Выделение и Удаление мышиной аорты; Универсальный Техника в исследовании сердечно-сосудистых заболеваний

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Аорты играет ключевую роль в сердечно-сосудистой функции обеспечения тела кислородом крови и аналогичных других частей тела, является восприимчивым к болезни. Общие аорты заболевания включают в себя атеросклероз и аневризмы, которые являются результатами генетических и экологических факторов, включая питание, курение, малоподвижный образ жизни 1. Атеросклероз является осаждение кальцием и липидов на основе налета на стенке аорты, как правило, встречается у больных с хронической гиперлипидемии 2. Аневризмы характеризуются деградации структурных компонентов аорты и истончение стенки сосуда, с последующим увеличением диаметра, которые в конечном счете может привести к разрыву 3.

Животные модели являются важными инструментами, используемыми для изучения механизма заболевания и эффективности возможных методов лечения. Общие модели животного происхождения, используемые в исследование сердечно-сосудистой, в частности, исследования исследования сосудов и нарушения обмена веществвключают генетически модифицированных мышей с целью изменения уровней липидов, таких как генная аполипопротеина E нокаутом и плотность липопротеина ген рецепторов у мышей с низким 4. Большинство методов оценки механизмов заболевания и эффективности терапии будет включать в себя выделение и иссечение аорты.

После того, как аорта локализован и изолированы, морфометрический анализ может быть определена, например, наличием аневризмы, как правило, определяется как увеличение диаметра 5 больше, чем 50%. После необходимости в анализе месте завершена, аорта может быть вырезан для дальнейшего анализа. Иссеченную аорты может быть мгновенно замораживали для проведения молекулярных исследований, таких как белок и / или экспрессии генов анализов или устранить с помощью 4% параформальдегида, а затем встроен, срезы и окрашивали для гистологического анализа. Гистологический анализ аорты может продемонстрировать общие черты аорты заболеваний, таких как структурный деградации, образованию бляшек, и инфильтрацией лейкоцитов <SUP> 6,7. Кроме того, Иссеченную аорты может быть использован для изоляции клеточных линий, включая основные эндотелиальных и гладкомышечных клеток, которые впоследствии могут быть использованы для различных исследований в пробирке 7.

В настоящее время нет никаких других способов предоставления Это углубленное характеристику аортального а также обеспечить исследователей инструментами для дальнейшего изучения сердечно-сосудистых заболеваний. Визуализации формы, такие как магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии и УЗИ являются ближайшими методы морфологически оценить аорты, однако это трудно в небольших животных и получение устройства с адекватной технологии является дорогостоящим 8. Иммортализованные клеточные линии могут быть куплены, чтобы исследовать потенциальные механизмы заболевания и эффективности терапии, однако искусственная природа этих клеток, ограничивающих изучения влияния на жизнь клеточного цикла и апоптоза 9.

Общая цельЭта рукопись является демонстрация стерильную изоляции и удаление мышиного аорты в расследовании сердечно-сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных были проведены с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Цинциннати и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения (NIH Publication No. 85-23, Пересмотрен в 1996).

1. Подготовка мыши

  1. Эвтаназии, подвергая животное к supratherapeutic дозы анестетика, изофлуран вдыхании эффект. Проверьте первичный эвтаназию через носок щепотку как болевые раздражители. Дополнительный способ эвтаназии, резки диафрагмы, произойдет в следующем шаге. Альтернативные способы могут быть использованы предоставлено эвтаназии получают.
  2. Sanitizie внешняя поверхность мыши путем распыления мех вдоль брюшной области, где будут сделаны начальные разрезы, 70% этанолом до точки влаги, так что мех влажной этанолом и любые свободные / сухие волосы не вступают область.
  3. Положите мышь из на Сюрческие доска в положении лежа на спине с верхней и нижней конечностей продлен наружу.
  4. Безопасные придатки на плату с помощью хирургической лентой.

2. Выделение сердца и аорты

  1. После правильного позиционирования мыши, использовать пинцет, чтобы локализовать и изолировать кожи живота просто, ниже мечевидного отростка грудины.
  2. Создание напряжение, поднимая кожу вверх и использовать ножницы, чтобы удалить поверхностную оболочку, обнажая превосходную часть брюшины и нижней части грудной полости.
  3. Введите в брюшную полость, подняв процесс мечевидного и сделать боковые разрезы только нижестоящие по отношению к процессу вдоль подреберье полей.
  4. Проанализируйте вверх в грудную полость, проходит через диафрагму, будучи уверенным, чтобы не покалечить сердце или каких-либо крупных кровеносных сосудов.
  5. Продлить боковые разрезы, сделанные в шаге 2,3 краниально, чтобы удалить переднюю часть грудной клетки. Еслинеобходимости следует освободить сердце от передней грудной стенки с использованием тупым.
  6. Очистите груди полости постороннего крови и жидкости с помощью стерильную марлю, чтобы поглотить материал. После того, как площадь виднее, удалить легкие, чтобы лучше раскрыть сердце и аорту.

3. Кровоснабжение сердца и аорты

Примечание: Для получения крови с помощью пункции сердца, делать это непосредственно перед этим шагом.

  1. Заполните 10 см шприц с 10 мл стерильного охлажденного льдом 1x раствора фосфатного буфера (PBS), и прикрепить иглу 25 в шприц.
  2. Осторожно введите иглу в левый желудочек сердца.
  3. Разрежьте правое предсердие, чтобы облегчить повышение давления от перфузии. Заливать содержимое шприца в наведении мыши 2 - 3 мин.
  4. Использование стерильную марлю в отверстие в правом предсердии, чтобы поглотить перфузионной жидкости.

4. Выделение и Удаление аорты

  1. После завершения реrfusion использовать стерильную марлю, чтобы поглотить всю оставшуюся жидкость облачное поле зрения в грудной полости.
  2. Защиту желудочно-кишечные содержимое резанием каудально через брюшную стенку, расширяя разрез в надлобковой области. Продлить разрез дальше в сторону нижних конечностей на двусторонней основе, чтобы создать кожных лоскутов, которые могут быть скованы или удалить.
  3. Снимите долей печени, поджелудочной железы, желудка, селезенки и кишечника лучше визуализировать аорту. Будьте осторожны при вскрытии рядом с периренальных регионе, а аорта поверхностно на ветвях почечных артерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в точной и зачисляются образом, как желудочно-кишечного тракта богата бактериями, что увеличивает склонность к загрязнению.
  4. Промыть области с 1x PBS и удалить всю жидкость за счет поглощения с стерильную марлю.
  5. Использование стерильных microscissors и microforceps, отделить аорты от позвоночника спинной и пищевода вентрально.Лучше всего использовать тупым и использования рассечение микроскоп для этого.
    Примечание: В изолировать аорты, каудально начать в подвздошной бифуркации и перемещать краниально очистки и выделения аорты из дорсальной поверхности полости или начать краниально на сонных артерий и брахиоцефальных артерий рассекающих каудально. Любой метод подходит и к комфорту исследователей.
  6. Удалить периваскулярной жировой ткани с помощью тонких microscissors будучи уверенным, чтобы не удалить часть стенки аорты. Это очень важно, чтобы минимизировать возможность загрязнения фибробластов при культивировании аортальных гладкомышечных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После завершения процедуры, будет нетронутым аорты, исходящая из сердца, спускаясь в грудной и брюшной полостей с почечных артерий еще прилагается (1А). Отсюда, аорта могут быть отображены на месте, чтобы количественной оценки изменений, которые морфометрические диагностики при исследовании брюшной аорты (фиг.1В и 1C). Затем аорты может быть удален, фиксировали и окрашивали смотреть на гистологических изменений. И совместные пятно аорты гематоксилином и эозином пятна (фиг.2А и 2В). Кроме того, структурная целостность аорты может быть качественно количественно, используя окрашивание Verhoff ван Geison смотреть на эластина полос (рис 2С и 2D). Вместо получения гистологического анализа, следователь может мигать заморозить аорты для последующего белка и expre рибонуклеиновой кислотыделения. Последний вариант для исследователя является использование аорты, чтобы получить развязка между первичной ячейки. Эти клетки могут быть выращены в культуре (фиг.3А), и используется для различных исследований в пробирке в том числе жизнеспособности исследований (фиг.3В) и локализации белка (фиг 3C).

Рисунок 1
Рисунок 1. Натурные представительных изображений мышиного аорты. (А) изображен нормальной анатомии мыши после выделения аорты, включая сердце и почки. (Б) увеличенное изображение нормального мышиного интактного брюшной аорты. (С) увеличенное изображение больного брюшной аорты с аневризмой в надпочечников область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию гоэто фигура.

Фиг.2
Рисунок 2. Гистологический анализ мышиной аорты. () Представитель образ нормального гематоксилином и эозином пятно здорового надпочечников аорты на 20-кратным увеличением. (B) представитель образ аневризмы надпочечников аорты с очной тромба после гематоксилином и эозином пятно на 20Х увеличением. (C) представитель образ Verhoff ван Geison пятно, подчеркнув эластина полосы нормальной надпочечников аорты на 10-кратным увеличением. (D) Представитель образ пятна Verhoff ван Geison подсветкой эластина полосы в надпочечников аорты развивается болезнь отмечено истончение и размечает эластина групп и утолщение в адвентициальной слоя. Пожалуйста, CLIск здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Основные аорты миоциты культивировали из аорты. (А) представитель образ первичных аорты миоцитов в культуре в 20-кратным увеличением, полученной из брюшной аорты. (Б) представитель образ первичных аорты миоцитов во время трипанового синего анализа после 500 мкМ лечении H 2 O 2 в 20-кратным увеличением, полученного из брюшная аорта. (C) представитель образ иммуногистохимического окрашивания для альфа-актина в первичных изомированных аорты гладкомышечных клеток из брюшной аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы не имеют подтверждения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193, (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79, (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142, (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5, (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88, (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45, (1), 192-198 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics