大规模的斑马鱼胚胎的心脏解剖的转录分析

1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover
* These authors contributed equally
Published 1/12/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

到斑马鱼心脏发育过程中分析的心脏基因表达分布,总RNA已被提取从离体心脏。在这里,我们提出了一个协议,用于收集功能/跳动的心迅速人工清扫,从斑马鱼胚胎获得心脏特异性mRNA。

Cite this Article

Copy Citation

Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

斑马鱼胚胎的心脏是由只有几百细胞,占整个胚胎中只有一小部分。因此,为了防止被掩蔽由全局胚胎转录心脏转录,有必要收集足够数量的心作进一步的分析。此外,如斑马鱼心脏发育迅速进行,心脏收集和RNA提取方法需要快,以保证样品的均匀性。在这里,我们提出了一个快速的手动清扫协议收集功能/跳动的心,从斑马鱼胚胎。这是为随后的心脏特异性RNA提取,以确定心肌特异性基因表达水平通过转录组分析,例如定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR的)的必要先决条件。该方法是基于在斑马鱼胚胎心脏和其他组织相比的差的粘合性能;这允许迅速的phy从心外心脏组织由流体剪切力的破坏,逐步过滤和人工采集转基因荧光标记心中的组合SICAL分离。

Introduction

斑马鱼( 斑马鱼 )被广泛用于发育生物学研究器官体内 ,由于其快速的,透明的和宫外胚胎发育,结合小尺寸和转基因记者线荧光蛋白的组织特异性表达的可用性。这个小脊椎动物特别适于研究心脏发育,因为早期的斑马鱼胚胎的氧合不依赖于心脏的跳动及血液流动;这些特点使大量心血管突变1,2的表征和斑马鱼现在是一个被广泛认可的模式生物来研究心脏疾病3。

到胚胎发育过程中研究基因表达,转录通常通过整个安装原位杂交(WISH)4分析,RT-qPCR的5,微阵列6,或下一代测序(RNA测序)7。而WISH允许基因表达的整个胚胎内的空间 - 时间分析,转录水平通过RT-qPCR的,微阵列或RNA测序方法,通常进行评估。然而,这些方法需要组织富集为特定的基因表达图谱。

因为斑马鱼胚胎心脏表示整个胚胎的一小部分,心脏发育过程中转录研究需要一个协议,用于解剖和心脏的富集。此外,为了得到生理上相关的数据,以维持心脏组织完全功能,直到RNA提取它是很重要的。在这里,我们描述了一种协议,用于快速分离生理正常和跳动心脏从数百斑马鱼胚胎的有效地获得高品质的RNA样品用于进一步分析。本方法是基于报道的烧伤和麦克雷,2006年8所述的协议,对于心脏组织的富集,这两种方法都使用的转基因心肌记者线并利用斑马鱼胚胎心脏与其他组织的鉴别粘附性能优势。简要地说,通过一个狭窄的枪头吹打许多胚胎上下,心脏被同时从胚体释放并随后从胚胎碎片两个快速过滤步骤中分离;荧光标记的心脏,然后手动地从剩余的碎片来分类并收集用于进一步处理。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

该协议遵循了德国和柏林国家法律的动物护理准则;斑马鱼的处理是由动物保护(LaGeSo,柏林 - 勃兰登堡)地方当局监控。

1.获取斑马鱼胚胎的心脏提取

  1. 横心脏记者斑马鱼,例如作为Tg(MYL7:EGFP)转基因twu34线9,以便获得胚胎心脏特异性GFP表达。
  2. 保持水蛋胚胎在28.5°C,直到所需的萌芽阶段10,11。确保所收集的胚胎人口是同质既遗传和发育阶段以限制的变化的基因表达。
  3. 手动Dechorionate胚胎。

2.解剖斑马鱼胚胎的心脏

注意:保留所有的解决方案上的冰。如果可能的话,做团队:一个人从教统局解剖的心ryos而另一个人在排序的荧光体视显微镜的心。这允许几百胚胎在几个小时的处理。

  1. 转约100胚胎成1.5ml的离心管中。麻醉用三卡因的胚胎(0.16毫克/毫升在E3的培养基)。一旦进入胚胎显然麻醉(他们不游泳和沉积物的试管底部,但他们的心还在跳动)。
  2. 除去三卡因/ E3溶液和1毫升的L-15/10%FBS培养基中,一旦洗涤胚胎并在冰上保持。
    注:L-15/10%FBS培养基中是很重要的,整个解剖过程中,以保持器官和细胞存活,直到心已被转移到RNAlater中或Trizol试剂。
  3. 加入1毫升的L-15/10%FBS培养基中的胚胎和移液器上下用圆形凝胶加载提示5-8次,直到蛋黄被完全破坏。吸取胚胎逐滴到溶液的表面上,从而使压降将会破裂和将胚轻轻破碎。
    注意:如何大力和频率胚胎必须吸取上下取决于胚胎的发育阶段, 多移液需要在后期( 例如在56 HPF)。
  4. 对于第一批解剖胚胎,评估胚的完整性并解剖心在立体显微镜下的比例,因为一些心中可保持附着在胚胎如果过轻轻吸入。调整移液的方式为下轮清扫相应。
    使用低滞留枪头和离心管,以减少心中坚持的塑料。
  5. 样品应用到100微米的过滤器放置在50毫升离心管中;冲洗1.5 ml管1毫升的L-15/10%FBS培养基中,然后将此到滤波器,以便最小化样品的损失(一些心可能被粘在管的壁)。 1毫升L洗两次过滤器-15 / 10%FBS中。在此步骤中心通过过滤器,并收集在50ml管中。
  6. 应用流通到30微米的过滤器放置在一个15毫升的离心管中,用1ml的L-15/10%FBS培养基冲洗过滤器一次。在这第二个过滤步骤中,心被保留在过滤器和较小的碎片被洗掉。
  7. 转动过滤器倒置并通过施加连续洗涤三次用1ml的L-15/10%FBS冲洗心中从过滤器的成在1%琼脂糖包被的培养皿。
  8. 手动分离GFP阳性的心从非荧光胚胎碎片( 眼镜头)与一对钳下,荧光体视显微镜,集中他们的菜心。根据步骤3收集它们。
    注:如果胚胎是年龄超过24 HPF,心中应跳动,表明组织仍然生理正常。

3.从Dissec分离mRNA特德心

  1. 收集在尽可能小的体积的心( 例如 10微升),并吸移管到1.5ml试管含有0.75毫升RNAlater中(在冰上)。确认没有心留在枪头通过查看它在荧光体视显微镜。
  2. 或者,如果一种化学罩是可以在荧光显微镜的附近,在化学罩所收集的心转移到的Trizol(警告)。这就避免心贴在了枪头,也是心灵的离心过程中可能的损失(步骤3.4,3.5和3.7)。汇集来自几轮孤立的心在同一个管的Trizol,并直接转到步骤3.8;最终的体积应不超过原始的Trizol体积的10%。
    注意:请阅读的Trizol材料安全数据表(MSDS)后再使用。处理Trizol试剂罩下,并建议穿戴个人防护装备。避免与皮肤,眼睛和clothi接触纳克。去除所有火源。
  3. 普尔从几轮隔离心中到相同的管中的RNAlater(在冰上),与组织的收集量的RNA分离的效率提高。如果总样品体积超过原始RNAlater中体积的10%,可以使用一个额外的管0.75毫升RNAlater中存储(在冰上)。
  4. 离心样品在15700 XG为20分钟,在4°C至沉淀的心。
  5. 下一个荧光立体显微镜,收集仔细尽可能多的上清液尽可能到装有3毫升的L-15/10%FBS的培养基中在1%琼脂糖包被的培养皿,但是不干扰沉淀的心在离心管的底部。由于心的高达15%的可保留在上清液由于RNAlater中的高粘度,如在步骤3.7中所述检索它们。
  6. 在化学罩,加0.5毫升的Trizol含有沉淀的心管和保持在冰上。
  7. 根据荧光microscoPE,传送从1%琼脂糖包被培养皿含有的RNAlater / L-15/10%FBS的溶液的心(来自步骤3.5)转换成另一种1%琼脂糖包被培养皿用3ml的L-15/10%FBS稀释出RNAlater中。收集的心在培养皿的中心,下化学罩在小体积转移成沉淀心中的Trizol的管。
  8. 涡1.5 ml管中含有的Trizol心中破坏心脏和孵化5分钟,在室温下。
  9. 在化学罩,加100微升氯仿(警告),调匀(使用前以最大速度离心30秒)的Trizol /氯仿溶液转移到1.5 ml的预纺PLG管。孵育3分钟,在室温下进行。
    注意:请阅读氯仿MSDS方可使用。处理氯仿试剂罩下,并建议穿戴个人防护装备。避免与皮肤,眼睛和衣服接触。远离不相容,如金属,碱。
  10. CentrifuGE将样品在15700×g离心15分钟,在4℃下,将水相转移到一个新的1.5毫升管。
  11. 添加5-10微克糖原和250μl的预冷(-20℃)异丙醇;拌匀,孵育过夜,在-20℃。
  12. 离心样品在15700×g离心30分钟,在4℃,弃去上清液。
  13. 在15700×g离心在4℃下洗用1ml 75%乙醇,离心沉淀15分钟,并弃去上清液。
  14. 让乙醇蒸发干燥的粒料在室温下,直到它变成白色( 例如 10-15分钟)。
  15. 添加20微升不含RNA酶的DDH 2 O的以沉淀孵育10-15分钟,在55℃以溶解的RNA然后保持在冰上。
  16. 评估RNA的浓度和纯度通过吸光度测定。通过运行在1%琼脂糖凝胶的样品评估RNA的完整性。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

在这里,我们描述了使用斑马鱼的Tg(MYL7:GFP)的有代表性的心脏解剖实验专在心肌(图1)的转基因twu34线9,它表达绿色荧光蛋白(GFP)。我们收集了两个解剖心,从他们得出评估心脏样品的纯度胚胎。简言之,将纯合的Tg(MYL7:GFP)twu34斑马鱼9进行异型杂交用野生型,使得所有的胚胎心脏的GFP标记。大约500胚胎(56 HPF)转移到1.5毫升管(约100胚在每个)(图1A1,1B)。如在协议部分(步骤2),并在图1A中描述的每个管中进行处理。心脏通过上下吹打数次(图1A2)释放,然后涂布在100微米的过滤器(图1A3)。大块的胚胎组织被保留在该过滤器;该馏分中检索到,并把在Trizol试剂FOřRNA提取获得的“无胚胎心脏”RNA样品(图1A3)。然后应用到30微米的过滤器(图1A4),它保留了类似规模的心和组织碎屑流过含心。 GFP阳性的心就冲出过滤器到琼脂糖涂层培养皿(图1A5,1C),迅速聚集在盘中间的下一个荧光体视显微镜和转入0.75毫升RNAlater中(图1A6)。在该管与RNAlater中,我们集中在5轮解剖来自心(约从500胚代表约60%的提取效率300心)。的心脏样品之前从胚胎碎片(图1C)的排序,在56 HPF与36 HPF的比较(图1C')示于图1.在56 HPF,胚胎的破坏,得到更多的胚胎的碎片(诸如透镜,慈菇,图1C)大于在36高倍视野以下的30微米过滤步骤(图1C')。

要确定56 HPF“心脏”样品的纯度,我们比较了心脏与在“心脏”和心外成绩单的表达水平“无胚胎心脏”的样品,通过RT-qPCR的。为了达到这个目的,我们提取的mRNA来自这两个样本并评估RNA的质量在琼脂糖凝胶上(图2A)和数量通过吸光度测定(表1)如在协议部分(步骤3)中所述。在约300心产生了660纳克RNA。接着,合成cDNA使用M-MLV逆转录酶RNA酶H( - )和随机六聚体按照生产厂家的说明书,和RT-qPCR的实验如所述12进行。计算了不同的组织特异性标志物,如肌球蛋白轻多肽7 [MYL7,心肌标志物] 9, 如[kdrl,内皮/心内膜标记] 13, 血红蛋白测试胚胎-1激酶插入域受体相关基因的表达水平1 [hbbe1.1,红细胞标记] 14, 晶状体-αA [cryaa,眼睛晶状体标记] 15号,和胶质纤维酸性蛋白[GFAP,中枢神经系统标记] 16(图2B)。斑马鱼真核生物翻译起始因子1B [eif1b] 12被用作内部参照基因(见表2为GenBank登记的ID号码,引物序列,PCR产物的大小和组织特异性针对每个基因)。正如预期的那样,MYL7被高度富集的“心脏”的样品相比,“无胚胎心脏”样品(图2B)。内皮细胞标志物kdrl被发现适度富集的心脏样品中,如预期的(约40%的心肌细胞在56 HPF都是kdrl -expressing内膜细胞)(图2B)。红细胞标记hbbe1.1被魏斯的“心脏”的样品,即使心中是ST生病打浆解剖后,它应驱逐红血球从心脏(图2B)。与此相反,在中枢神经系统和透镜标志物(GFAPcryaa,分别地)的表达水平极低的“心脏”样品(图2B)。总之,我们的结论是,从整个斑马鱼胚胎的心脏解剖协议产量高质量和心脏特异性RNA。

图1
图1.心脏提取的斑马鱼胚胎。(A)计划描绘了心脏提取过程。大约100个​​活的胚胎被收集在1.5ml管(A 1,B,B'),麻醉,然后通过窄枪头释放心中(A2)的移液管上下数次。然后,施加到一个100微米的过滤器(A3),含有胚胎组织(A2)中所得到的溶液中。没有蛋黄和h胚胎组织电子艺术,以及大胚胎碎片留在过滤器(A3)。通流被收集在50ml管(A3),然后涂布在30μm的过滤器(A4)。心和小碎片被保留在30微米的过滤器,并转移到一个小的琼脂糖包被的培养皿(A5,C,C')。 EGFP标记的心脏(C,C';箭头)是手动从剩余的碎片进行排序,诸如透镜(C,箭头),和被收集在RNAlater中(A6)。这个过程被重复至少5次,所有的心是汇集在一起​​,以便进一步处理。 (卑诗省)荧光叠加(EGFP绿色)和DIC活的转基因的Tg(MYL7:EGFP)的图像twu34胚胎在56 HPF(B,C)和36 HPF(B',C')两个步骤的心脏解剖过程:前胚胎解剖(B,B'),只是从30微米的过滤器冲洗,之前在培养皿(C,C分类的残骸后心中')。比例尺:500微米。

图2
图2.电泳和RT-qPCR的,分别RNA质量和纯度的分析。(A)总RNA从“心脏”样品(2微升),并从“无胚胎心脏”样品(1微升),从56来源HPF胚胎,解决在1%琼脂糖凝胶。突出S18和S28中的rRNA条带表示的RNA不降解。 (B)的组织特异性标记物MYL7(心肌),kdrl(内皮),hbbe1.1(红细胞),cryaa(透镜)和GFAP(CNS)中,通过RT-qPCR的为“心脏”样品所确定的相对表达水平归一化的“胚胎无心脏”样品 RT-qPCR的实验进行的一式三份的技术和数据被给出为平均值±SEM表示。进行不成对t检验分析。 **** P <0,0001; ** P <0.005。 BP,碱基对。

样品ID 纳克/微升 A260 A280 二百八十〇分之二百六十零二百三十〇分之二百六十零光标腹肌。 340生
32.97 0.82 0.41 2.01 0.35 2.355 0.031
胚胎心中无 568.82 14.22 7.00 2.03 2.04 6.965 0.018

通过分光光度测量表1 RNA的数量和质量。“没有心脏胚胎”,从56 HPF胚胎得到的样品的数量和“心脏”和RNA质量通过分光光度法测定。

通用电器NE GenBank中# 引物序列 PCR产物大小(bp)的组织特异性标记物
MYL7 BX248505 F:5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3' 163 心肌
R:5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3'
kdrl CR759732 F:5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3' 170 内皮/内膜
R:5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3'
GFAP BX324157 F:5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3' 247 中枢神经系统
R:5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3'
cryaa BX248514 190 眼球晶状体
R:5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3'
hbbe1.1 BC095024 F:5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3'8 102 红血球
R:5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3'8
eif1b BX323079 F:5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3'12 195 参照基因
R:5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3'12

表2引物用于RT-qPCR的实验 。名,GenBank登录号,序列,PCR产物的大小和组织特异性示于分析的所有基因。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

该协议允许斑马鱼胚胎心脏组织的快速富集的基因表达分析。心脏特异性RNA样品的数量和质量在很大程度上取决于几个关键步骤:第一,如果能够防止在该协议中的每一步的心损耗的样品的量有很大的提高,因为RNA纯化将仅具有足够的工作起始材料。第二,样品,这完全取决于实验者的纯度,通过分类和收集的心内的培养皿同时严格排除其它组织确定的。第三,样品的质量主要取决于限制可能发生在胚胎的破坏RNA的降解;这是通过使用细胞培养基,以避免细胞死亡,并通过保持样品在冰上实现。一旦心中已经转​​移到RNAlater中或的Trizol RNA降解停止。这心是跳动在培养皿有力地证明了心脏吨问题是解剖后生理正常。

我们建议开始用至少300心( 约500胚胎),从该足够的RNA可以安全地被沉淀(连同5-10微克糖原)。但是,我们不能排除不是更少的心就足够了小规模实验。它仅仅是重要的是有足够的RNA,以确定样品的浓度,纯度和完整性。请,请注意,RNA含量可根据不同的发育阶段以及对胚胎的( 例如,在具有异常心突变体的情况下)的遗传背景而变化。因此,需要一个实验胚胎的最小量就必须在每个单独的情况来判断。

有此协议,由伯恩斯和麦克雷较早的协议之间的一些技术上的差异,我们不认为有两个协议之间的效率和速度显著的差异。但是,我们已经介绍的改进:更重要的是,我们建议使用RNAlater中稳定的解决方案。这是两个重要的原因:第一,通过降低RNA降解到最低限度,为的RNAlater立即RNA酶失活,稳定的组织或细胞内RNA收集高质量的RNA进行进一步的实验,如RT-qPCR的。第二,RNAlater中是允许的心在不同的日子,在收集这是重要的,当胚胎的数目是一个限制因素是至关重要的。它也允许它可能是必要的,以获得起始材料的高品质的RNA用Trizol试剂有效分离足够量的心池。直接转印心中成的Trizol将绕过使用RNAlater中的,然而,由于对健康的危害,这一步将有下一个化学罩,它不能被认为是定位于荧光显微镜的所有实验者的直接附近要执行。

我们发现吨帽子的心脏解剖运作良好,与20-72 HPF [12之间的胚胎;未公布的数据,72 HPF。然而,在提取过程变得随着胚龄和长度更困难:更多和更有力的移液需要成功引进胚胎到长尖和分离从其他胚胎组织的心。其结果是,更胚胎碎片是样品制备中存在(参见图1C,C')和实验者具有更加小心在培养皿排序的心。

这里介绍的心脏解剖协议允许不同的细胞类型,包括心肌,心内膜的整个心脏表达谱的分析。 (:GFP MYL7)twu34TG(kdrl:心肌细胞类型的进一步分离可以通过使用endocardial-和心肌特异性-报告线路〔 例如 Tg为实现mCherry EM>)IS5] 9,17对心脏萃取结合FACS分拣。与此相反的翻译核糖体亲和纯化(TRAP)方法18,19,其允许组织特异性转录分析无组织解剖,我们的方法并不限定于主动翻译的mRNA,还包括未积极翻译的mRNA或非编码RNA。的心脏解剖协议的一种替代的应用是要分析的心内的蛋白表达:蛋白质水平可通过蛋白质印迹和蛋白质定位进行评估可以通过免疫组织化学进行分析,如心脏的解剖结构的解剖过程中被保留。

总之,我们在这里为从数百胚胎在很短的时间,这可被用于获得高纯度的心脏特异性RNA(或蛋白质)的样品进行进一步的分析解剖官能/跳动心脏的详细协议。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats