacaktır.

Introduction

Insan doğum defektleri en sık ve yıkıcı türleri arasında böyle orofasial yarıkların 1 olarak ağız ve yüz etkileyen olanlardır. Malforme orofasiyal yapıları ile çocukların yaşamları boyunca birden fazla ameliyat geçiren ve yüz disfigurements, konuşma, işitme ve yeme sorunları ile mücadele. Bu nedenle, Kranyo- ve orofasyal gelişiminde yeni araştırmalar kolaylaştırmak insanlarda doğum kusurları bu tür önlenmesi ve tedavisi için çok önemlidir. Xenopus laevis kraniofasyal gelişimi yöneten mekanizmalar diseksiyon için yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır (bazı örnekler 2,3,4 dahil -11). Bu nedenle, bu türün baş geliştirme ve yüzü boyunca boyut ve şekil değişiklikleri analiz etmek için bir miktar belirleme yöntemi 3 çok güçlü olabilir.

Burada, biz böyle bir yöntem mevcut; Bir Xenopus çalışmada 12 uyarlanmıştır geometrik morfometrik geleneksel boyut ölçümlerinin bir araya getirilmesiyle 13-15 analiz eden çalışmaların sup> ve bir servet. Bu protokolün amacı, araştırmacılar, normal ve anormal gelişim sırasında farklı orofasial fenotipleri arasında ayrım yüz boyut ve şekil ölçmek için izin vermektir. Bu analiz, genler ve / veya çevresel faktörlerin sinerjistik etkilerinden kaynaklanan bu gibi ince kraniofasyal kusuru arasındaki farkı daha iyi sağlayacaktır. Ayrıca, bu ölçme yöntemi de orofasial kusur bile hafif bir iyileşme veya kurtarma ortaya koyabilir. Bu nedenle muhtemel terapötik analiz etmede yararlı bir rehber yapar.

Sunduğumuz yüz ölçümleri ve geometrik morfometrik kombinasyonu genelde sadece bir ya da diğer 15-18 kullanmak büyüklüğü ve mevcut protokoller daha orofasial bölgenin şekli hem daha kapsamlı istatistiksel analiz sağlar. Ayrıca, biz medial ve lateral uçakları hem değerlendirmek için basit bir yol sunmakmevcut çalışmalarda 13,19 kullanılan gelişmiş üç boyutlu görüntüleme ekipmanı gerektirmeden yüzü.

Biz Xenopus Bu protokol anormal orofasial geliştirme ve bir orta yarık damak 2,3 oluşturan bir retinoik asit reseptörü inhibitörü ile işlemden geçirildi embriyolar laevis göstermektedir. Bu embriyolar oral bölgede boyutları ve şekli Niceleme içindeki damak yarıkları ve fare modellerinde 20,21 insanlarda benzer olan orta yüz değişiklikler açığa çıkarmıştır. Bununla birlikte, bu protokol, örneğin büyüme faktörleri gibi doğal maddeler, herbisitler, veya proteinler gibi orofasyal geliştirilmesi için diğer bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Bundan başka, kayıp ya da fonksiyon deneylerinin kazancı ile gen ekspresyonunun pertürbasyon kaynaklanan orofasial boyut ve şekil değişiklikleri, (antisens morpholinos veya Crispers kullanarak / Talens) da bu protokol kullanılarak tayin edilebilir. Son olarak, bu yöntem, karakteristiklerin geliştirilenLly Xenopus morfolojisi değerlendirilmesi; Bununla birlikte, kolaylıkla bir omurgalının analizi için modifiye edilir. Diğer uygulamalar da evrimsel ve ekolojik çalışmalar için yakından ilişkili türlerin karşılaştırıldığı için bu protokolü kullanarak içerebilir. Burada temin örneğin oral bölgede analizini tarif etmek için bu protokolü kullanır iken, kolaylıkla diğer bölgelerde, organlarda ya da yapıların analizi için modifiye edilebilir.

Bu orofasial ölçümü protokol araştırma toplum için değerli bir kaynak, hem de bir video gösterisi olarak lisans öğrencileri için mükemmel bir eğitim aracı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Xenopus laevis kullanılarak gerçekleştirilen tüm deneyler, IACUC (protokol # AD20261) tarafından onaylanmıştır.

1. Hazırlanması Reaktifler ve Gerekli Malzemeler

  1. Reaktifler:
    1. 10x MBS (Modifiye Barth Salin) solüsyon 22 1 L olun. Damıtılmış su, 1 L NaCl (880 mM), KCI (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7.8) ve NaHCO3 (25 mM) eklenir. NaOH ile 7.8'e pH ayarlayın.
    2. Damıtılmış su içinde 900 ml 10x MBS çözeltisi 100 ml seyreltilmesiyle 1x MBS 1 L olun. 1 M CaCI2 çözeltisi 0.7 ml ilave edilir.
    3. Damıtılmış su içinde 900 ml 1 x MBS çözeltisi 100 ml seyreltilmesi ile 0.1x MBS 1 L olun. 0.1x MBS çözeltinin 1 l'ye kadar, embriyo kültürü kullanım için 10 mg / ml gentamisin çözeltisi 1 ml.
    4. 10x MBS, 100 ml 5 M NaCI 4 ml eritilmesi ile yüksek tuz MBS olun. Toplam hacmi 1 L olana kadar distile su ekleyin
    5. % 100 e seyreltilmesi ile% 70 etanol olun% 70 etanol -metanol damıtılmış su kullanarak.
    6. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM stok çözeltisinin hazırlanması, BMS-543 olun.
    7. 50 ml damıtılmış su ile paraformaldehit toz 4 gramı ekleyerek% 4 paraformaldehit (PFA) konur. Çözüm netleşene kadar sıcak bir plaka üzerinde ısı yaklaşık hangi noktadan 65 ° C, 5 M NaOH damla damla ekleyin.
      1. Çözüm temizler sonra, PBS 2x 50 ml ve 100 ul Tween-20 ısı kaldırmak ve ekleyin. Buz üzerinde oda sıcaklığına soğumaya bırakın. HCI kullanılarak 7.2 ile 7.5 arasında pH ayarlayın.
    8. 8 g NaCl, 0.2 g KCI, Na 2 HPO 4, 1.44 g, ve distile su, 800 ml KH 2 PO 4, 0.24 g çözülmesiyle Tween (PBT) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi olun. HCI kullanarak, pH'ı 7.4'e ayarlayın. Tween-20 2 ml ilave edilir. Eşittir 1 L damıtılmış su ile nihai bir hacim ayarlama
    9. 50 ml distile su veya 0.1x MBS sistein 1 g eriterek bir sistein çözüm yapmak. 5 M NaOH, 1.5 ml ekleyinnd 7.8'e pH ayarlamak.
    10. 100 ml% 100 EtOH Benzokain tozun 10 gramı ekleyerek% 10 Benzokain stok çözelti yapmak. Yetişkin erkek ve sabitleme için hazır embriyo ötanazi için,% 0.05 çözüm sulandırmak.
    11. L15 tamponu 9 ml buzağı serum, 1 ml ekleyerek testis depolama çözümü olun.
  2. Gerekli Araç ve Gereçler:
    1. Malzeme ve Ekipmanları Tablosu'nda listelenen teçhizatın temin Şekil 1'de gösterilmiştir.
    2. Bir pipet aracı değiştirin. Bir Bunsen beki bir alevi içine bir cam Pasteur pipet ucu yerleştirin. Erir ve bir yuvarlak mühürlü ucunu oluşturan kadar pipet döndürün.
    3. Tüm plaka kapsayacak şekilde yumuşatarak, bir plastik Petri kabı dibine modelleme kil düzleştirmek (herhangi bir boyut kullanılabilir) (Şekil 1Aiv).
      1. Hafifçe 45 ° açıyla kil astarlı çanak içine düz bir alay iğne basın. Petri hareket yavaş yavaş oraya iğne tutun vedepresif bir çizgi (Şekil 1Bi) oluşturmak için yatay çanak. Satır istenilen sayıda tekrarlayın.
      2. Fotoğraflarken embriyoların organize embriyo başlarını (Şekil 1Bii) ve yardım yerleştirmek için kil astarlı çanak her satırda sığ, dairesel çöküntüler yapmak için bir cam pipet aracı ucunu kullanın.
      3. Fotoğrafçılığı için, PBT (Şekil 1Biii) ile çanak doldurun. Kullanımlar arasında,% 70 etanol, ardından steril su ile çanak ve kil yüzey yıkayın.

2. Xenopus laevis Embriyo Kültürü ve Önleyici Tedaviler

  1. Xenopus yumurta invitro fertilizasyon ve kültür:
    1. Elde ve kültür Xenopus standart yayınlanmış yöntemler 22,23 kullanılarak embriyolar laevis'den.
    2. Kısaca,% 0,05 Benzokain çözeltisi içinde dalma yetişkin bir erkek euthanize. Testisler depolama tamponunda testisler ve mağaza teşrih. Enjekte etmekinsan koryonik gonadotropin (HCG) ile yetişkin kadın, yüksek tuz MBS yumurta toplamak ve (Şekil 2A, B) disseke testis ile in vitro döller.
    3. 15 ° C'de 0,1 x MBS, kültür embriyoları, istenilen kademe (Nieuwkoop ve Faber 24,25 ile Xenopus laevis olan Normal tabloya göre evre embriyolar) ulaşılana kadar.
      1. Burada, sahneye 22 (24 saat sonra döllenme (hpf)), ve bilenmiş forseps iki çift kullanarak steromikroskopla Vitellin membran kaldırmak kadar kültür embriyolar. 0.1x MBS 30-40 ml içeren temiz bir Petri kabı (çapı 100 mm) standart, tek bir transfer pipet embriyolar transfer.
  2. (Şekil 2'de gösterilen) Xenopus embriyolar önleyicisi tedavileri:
    1. Bir kalibre pipet-adam kullanarak 0.1x MBS 1 ml ile 24-iyi bir kültür çanak gerekli kuyu doldurun. Ince bir nokta işareti ile kuyunun dışında ayırmaker (Şekil 2B, ek). Ayrıca, içeriği 24 oyuklu bir kültür kabı kapağı, her oyuğa ilave edilmesi etiketlemek için işaretleyiciyi kullanın. Laboratuvar defterine bir 24-iyi set-up sayfa üzerine bu bilgileri kopyalayın.
    2. Iyi bir standart, tek transferi pipet (Şekil 2C) kullanarak her içine 5-10 embriyolar aktarın. Her bir embriyo aynı sayıda yerleştirin.
    3. Kontör veya 1 ml işaretli çizgiye (Şekil 2D) ile düz olacak şekilde 0.1x MBS çıkarın. DMSO uygun hacimde ekleyin (nihai DMSO hacmi olacak şekilde% 1) ve hafifçe karıştırılır. Embriyolar çok yakın DMSO eklemek için dikkatli olun ve tampon yüzeyi ile embriyoların temasından kaçının.
    4. Belirlenmiş oyuklara kimyasal uygun hacimde ekleyin ve yavaşça yeniden girdap. Burada, 1 mi 0,1 x MBS için 10 mM BMS-453 (retinoik asit reseptörü antagonisti) ve DMSO 9 ul 1 ul ekle.
    5. Kimyasal ışığa duyarlı ise, gevşek kültü sarınalüminyum folyo Ture çanak. İstenen aşamasına kadar 15 ° C kuluçka makinesi içinde, kültür embriyoları. Bu örnekte, 16-18 st için embriyolar tedavi.
  3. Tedavi dışında embriyo Yıkama ve iribaş evrelerine kadar yetiştirme:
    1. Tek kullanımlık bir transfer pipeti ile çözeltinin dörtte üçü kadar bir buçuk çıkarın. Embriyolar rahatsız etmemek için dikkatli olun. Yeni bir transfer pipet kullanarak, 0.1x MBS ile kuyu doldurun. Bu 3-6 kez tekrarlayın.
    2. Gentamisin ile 0.1x MBS, 100 ml (1 ml / L) ihtiva eden büyük bir petri kabının (çapı 150 mm) embriyo transferi. Onlar evre 42-45 (82-100 HPF) ulaşana kadar 15 ° C'de embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
    3. Günlük 0.1x MBS çözüm içeren gentamisini değiştirmek ve diğer embriyoların kirlenmesini veya ölümü önlemek için derhal ölü embriyolar kaldırmak. Laboratuvar defterine ölü embriyo sayısını kaydedin.
  4. Paraformaldehid sabitleme embriyolar (PFA):
    1. Aşamalarda 42 ve 45 (82 ve 100 arasında embriyolar Fix0.1x MBS 1-2 ml içeren yeni bir 24-iyi bir kültür kabına aktararak sırasıyla hpf). Tedavi kurulum yukarıda tarif edildiği gibi, aynı bilginin (bölüm 2.2.1) ile kapak etiketleyin.
    2. Hala kapalı embriyolar bırakarak ve yaralanmaları önlemek için minimal temas sağlarken, her bir kuyunun mümkün itibaren çok 0.1x MBS çıkarın. 0.1x MBS% 0.05 Benzokain çözüm 1-2 ml ekleyin ve embriyolar artık uyaranlara duyarlı kadar kuluçkaya yatmaktadır.
    3. % 4 PFA 1-2 ml ekleyin. Tercih edilen, alternatif olarak, sabitleme için etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerinde embriyolar yerleştirin.
    4. Dönen bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 24 saat boyunca PFA embriyolar inkübe edin. 3-5 saatlik bir süre zarfında PBT 3-4 yıkar yaparak PFA çıkarın.

3. Xenopus iribaşların Orofasial Region Fotoğrafçılık

  1. Ön fotoğraflar ve hazırlanması (bu, Şekil 3'te gösterilmiştir):
    1. (150 büyük bir Petri kabındaki sabit embriyolar yerleştirinPBT, yaklaşık olarak 100 ml içeren mm çapında).
    2. Vücudun (Şekil 3A, düz siyah çizgiler) den kafasını koparmaya iki kesiler olun. İlk olarak, bir çift forseps ile embriyo tutun ve steril bir bisturi (Şekil 3B) ile gut arka tarafında bir kesik. Tamamen kafa (Şekil 3C) çıkarmak için, kalbe yakın bağırsak, ön tarafında ikinci bir kesi olun.
    3. Pipet standart, tek transferi pipet kullanarak kil astarlı çanak (bölüm 1.2.2) içine embriyo kafaları kopmuş.
      1. Frontal görünümler için, dairesel çöküntüler içinde aşağı embriyo başkanları arka tarafında konumlandırmak için forseps iki çift kullanın. Forseps kullanılarak embriyo baş ve çevredeki kil, onlar kamera karşı karşıya ve ileri veya iki tarafında (Şekil 3D) eğildiğinde olmayan şekilde pozisyon embriyolar hem işlemek için. Yavaşça forseps ve / veya camını kullanarak başının etrafında çevreleyen kil itinpipet aracı yerine kafasını sabitlemek için.
      2. Lateral görünümde, onlar aynı yöne bakan, kendi tarafında, ve kil karşı düz şekilde dairesel çöküntü içinde embriyo kafaları konumlandırmak için forseps kullanabilir. Embriyo kafa ve tüm embriyo çimento bezleri aynı açı (Şekil 3E) aşağıya doğru düzenlenmiştir, böylece çevredeki kil işleyin. Yanal ölçüm yaparken doğruluğunu sağlamak için bir rehber olarak alay iğne ile çizilmiş satırları kullanın.
  2. Iribaş başının görüntülerini yakalama:
    1. Ekli bir dijital kamera ve ilgili kamera yazılımı ile herhangi bir diseksiyon mikroskobu kullanarak tadpole başkanı fotoğraflamak. Tüm embriyo sabit tutulabilir yüksek büyütme kullanın.
    2. Embriyolar merkezi ve aynı yönde hepsini karşı karşıya. Orofasial bölgenin en doğru görüntü için izin en iyi aydınlatma koşullarını kullanarak görüntüleri yakalayın. Pozisyonışıklar aşırı gölgeleri önlemek için. .tiff Mümkün olan en yüksek çözünürlükte dosyaları resim olarak kaydedin.

4. Ölçme ve Xenopus Tadpoles Yüz Boyut Boyutlar Analizi

  1. (Şekil 4 özetlenmiştir) orofasial boyutlarını ölçün:
    1. Yüz genişliğini belirleyin. Her gözün ventral kısmı yüz (Şekil 4A, oklar) varoşları karşılayan hangi noktaları belirlemek ve bu noktaları (Şekil 4A, kırmızı çizgi) arasındaki mesafeyi ölçün.
    2. Yüz yüksekliğini belirler. İlk olarak, her göz arasındaki mesafeyi ölçmek ve yarım işareti hesaplayarak orta hat belirler. Sonraki, gözlerin dorsal en kenarları ve dorsal çimento bezinin (Şekil 4B, beyaz çizgiler) çoğu nokta işaretlemek yatay çizgiler çizin. Orta hatta, yatay çizgi (Şekil 4B, kırmızı çizgi) arasındaki mesafeyi ölçer.
    3. T belirleyinO orofasial alanı. Alan ölçümünü kılavuz gözleri ve çimento bezin dorsal kenarları (Şekil 4C, beyaz çizgiler) işaretinin aynı yatay çizgiler kullanın. Çimento bezinin üst işaretleme yatay çizgi yüzü (Şekil 4CA) sol yanının çevresine uygun noktada başlar.
      1. Gözün üst işaretleme yatay çizgi yüzü (Şekil 4Cb) çevre kenarı ile birleştiği noktaya kadar göz kapsayan yüzün kenarı boyunca izleyin. Bu yüzü (Şekil 4 ml) 'in sağ tarafında çevresini uygun noktaya kadar, bu sırt en yatay hat boyunca takip devam edin.
      2. Çimento bezinin üst işaretleme ventral çoğu yatay çizgi yüzü (Şekil 4CD) sağ tarafındaki çevresini uygun noktaya kadar göz kapsayan yüzün kenarı boyunca aşağıya doğru iz. Bu alt yatay çizgi UNT boyunca iz Devamil bu izleme başladı noktasını karşılar. İzlemenin içindeki alanı hesaplamak için fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın.
    4. Burun uzunluğunu belirler. Yanal görüntülerde, gözün anterior işaret dikey bir çizgi yapmak. Daha sonra, yüz, göz (Şekil 4D), ön işareti dikey çizgi çimento bezin sırt kenarı ile birleştiği ön en noktasından yatay mesafeyi ölçer.
    5. Ağız genişliği belirler. Sol ve sağ noktaları arasındaki yatay mesafeyi ölçün nerede açılış ağız buluşuyor (Şekil 4E) üst ve alt "dudak". Bu dudak komissürlerini kurbağa eşdeğer olarak kabul edilebilir.
    6. Ağız yuvarlaklığını belirler. (Burada bir ters boy oranı gibi 4 ağız yuvarlaklığını hesaplamak × [Alan]) / (π × [Ana ekseni] 2 >).
      1. Şekil 4F gösterildiği gibi ağız açıklığının kenarlarını izlemek için bir fotoğraf editörü Kement aracını kullanın. Ana araç çubuğundaki analiz seçin ve ölçün seçin. Seçenek olarak ise, alan ve ağız açıklığının çapının ölçümü ile yuvarlaklığını hesaplar.
  2. Yüz boyutları Veri analizi:
    1. Girdi veri analizi programına yüz boyutları ölçümleri kontrolü ile tedavi grubunu karşılaştırmak. Çubuk grafikler oluşturmak için deney ve kontrol grupları hem de her ölçümün ortalamasını belirleyin. Hata çubukları oluşturmak için standart sapmasını belirlemek. Istatistiksel grupları karşılaştırmak için Student t-testleri gerçekleştirin.
      Not: Bu veriler, düşey embriyolar arasında gelişme biraz farklı oranlarda oldukça değişken olabilir.

Orofasial Shape ve Morfometri 5. Kantitatif Analiz

  1. Yeri görülecek ve Crea(Şekil 5A'da gösterilen) te bölge koordinat dosyası.
    1. Bunlar hedef görüntünün şeklini yakalama ve analiz edilen arka arkaya alınan tüm örnekler için aynı göreli konumda yerleştirilebilir olduğu gibi simge seçin. Bir yapı bütün örneklerde yoksa, bu yapı üzerinde bir dönüm koymayın.
      1. Burada, örneğin gözler, burun delikleri, ağız gibi ayırt edici işaretleri ile Orta yüzde temsil etmek 24 işaretlerini yerleştirin. Tutarlılık için, yeri önceden yerleştirilen (örneğin, ağız noktalarına Şekil 5Ai) görülecek arasında yarım görülecek.
    2. Dönüm noktası koordinatları Yakalama ve "dönüm noktası koordinat dosyasını" yaratmak. Bir iribaş yüz (örneğin, birinci kontrol embriyo) olarak ilk resmi açın.
      1. Ana araç çubuğundaki Eklentiler sekmesini seçin ve açılan menüden Pointpicker seçin. Yerlerine renkli haçlar olarak görünecektir olarak (istenilen yerlerde Ekle Noktaları sekmesini ve yer işaretlerini seçin
      2. Taşı haçlar aracını seçerek yerleştirildikten sonra dönüm yerleri taşıyın. Tüm görülecek resmin üzerine yerleştirilmiş, ana araç çubuğunda göster Sonuçlar sekmesini seçin ve dönüm noktası koordinatlarını görüntülemek ve bir elektronik tablo programı (Şekil 5Aiii) kopyalamak göster (Şekil 5Aii) seçin.
      3. Bir elektronik tablo programı içine bu ilk embriyo bu koordinatları yapıştırırken, verilerin üstünde boş bir satır bırakın. Örnekteki yerlerinden sayısı ile bu boş satır (satır 1), tip "LM =" B sütununu. 24 yerlerine (Şekil 5Aiii, kırmızı kutu) yaratıldığından beri burada, "LM = 24" girin.
      4. Numuneyi tanımlayan bir isim ile veri noktaları, türü aşağıdaki satır "ID =" in. Bu dönüm birinci kontrol embriyo (Şekil 5Aiii, kırmızı ok) koordinat verilerini olduğundan burada Şekil 5Aiii yılında, "ID = CON1" girin.
      5. NOT: Her embriyo "ID =" satırında benzersiz bir ad verilir önemlidir. Bu kontrol grubunda ikinci embriyo olduğundan burada örneğin, bölge koordinatlarının sonraki seti "CON2" nin kimliğini verilir.
      6. Bir metin belgesine tüm ikinci ve üçüncü sütunları kopyalamak ve bir txt dosyası olarak kaydedin.
  2. (Şekil 5B gösterilen) veri analizi için morfometrik yazılım programı kurmak.
    1. Burada, morfometrik yazılım programının ana menüsünde Yeni Veri Kümesi Yarat seçin. Dosya ve uygun kutulara belirlenen verileri Ad (örneğin, "Retinoik Asit Engellenmesi" ve "Yüz görülecek", sırasıyla) pop-up ekranında (Şekil 5Bi). Bir TPS ve sel gibi dosyasını almaEKT veri kümesini (Şekil 5Bi, kırmızı ok) oluşturmak için koordinatların metin dosyası.
    2. Veri hizalama ve Procrust uygun:
      1. Bir Procrust uyum ve uyum gerçekleştirin. , Proje Ağacı sekmesinde ayarlanmış verileri vurgulamak ana araç çubuğunda önbilgiler seçin ve açılır menüden Yeni Procrust Fit.
      2. Principal Axis tarafından hizalayın seçin ve kutunun (Şekil 5Bii, kırmızı ok) altındaki Procrust Fit gerçekleştirin seçin. Açılır menüsünden, Elemelerinde dön Kovaryans Matris (Şekil 5Biii) oluşturun seçin ve Yürüt öğesini.
      3. Sonuçlar sekmesinde kovar Matrix korelasyon görüntüleyin.
    3. Bu deney grubu ya da kontrol grubunda ait olup olmadığını ayırt etmek için uygun sınıflandırıcı değişken veri setinde her bir örnek atayarak "sınıflandırıcı dosyası" oluşturun.
      1. Bir tablo içinde iki sütun etiketleyin. Ilk sütunu başlığını Etiketn "ID" ve giriş ile aynı ID her bir örnek için verilen (örneğin, CON1, RARINHIB1 ve böylece, Şekil 5Biv). Her hücreye bitişik hücresine listelenen numuneye tekabül tedavi grubu "TEDAVİ" ve girdi ile ikinci sütunun başlığını etiketleyin.
      2. Burada, sınıflandırıcılar (Şekil 5Biv) gibi "KONTROL ve RAR ÖNLEYİCİ" etiketleri kullanın. Bir metin dosyasına kopyalayın ve bir txt dosyası olarak kaydedin. Morfometrik yazılım programı içine İthalat Sınıflandırıcı Değişkenler. Tanımlayıcı tarafından Maçı seçin ve metin dosyasını (Şekil 5Bv) açın.
  3. Varyasyon açılır menüsünden seçerek ve Temel Bileşen Analizi (Şekil 6AI) seçerek bir ana bileşen analizi (PCA) dağılım grafiği oluşturun. PC şekil değişiklikleri, özdeğerler ve PC puanları (Şekil 6Aii): Sonraki üç ek sekmeleri görmek için Grafik sekmesini seçin. PC puanları sekmesi b görüntülerProcrust uyum dönüm verileri (Şekil 6Aii) asli bileşeni dağılım grafiğini ivariate.
    1. Ana bileşenler çizilen hangi değiştirmek için, arsa uzayda pop-up menüsünü getirmek ve (Şekil 6Aiii, kırmızı ok) değiştirmek için istenilen ekseni seçin.
    2. Renk Veri Noktaları aracı (Şekil 6Aiii) seçin. Seç sınıflandırıcılar önce her kategori (Şekil 6Aiv) rengini belirlemek için görüntülenen ikinci açılır menüden (Bölüm 5.2.2) ithal etti.
    3. Sonuçlar sekmesinde (Şekil 6AV) her ana bileşen tarafından yakalanan varyans miktarını görüntüleyin. Bir .bmp dosyası olarak ihracat grafiği.
  4. Karşılaştırma sekmesinde (Şekil 6Bi) kapsamında Diskriminant Fonksiyon Analizi seçerek morfometrik yazılım programında bir diskriminant fonksiyon analizi (DFA) dönüşümü ızgara oluşturun. Açılan menüde, uygun veri kümesi sel olmasını sağlamakandırılmaktadır ve veri tipi Procrust-fit koordinatlar olduğunu.
    1. Grupların çiftleri karşılaştırılacak vurgulayın ve 1000 permütasyon testleri (Şekil 6Bii) çalıştırın.
    2. Grafik altında, Biçim Fark sekmesinde (Şekil 6Biii) olarak koordinatları vektör haritasını görüntüleyin. Görüntü ters ise, doğru yönde (Şekil 6Biii) olarak diyagramı çevirmek için arsa uzayda pop-up menüyü getirmek.
    3. Vektörlerin yönü önce analizi (Şekil 6Bii) çalıştıran Diskriminant Fonksiyon Menüsü görüntülenir ikinci karşılaştırıldığında birinci gruptan şekil farkı yansıtır. , Vektörlerin yönünü ters arsa alana açılır menüsünü getirmek ve negatif böylece ölçek faktörünün işaretini değiştirmek için (Şekil 6Biii, iv). Bunun yanında ölçek değeri değeri en betwee bölge pozisyonda istatistiksel farklılıklar gösteren on kat ayarlanırn bozulma olmadan iki grup, genellikle varsayılan (Şekil 6Biv) bırakılır.
    4. Ayrıca pop-up menüde, bir ızgara üzerine vektörleri bindirmek için bir dönüşüm ızgara grafiği değiştirmek (Şekil 6Biii, v).
    5. Açılır menüde ızgarasının yatay ve dikey çizgilerin sayısını belirtin (Şekil 6Biii, v).
    6. Bir .bmp dosyası olarak grafik ihracat.
    7. Sonuçlar sekmesinde (Şekil 6Bvi) kapsamında Procrust ve Mahalinobis mesafeleri ve p-değerleri gör.
  5. Birden fazla tedavi grubu değerlendirilmesi için yararlı olan ilave morfometrik analizler
    1. Temel bileşen analizi dönüşüm ızgara oluşturun. PC Şekil sekmesi her örnek grubu içinde varyans için muhasebe şekil değişiklikleri vektör harita görüntüler değiştirir. Bir dönüşüm ızgara üzerine vektörleri düzgün görüntüyü yönlendirmek ve bindirmek için arsa alanında açılan menüsünü kullanın. Ölçek faktörüKontrol grubunun tahmini merkezine karşılık gelir PC puanları Grafiğin x-ekseni üzerinde bir değere yükseltilmektedir. Bir .bmp dosyası olarak görüntü ihracat.
    2. Bir SVO dağılım grafiğini oluşturun. Ana araç çubuğundaki Karşılaştırma sekmesi altında, Canonical Değişken Analiz seçin, ve daha önce (Bölüm 5.2.3 bakınız) ithal edildi sınıflandırıcı değişken seti vurgulayın. Permütasyon testleri için 1000 yineleme seçin ve Yürüt seçeneğini seçin. Iki değişkenli CVA dağılım grafiğini görüntülemek için CV puanları sekmesini seçin. Bu yüklenen sınıflandırıcılar dayalı renk kodlanmıştır. Arsa uzayda pop-up menüsünü getirerek renk düzenini değiştirmek (Bölüm 5.3.3 bakınız). Bir .bmp dosyası olarak ihracat.
    3. Bir SVO dönüşüm ızgara oluşturun. Ikiden fazla grup karşılaştırılırken CVA Sonuçların bir dönüşüm ızgara oluşturulabilir. Grafik sekmesinde, dönüm noktası koordinatları dönüşüm ızgara görselleştirmek için CV Şekli Değişiklikleri seçin. Değiştirmek için arsa uzayda yukarı pop- menüsünü getirmekvektörün yönü, bir dönüşüm ızgara üzerine sonuçlarını üst üste ve kılavuz çizgileri sayısını belirtin. Bir .bmp dosyası olarak grafik ihracat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, orofasyal boyut ve şekilde olan bir miktarsal analizi, tedavi edilmeyen kontroller için retinoik asit reseptörü inhibitörü (RAR inhibitörü) ile işlemden geçirildi embriyolar karşılaştırma gösterilmiştir. Embriyolar, 30 (26-35 HPF) için aşamasında 24 bu kimyasal inhibitörünün 1 uM konsantrasyon ile muamele yıkanmış ve aşama 42 (82 HPF) sabitlenmiştir. Daha sonra işlenmiş ve protokolde tarif edildiği gibi analiz edildi. Sonuçlar, orijinal veri, ancak önceki yayınlarda 2,3 gözlemleri ile tutarlıdır. Kontrol embriyoları araç, DMSO ile muamele edilmiş ve (Şekil 7ai ii) normal olarak geliştirilmiştir. (Şekil 7Aiii, iv) ile daha fazla üçgen şekilli ve RAR inhibitörünün 1 uM konsantrasyon ile muamele Embriyolar yüz, göz anomalilerinin küçük bir daralma gösterdi ve bu açma bozuk bir embriyonik ağzı.

İlk olarak, geleneksel bir hastanın ağız boyutları ölçülmüştür ve Şekil 7B 'de özetlenmiştir. S tatistical önemi her ölçüm için inhibitör tedavi embriyo ve kontroller arasındaki eşitsiz varyans varsayılarak bir Student t-testi ile belirlendi. Biz burun uzunluğu ve yüz genişliği her iki grupta anlamlı derecede RAR inhibitör tedavi embriyolarda azaldığı bulundu (sırasıyla p değerleri = 0.0062 ve 0.0058; Şekil 7Bi, ii). Yüz yüksekliği ve ağız yuvarlaklık anlamlı artarken (p-değerleri = x 10 -6 3,7772, 1,4812 x 10 -7), ağız genişliği önemli ölçüde azalmıştır (p-değeri = 2,5175 x 10 -10; Şekil 7Biii-v) .The (Şekil 7Bvi p değeri = 0,3754) sonuçları iki grup arasında genel orofasial alanda önemli bir farklılık göstermedi. Bu veriler embriyonik ağız açıklığının bir kısa burnu kalkınma sonuçlarında belirli bir zamanda retinoik asit sinyal kaybı, orta yüz bölgesi hafif daralma ve malformasyon göstermektedir.

nt "> azaltılmış retinoik asit sinyallere yanıt olarak embriyonik oral bölgede şekil değişiklikleri sofistike bir görünüm sağlamak için, biz sonraki geometrik morfometrik. belirlenmesi ve morfometrik analiz yazılımı kullanılarak orofasial işaretlerini hizalayarak, biz sonra her içindeki değişimini incelendiğinde analizleri kullanılmıştır İlk iki temel bileşenlerin birbirleri, RAR inhibitör tedavi embriyoların karşı çizilen edildiğinde temel bileşen analizi (PCA) aracılığıyla grup. PY1 ekseni (Şekil 7C) boyunca kontrollerden açıkça ayırt edildi. Bu test aynı zamanda örnek düşümünden değerlendirmeye alınması gösterdi grubundan (Şekil 7C, oklar) geri kalanı ile küme olmayan iki inhibitörü uygulanmış embriyolarda açıklanacaktır.

Sonraki, RAR inhibitör tedavi embriyo ve kontroller arasında oral bölgede şeklinde istatistiksel fark değerlendirildi ve ayırt edici bir fonksiyon analizi (DFA) yapılarak görüntülendi. Procrust mesafesi, between iki grup arasında farklı değildi (mesafe = 0,2665, p-değeri <0.0001, Şekil 7D), retinoik asit sinyal bozulur orofasial şekli bir değişiklik göstermektedir. Gerçekten de, hastanın ağız bölgesinde yanal yerlerinden pozisyonda önemli değişimlerin inhibitör muamele edilmiş embriyolar (Şekil 7D) 'de yüksekliğine karşılık gelen yüz şekli bir daralma gösterir. Buna ek olarak, nazal noktalarına (Şekil 7D, oklar) konumunda hafif dışarıya doğru burun azalmış büyümesinin ile tutarlıdır Bu embriyolar burun deliği pozisyonda anormallik ortaya koymaktadır. Bu açma üçgen şekilli bir ağız formasyonunu yansıttığı ağız açıklığı göstermek konumu değişir kenarlarını oluşturan işaretlerindeki değişimler önceki çalışmalarda 2,3 bildirilen medyan yarık ile tutarlıdır. Vektör değişikliklere ek olarak, dönüşüm ızgara desenli örgü Ayrıca şekil değişikliklerini göstermektedir ya daofacial bölgesi. Orta yüz bölgesinde Çözgü azalma retinoik asit sinyalleri (Şekil 7D) embriyo görülen orta yüzde hipoplazi ve genel olarak yüz daralma ile tutarlıdır.

Diskriminant fonksiyon analizi sonuçları (DFA) yeterince yalnız geleneksel ölçülerinin tarafından yakalanan değildir bazı değişiklikler ortaya şekli bizim nitel analizler ile uyumlu idi değişiklikleri yanı sıra gösterir. Orofasial alan kontrol grubu arasında anlamlı farklılık yoktu ve embriyolar (Şekil 7Bvi) tedavi inhibitörü iken Örneğin, DFA dönüşüm ızgara inhibitör tedavi embriyoların (Şekil 7A, D) görülen yüz daralması ile tutarlı bu bölgede dramatik değişiklikler saptandı. Ayrıca, biz ağız yuvarlaklık gördüğümüz önemli bir değişiklik ile birleştiğinde ağız açıklığının çözgü desen ve dönüm noktası vardiya, inhibitör tedavi Embry şekil açılış ağız malformasyon göstermektediros. Retinoik asit sinyalleri disrupsiyon Özet olarak, yüz boyutları ve geometrik morfometrik analizi geleneksel ölçümlerinin bir birleşimi şeklinde ve oral bölgede boyutundaki değişiklikleri göstermektedir.

Şekil 1,
1. Gerekli malzemeler Şekil. Veri analizi için (A) Araçlar. (I) 24 oyuklu plaka, (ii), standart tek transfer pipeti, (iii) Dumont 5. Inox forseps, (iv) bir kil kaplı Petri kabı, (h) düz alay iğne, (vi) bir cam pipet aracı, (vii ) steril, tek neşter. kil kaplı tabak (B) hazırlanışı. (I) bir doğrudan takılma iğne kil yatay çizgi çizmek için kullanılır. (Ii) bir cam pipet aracı, her bir yay sırası boyunca dairesel girintiler yapmak için kullanılır. (Iii) yemek görüntüleme için PBT ile doldurulur.

sayfa = "always"> Şekil 2,
Xenopus yumurta vitro fertilizasyon ve kültürde Şekil 2.. HCG enjeksiyonundan (a) yetişkin Xenopus dişiler yumurtalarını için indüklenir laevis. (B), yumurta, standart yöntemler kullanılarak, yüksek tuz MBS toplanan bir erkeğe ekstre testis ile gübrelenmiş ve kültürlenir. (C), embriyolar, bir transfer edilir bir standart tek transfer pipeti kullanarak 0.1 x MBS ihtiva eden 24 oyuklu bir çanak. (D) kalibre edilmiş bir pipet kişilik bir boş kuyuya 1 mi ölçmek için kullanılan ve bir belirteci olan tüm oyuklara dış tarafı üzerinde bu seviyede ayırmak için kullanılır içeren embriyolar (ek). 0.1x MBS sonra eklenir veya bu işareti seviyede olacak şekilde elinden alınır.

highres.jpg "width =" 500 "/>
Görüntüleme için embriyo kafaları 3. hazırlanması Şekil. Kafaları, düz siyah çizgileri kaldırmak için gereken iki insizyon (A) Diyagram. Ölçek bar = 400 mikron. (B) ilk kesi neşter gelen kuyruk ve bırakma basıncı kaldırmak için bağırsak arka sonunda yapılır. Ölçü bar = 400 um. (C) ikinci bir kesik tamamen baş ayırmak için, kalbe yakın bağırsak, anterior ucunda yapılır. Ölçek bar = 400 mikron. (D) kil yerleştirilmiş embriyo başkanları satır önden manzarası. Ölçek bar = 650 mikron. (E) kil embriyo başkanları pozisyon satır Yanal manzarası. Ölçek bar = 500 mikron cg: çimento bezi.

Şekil 4,
Orofasial boyutları 4. Geleneksel boyutu ölçümleri Şekil. (A), Yüz genişliği. Oklar göz ventral kısmı yüzün çevresi uygun noktalarını belirtir. Kırmızı çizgi bu noktalar arasındaki mesafe olarak ölçülen yüz genişliği vardır. Ölçek bar = 210 iM. (B) Yüz yüksekliği. Beyaz çizgiler gözlerin dorsal kenarında ve çimento bezin dorsal kenarında ölçümden önce çizilmiş kılavuzları bulunmaktadır. Kırmızı çizgi yüz orta hatta bu iki kılavuz arasındaki mesafe olarak ölçülen yüz yüksekliği vardır. Ölçek bar = 210 iM. (C) Orofasial alanı. Beyaz çizgiler ölçümden önce çizilmiş kılavuzları bulunmaktadır. Alt kılavuz sol göz ventral kenarına buluştuğu (a) yöneltin. Kırmızı çizgi, sol göz çevresinde izlemeyi gösterir. Gözün dorsal kenar üst kılavuzunu buluştuğu (b) yöneltin. Mavi çizgi gözlerin dorsal kenarında üst kılavuz boyunca takip orofasial alan dorsal sınırını gösterir. Üst kılavuz sağ yüz çevresini karşılar (c) Nokta. Yeşil çizgi gösterileriGöz çevresine doğru izleme. Sağ gözün ventral kenar alt kılavuzunu karşılar (d) Nokta. Sarı çizgi çimento bezinin dorsal kenarında alt kılavuz boyunca takip orofasial alan ventral sınırı gösterir. Ölçü bar = 210 uM. (D) Vücut boyu. Beyaz hattı gözün ön kenarı ve ölçümden önce bir kılavuz şeklinde çizilir. Kırmızı çizgi çimento bezi dorsal kenar yüzün yanal çevresini birleştiği noktada bu çizgisine göre ölçüldüğünde, burun uzunluğu vardır. Ölçek bar = 300 iM. (E) Ağız genişliği. Oklar noktaları nerede dorsal ve ventral dudaklar buluşuyor. Kırmızı çizgi, bu iki nokta arasındaki mesafe olarak ölçülen ağız genişliği vardır. Ölçek bar = 200 iM. (F) Ağız yuvarlaklık. Ağız açıklığı çevre takip ve kırmızı gösterilir. cg: çimento bezi. Ölçek bar = 200 mcM.

"Şekil Şekil 5. geometrik morfometrik analiz için işaretlerini ve preliminaries yakalama. (A) işaretlerini ve yakalama koordinatlarını yerleştirmek için fotoğraf düzenleme yazılımı ve bir elektronik tablo programı kullanarak. (I) Çok Renkli haçlar orofasial bölgenin şeklini temsil ImageJ Ekle puan aracını kullanarak resmin üzerine yerleştirilen yerler vardır. (Ii) Landmark veri Sonuçları Göster Aracı'nı kullanarak görüntülenir. (Iii) Landmark veriler kopyalanacak ve bir elektronik yapıştırılır. İkinci sütunda yukarıda yerlerinden sayısını belirleme ve "LM = 24" (kırmızı kutu) tarafından gösterilen bir başlığıdır. Verilerin ikinci sütununda Aşağıda, örnek bir benzersiz bir ad verilir ve "ID = CON1" (kırmızı ok) ile gösterilir. Bu bir örnek kümesindeki tüm görüntüler için tekrarlanır ve veri bir metin dosyası olarak kaydedilir. Geometrik morfometrik ğ i (B) Ön veri analiziprogram vardır. (I) fotoğraf düzenleme yazılımlarının oluşturulan metin dosyası, bir TPS dosyası olarak, morfometrik programa, MorphoJ alınır. Dosya kırmızı ok ile gösterilir. (Ii) Landmark koordinat verileri temel eksenleri Procrust oturması ile hizalanır. Kırmızı ok uyum yürütülmesini gösterir. (Iii) Procrust uygun yerlerinden bir kovaryans matrisi Ön Elemeleri menüsünde oluşturulur. (Iv) Bir sınıflandırıcı dosya bir elektronik oluşturulur. Sütun A ve B, sırasıyla başlıkları "İD" ve "tedavi", verilir. Her bir numune ait kimliklerinin dönüm veri toplama her bir örnek için vardır verilen A sütununda altında girdi, ve tedavi grubu B sütununda (v) sınıflandırıcı dosya sınıflandırıcı değişken seti olarak morfometrik programına aktarılır ve Sıralar olduğu girilir Tanımlayıcı tarafından seçilen veri seti için. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızBu rakam.

Şekil 6,
Morfometrik yazılım 6. İstatistiksel analiz Şekil. (A) Temel Bileşen Analizi (PCA) (i) PCA Çeşitleme sekmesinden seçilir. (Ii) Procrust yerlerinden ilk iki temel bileşenleri bilgisayar puanları sekmesinde bir ScatterPlot olarak görüntülenir. (Iii) bir pop-up menü arsa alana kadar getirdi. Bu menü birbirlerine (kırmızı ok) karşı grafiğe temel hangi bileşenleri değiştirmek için ve (mavi vurgulanan) veri noktalarını renklendirmek için kullanılır. (Iv) veri noktaları açılır menüden sınıflandırıcı değişkenlere göre renklidir. Her ana bileşeni tarafından yakalanan varyans (v) Yüzde Sonuçlar sekmesinde görülüyor. (B) Diskriminant Fonksiyon Analizi (DFA) (i) DFA Karşılaştırma sekmesinden seçilir. (ii) Procrust veri seti DFA için seçilen koordinatları ve önceden yüklenen sınıflayıcıları gruplandırmak için tercih edilmektedir. Karşılaştırılacak olan grupları seçilir ve permütasyon testler çalıştırılır. (Iii) DFA sonuçları Şekil Fark sekmesinde bir vektör haritası olarak gösterilir. Arsa uzayda bir pop-up menü doğru görüntüyü yönlendirmek için kullanılabilir. (Iv) açılır menüsünden Set Ölçek Faktörü sekmesini seçerek, ölçek faktörünün işareti değiştirilebilir. (V) vektörü haritası vektör haritanın açılır menüsünde Graph Tipini Değiştirmek seçerek çizgilerin istenilen sayıda bir dönüşüm ızgara değiştirilir. (Vi) Mahalonobis ve Procrust mesafeleri ve ilgili p-değerleri Sonuçları sekmesi altında incelendi. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kontrol ve RAR Şekil 7. Orofasial analizi embriyolar tedavi önledi. (A), (I, II) kontrol Örnek görüntüler. Ölçek çubukları 270 mikron =. (III, IV) Embriyolar ve RAR inhibitörü, BMS-453, 1 uM konsantrasyonu ile muamele edilmiştir. Ölçek çubukları 260 mikron =. (I, iii) görüşlerini Frontal. Ağız açıklığı kırmızı noktalar özetlenmiştir. (Ii, iv) Yan bakıldı. cg:. çimento bezi (B) kontrol Geleneksel orofasial boyutları (siyah) ve (mavi) embriyolar tedavi inhibitörü. Mm mm, (ii) yüz genişliği (i) Vücut boyu, (iii) yüz yükseklik, mm (iv) ağız genişliği, mm olarak (h) ağız yuvarlaklığı denklem kullanılarak ImageJ belirlenen bir birimsiz sayısı: (4 × [Alan]) / (π × Mm [ana ekseni] 2). (Vi) Orofasial alanı, (C) Temel Bileşen Analizi. Kontroller siyah ve RAR inhibitör tedavi embriyolarda olan mavi vardır. Siyah oklar outliers gösterir. PC1 = 73,63,% PC2 = 9.56%. (D) dönüşüm ızgara ek olarak Procrust mesafe ve p-değeri gösteren ayırıcı fonksiyon analizi. Vektör Kapalı daire bitiş RAR inhibitör tedavi embriyolarda dönüm noktası konumudur. Vektörün hattının ucu kontrollerde dönüm pozisyondur. Siyah oklar burun işaretlerinde kayma göstermektedir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis gelişimsel altında yatan mekanizmaları orofasial gelişimini diseksiyon için yararlı bir araç haline gelmiştir; Ancak, kurbağa bu bölgenin büyüklüğü ve şekli değişiklikleri açıklayan hiçbir protokoller vardır şu anda. Burada anlatılan yöntemi Xenopus'ta ve diğer omurgalıların orofasial fenotip daha titiz ölçümü için izin vererek orofasial kalkınma alanında önemli bir katkı sağlayacaktır.

Uygun şekilde bu protokolü yürütme ilk ve en önemli yönü, hem kesin ve tekrar üretilebilir bir dönüm noktası yerleştirme yüz boyutları ölçmek ve tespit etmek için yeteneğidir. Bu amaçla, embriyonik yüzler, aynı açı, yön ve büyütme fotoğraflandı olması çok önemlidir. Yanal embriyolar işlemek ve tutarlı bir yerleşim elde etmek zor olduğu gibi, özellikle bakım, burun uzunluğu hassas ölçümler elde etmek için alınmalıdır. Tek bir kişi s tüm ölçümler yapmak sahipSonuçların tekrarlanmasını maksimize ederken ame, günün Bu tür hata en aza indirir. Iyi sonuçlar sağlanması ikinci en kritik yönü bu tür gelişimsel farklılıkların veya genetik arka plan olarak gereksiz değişkenlik, azaltılmasıdır. Ince kusurları arasında istatistiksel olarak anlamlı ölçerken önemlidir. Embriyolar, bu yüzden, muamele edilmiş ve fotoğraflandı sırasında aynı seviyede olması gerekir. Ayrıca bakım gelişim oranları ile tedavi grupları arasında eşit olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Değişkenlikle bu gibi sorunları azaltmak için, her embriyolar aynı ebeveynlerden ve deney başında eşleşen aşamada olduğundan emin olun. Ayrıca (kalabalığı engellemek, örneğin) gibi kültür yemekleri farklı tampon kaynakları ve hacimleri, embriyoların farklı sayı ve dağılımları gibi değişkenlik dış kaynaklarını azaltmak.

Geometrik morfometrik yoluyla şekil değişiklikleri değerlendirilmesinde önemli bir adım Alignmen olduğunuişaretinin t Procrust uyum aracılığıyla koordine eder. Bu matematiksel bir algoritmanın, bir uygulama ile, boyut veya görüntünün dönme farklar konusunda herhangi bir bilgi çıkarılır. Dönüm yapılabilir gibi ana bileşenin veya diskriminant fonksiyon analyses- gibi istatistiksel TEKNİĞİ çok değişkenli hangi veri kümesindeki tüm embriyolar arasında yer koordinatları sonradan oluşturulan kovaryans matrisi unstandardized korelasyonu belirler.

Temel bileşenler analizi (PCA) temel bileşenler 26 olarak adlandırılan değişkenler küçük bir set karmaşık bir örnek azaltır. Birinci bileşen kalanı için hesap, her takip eden bileşen, numune kümesi içinde en fazla değişime oluşturmaktadır. Birbirleri ile morfometrik yazılımlara karşı ilk iki bileşeni, birlikte küme en benzer örnekleri komplo ile. Aynı zamanda bunların içindeki değişikliklerin belirlenmesi sırasında bu şekilde, ana bileşen, bir dizi örnek içindeki grupları ayırt etmektedir. Some olgu, grupları birbirinden açıkça ayırt edilebilen ve ya da her iki eksen boyunca üst üste olmayabilir. Bu durumda, grupların ayrımcılığa tarafından hangi ince özelliklerini ortaya çıkarmak amacıyla (örneğin, PC3 için) diğer bileşenleri çizmek avantajlıdır. Toplam varyans daha eşit ilk birkaç değişkenler arasında dağıtılır Bu özellikle ilgilidir.

Procrust uygun verilerin diskriminant fonksiyon analizi (DFA), bir veri kümesindeki örnekler etkili onları tanımlamak Sürekli değişkenler tarafından gruplara ayrımcılık olup olmadığını belirler. Bu nedenle numuneler analiz öncesi grupta sınıflandırılır, ve değişkenler gruplar 27 arasındaki istatistiksel ilişkiyi belirlemek için diskriminant fonksiyonları adı verilen bileşenlerden çevrilmiştir. Bu analizi çalıştırmadan önce, bu permütasyon testlerinin sayısını belirtmek için önemlidir. Bu permütasyon testlerinin dağıtımı konusunda herhangi bir varsayımlar giderilmesini öyle ki verileri rastgeleted. Daha permütasyon testi tekrarlamalar p-değerinin doğruluğunu artırmak. Bir dönüşüm ızgara olarak görünür olduğunda, grup arasında merkezi nokta konumunda önemli değişiklikler görüntülenir kıyaslanmaktadır. Şekil değişiklikleri meydana nerede Dahası, ızgara çözgü desen ortaya koymaktadır. Bu analizin dezavantajı sadece iki grubun karşılaştırılmasında kullanılacak olmasıdır. Karşılaştırma için bir örnek sette üç veya daha fazla gruplar varsa, bu kanonik değişken analizi yapmak daha iyidir. Bu, bir istatistiksel p değeri oluşturur ki bir DFA'ya benzer; Bununla birlikte, bu kümedeki gruplar arasında meydana gelen ek olarak açıklanan bütün numune üzerinde meydana gelen değişiklikleri gösterir.

Bu orofasial ölçüm protokolün önemli kısıtlılığı, sadece iki-boyutlu veri uygulanabilir olmasıdır. Bizim gelecek hedefleri üç-boyutlu veri analizi için benzer yöntemler geliştirmek CT tarama veya konfokal mikroskopi kullanılarak içerir. Diğer taraftan,iki boyutlu görüntüleri ile çalışan da bu protokolün önemli güçlerinden biridir. Kameralar ile donatılmış, sadece temel stereoskop embriyonik yüz görüntüleri yakalamak için ihtiyaç vardır. Maliyetlerini düşürürken veri analizi için kullanılan Openware de bu yöntemin erişilebilirliğini artırır. Bundan başka, sofistçe görüntüleme, istatistik analizler veya bilgisayar programlama ileri bir bilgi veri anlamlı ve önemli sonuçlar elde etmek için gerekli değildir. Aslında bu yöntem halen biyoloji VCU bölümünde bir lisans laboratuvar dersinin bir parçası olarak öğretilir ediliyor. Dolayısıyla, burada sunulan orofasial miktar protokol öğrenmek ve kısa bir süre içinde uygulamak kolaydır. Bir video gösterimi olarak, bu tür yazılımları embriyoların yerleştirilmesi ve navigasyon gibi kritik adımlar başarıyla bile eğitimsiz öğrencileri ve araştırmacılar tarafından kullanılabilir protokolü sağlamak için vurgulanır. Özetle, bu protokol değerli bir kaynak sağlayacaktıraraştırma toplum için ve bir öğretim aracı olarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

VCU A. Dickinson start-up paraları bu çalışmaları destekledi.

Yazarlar şematik Çizdikten onun sanatsal yetenek için Dan Nacu kabul etmek istiyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics