Aislamiento y Escisión de murino Aorta; Una técnica versátil en el Estudio de la Enfermedad Cardiovascular

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

La aorta juega un papel fundamental en la función cardiovascular suministrar al cuerpo con sangre oxigenada y las porciones similares a los demás del cuerpo, es susceptible a la enfermedad. Enfermedades de la aorta comunes son la aterosclerosis y el aneurisma, que son el resultado de factores genéticos y ambientales como la dieta, el tabaquismo y el sedentarismo 1. La aterosclerosis es la deposición de calcio y una placa base de lípidos a la pared aórtica típicamente encontrado en pacientes con hiperlipidemia crónica 2. Los aneurismas se caracterizan por la degradación de los componentes estructurales de la aorta y el adelgazamiento de la pared del vaso, seguido por un aumento del diámetro lo que finalmente puede conducir a la ruptura 3.

Los modelos animales son herramientas importantes utilizadas para estudiar el mecanismo de la enfermedad y la eficacia de los tratamientos potenciales. Modelos animales más comunes utilizados en la investigación cardiovascular, investigar específicamente la investigación de los trastornos vasculares y metabólicasincluir ratones modificados genéticamente para alterar los niveles de lípidos, tales como golpe de gracia gen de la apolipoproteína E y lipoproteínas de densidad baja ratones knockout del gen del receptor 4. La mayoría de los métodos para evaluar los mecanismos de la enfermedad y la eficacia de la terapia incluiría el aislamiento y la escisión de la aorta.

Una vez que la aorta está localizado y aislado, el análisis morfométrico se puede determinar, como la presencia de un aneurisma, típicamente definido como un incremento mayor que 50% en el diámetro 5. Después necesario el análisis in situ es completa, la aorta se puede escindir para su posterior análisis. Una aorta extirpada puede ser congelado instantáneamente para llevar a cabo estudios moleculares, tales como proteínas y / o ensayos de expresión de genes o fijo utilizando 4% de paraformaldehído y posteriormente incrustado, se seccionaron y se tiñeron para el análisis histológico. El análisis histológico de la aorta puede mostrar las características comunes de la enfermedad aórtica, como la degradación estructural, la formación de placa, y la infiltración de leucocitos <sup> 6,7. Además, una aorta extirpada se puede utilizar para aislar líneas celulares primarias que incluyen células endoteliales y de músculo liso que posteriormente se pueden utilizar para una variedad de estudios in vitro 7.

Actualmente, no existen otros métodos para proporcionar esta caracterización en profundidad de la enfermedad de la aorta, así como brindar a los investigadores herramientas para estudiar más a fondo la enfermedad cardiovascular. Técnicas de imagen como la resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía son los métodos más cercanos para evaluar morfológicamente la aorta, sin embargo esto es difícil en pequeños animales y la obtención de un dispositivo con tecnología adecuada es caro 8. Las líneas celulares inmortalizadas se pueden comprar para investigar los mecanismos potenciales de la enfermedad y la eficacia de las terapias, sin embargo, la naturaleza artificial de estas células son limitantes en el estudio de los efectos sobre el ciclo de vida celular y la apoptosis 9.

El objetivo general deeste manuscrito es demostrar el aislamiento estéril y la escisión de la aorta murino en la investigación de la enfermedad cardiovascular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los animales procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Cincinnati y de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No. 85-23, Revisado 1996).

1. Preparación del ratón

  1. Practicar la eutanasia mediante la exposición del animal a una dosis de anestésico supraterapéutica, isoflurano inhalado al efecto. Verifique la eutanasia primario a través pizca de pie, como un estímulo nocivo. Método secundario de la eutanasia, de corte diafragma, tendrá lugar en una próxima etapa. Los métodos alternativos pueden ser utilizados se obtiene la eutanasia sentado.
  2. Sanitizie la superficie externa del ratón por pulverización de la piel a lo largo de la región abdominal, donde se harán los cortes iniciales, con etanol al 70% hasta el punto de humedad por lo que la piel está húmeda con etanol y los pelos sueltos / seco no entran la región.
  3. Coloque el ratón sobre un surtablero de lógica en la posición supina con apéndices superiores e inferiores se extendió hacia el exterior.
  4. Apéndices seguros a la junta con cinta quirúrgica.

2. Aislamiento del corazón y la aorta

  1. Después de la colocación apropiada del ratón, el uso de fórceps para localizar y aislar la piel abdominal justo por debajo de la apófisis xifoides del esternón.
  2. Crear tensión levantando la piel hacia arriba y utilizar las tijeras para quitar la piel superficial, dejando al descubierto la parte superior del peritoneo y la parte inferior de la cavidad torácica.
  3. Introduzca la cavidad peritoneal levantando el apéndice xifoides y la realización de incisiones laterales apenas inferiores al proceso a lo largo de los márgenes subcostal.
  4. Diseccionar hasta la cavidad torácica, pasando a través del diafragma, asegurándose de no lacerar el corazón o cualquier principales vasos sanguíneos.
  5. Extender las incisiones laterales hechas en el paso 2.3 cranealmente para eliminar la porción anterior de la caja torácica. Sinecesario, liberar el corazón de la pared anterior del tórax mediante disección roma.
  6. Limpie la cavidad torácica de la sangre ajena y líquido utilizando una gasa estéril para absorber el material. Una vez que el área es más visible, retire los pulmones para exponer mejor el corazón y la aorta.

3. La perfusión de corazón y la aorta

NOTA: Para obtener la sangre mediante punción cardíaca, hacerlo justo antes de este paso.

  1. Llenar una jeringa de 10 cc con 10 ml de hielo frío estéril 1x solución de tampón fosfato (PBS), y adjuntar una aguja de calibre 25 a la jeringa.
  2. Suavemente inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón.
  3. Cortar la aurícula derecha para aliviar la acumulación de la presión de perfusión. Perfundir el contenido de la jeringa en el ratón más de 2 - 3 minutos.
  4. Utilice una gasa estéril en la abertura en la aurícula derecha para absorber líquido de perfusión.

4. El aislamiento y la escisión de la aorta

  1. Al término de PErfusion, utilizar una gasa estéril para absorber cualquier líquido restante enturbiamiento del campo de visión dentro de la cavidad torácica.
  2. Exponer los contenidos gastrointestinales cortando caudalmente a través de la pared abdominal, la incisión se extiende a la zona suprapúbica. Extienda la incisión más hacia los miembros inferiores bilateralmente para crear colgajos de piel que pueden ser puestas abajo o extirpados.
  3. Retire los lóbulos del hígado, el páncreas, el estómago, el bazo y los intestinos para visualizar mejor la aorta. Tenga cuidado cuando la disección de cerca de la región perirrenal, como la aorta es superficial en las ramas de las arterias renales.
    NOTA: Realice este paso en un preciso y matricularse manera como el tracto gastrointestinal es rico en bacterias que aumenta la propensión a la contaminación.
  4. Enjuague el área con 1x PBS y retirar todo el fluido por absorción con una gasa estéril.
  5. El uso de micro tijeras estériles y microforceps, separar la aorta dorsal de la columna vertebral y el esófago ventralmente.Lo mejor es usar una disección roma y la utilización de un microscopio de disección para esto.
    NOTA: En el aislamiento de la aorta, iniciar caudalmente en la bifurcación ilíaca y mover cranealmente limpieza y separación de la aorta de la superficie dorsal de la cavidad o iniciar cranealmente en las carótidas y arterias braquiocefálica de disección caudalmente. Cualquier método es apropiado y es hasta la comodidad investigadores.
  6. Retire el tejido adiposo perivascular utilizando finas micro tijeras asegurándose de no eliminar una parte de la pared aórtica. Esto es esencial para minimizar el potencial de contaminación de fibroblastos cuando el cultivo de células del músculo liso aórtico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Al finalizar el procedimiento, habrá una aorta intacta procedente del corazón, descendiendo en las cavidades torácica y abdominal con las arterias renales todavía conectados (Figura 1A). Desde aquí, la aorta se pueden obtener imágenes in situ para cuantificar los cambios morfométricos que son de diagnóstico en el estudio de los aneurismas aórticos abdominales (Figura 1B y 1C). Posteriormente, la aorta se puede quitar, fijadas y teñidas para observar los cambios histológicos. Una mancha general y común de la aorta es la hematoxilina y eosina (Figura 2A y 2B). Además, la integridad estructural de la aorta se puede cuantificar cualitativamente mediante tinción Verhoff van Geison mirar las bandas elásticas (Figura 2C y 2D). En lugar de obtener un análisis histológico, el investigador puede parpadear congelar la aorta para su posterior proteínas y ácido ribonucleico expresión. La opción final para el investigador es utilizar la aorta para obtener el aislamiento de células primarias. Estas células se pueden cultivar en cultivo (Figura 3A) y se utilizan para una variedad de estudios in vitro, incluyendo estudios de viabilidad (Figura 3B) y localización de la proteína (Figura 3C).

Figura 1
La Figura 1. En imágenes representativas situ de aorta murino. (A) Representación de la anatomía normal de ratón después del aislamiento de la aorta incluyendo el corazón y los riñones. (B) imagen de una aorta abdominal murina normal intacta ampliada. (C) Imagen de un aórtico abdominal enferma ampliada con un aneurisma en la suprarrenal región. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.

Figura 2
Figura 2. El análisis histológico de aorta murino. (A) Imagen Representante de hematoxilina y eosina normal de una aorta suprarrenal sana de 20 aumentos. (B) Imagen Representante de una aorta suprarrenal aneurismática con trombo intramural después de hematoxilina y eosina de 20 aumentos. (C) Imagen de un Representante mancha Verhoff van Geison, destacando las bandas elásticas de una aorta suprarrenal normal a 10 aumentos. (D) imagen representativa de una mancha Verhoff van Geison destacando las bandas elásticas de una aorta desarrollar enfermedad suprarrenal señalado por el adelgazamiento y que perfila de bandas de elastina y engrosamiento de la capa adventicia. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. miocitos aórticas en cultivo primario de aorta. (A) imagen representativa de los miocitos aórticas primarias en cultivo a 20X de aumento obtenido de la aorta abdominal. (B) imagen representativa de los miocitos aórticas primarias durante un ensayo de exclusión con azul de tripano después de un tratamiento 500 M de H 2 O 2 de 20 aumentos obtenido a partir de la aorta abdominal. (C) imagen representativa de una mancha de inmunohistoquímica para la actina alfa en células aórticas aislado primario del músculo liso de la aorta abdominal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores no tienen reconocimientos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193, (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79, (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142, (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5, (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88, (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45, (1), 192-198 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics