Localisation, identification, et l'excision des dépôts adipeux murin

Medicine

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Summary

Grâce à la connexion drastique et négative entre l'obésité et d'autres comorbidités, la recherche sur le rôle adipeux joue dans la maladie et la santé globale est justifiée. Nous présentons un protocole pour l'isolement et l'excision de dépôts adipeux permettant l'étude du tissu adipeux à l'aide in situ et des procédés in vitro.

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

Adipeux fait une apparition remarquée sous les projecteurs des médias, due à l'augmentation spectaculaire de l'obésité au cours des dernières décennies du 20e siècle. L'obésité touche actuellement plus d'un tiers des adultes et 17% des enfants et des adolescents aux États-Unis (US) 1. Couvrant tous les groupes ethniques, les recherches statistiques entourant l'épidémie d'obésité a montré que les Noirs non hispaniques ont le plus haut taux ajusté selon l'âge de l'obésité (49,5%) par rapport aux Américains d'origine mexicaine (40,4%), les tous les Hispaniques (39,1%), et non hispaniques blancs (34,3%) 2. L'effet économique de l'obésité est aussi une préoccupation croissante pour le système de soins de santé. En 2012, il a été estimé que le coût annuel des soins médicaux de l'obésité aux États-Unis en 2005 était de $ 190,2 milliards, près de 21% du budget global de dépenses médicales. Malheureusement, l'obésité infantile a été estimée à responsable de 14 milliards de dollars en coûts médicaux directs seul. Statistiquement, on a déterminé que le coût médical moyen deles personnes souffrant d'obésité était $ 2741 plus d'un an que ceux sans cette morbidité 3-5.

L'obésité est un facteur de risque majeur pour une variété de conditions telles que: le diabète de type 2, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires, le cancer, les troubles musculo-squelettiques et l'inflammation chronique. L'obésité est profondément liée à la pathogenèse du syndrome métabolique et d'autres maladies chroniques 8.6. Avec de telles connexions drastiques et négatives entre l'obésité et d'autres comorbidités, la recherche scientifique a attiré l'attention de mieux comprendre l'épidémie actuelle et les divers rôles joués par les pivots et adipeux.

Historiquement, le tissu adipeux a été considéré comme négligeable et a été vu comme un simple tissu de remplissage simple. Actuellement, adipeux a été montré à jouer de nombreux rôles essentiels dans le fonctionnement de l'organisme dans: le métabolisme, la régulation hormonale, l'inflammation, la protection et l'isolation 9. Le tissu adipeux est principalement composée deadipocytes, mais contient aussi des pericytes, des cellules endotheliales, les monocytes, les macrophages et les cellules souches pluripotentes 8. Le tissu adipeux est distribué dans tout le corps dans des dépôts distincts. Les principaux dépôts peuvent être trouvés sous-cutanée, sous-cutanée, intramusculaire, et viscéralement 10. Dépôts adipeux ont été montré pour avoir des profils métaboliques spécifiques de dépôt, qui ont montré une susceptibilité particulière de dépôt à l'obésité et les troubles liés huit.

Traditionnellement, le tissu adipeux a été classé en deux grandes catégories: tissu blanc adipeux (WAT) et de tissus adipeux brun (BAT); Bien que la littérature récente indique les présences d'un troisième groupe baptisé adipeux brite ou beige 11. Le tissu adipeux a été démontré qu'ils ont des couleurs différentes, des morphologies, des fonctions métaboliques, biochimiques caractéristiques génétiques et des motifs d'expression 10. Adipocytes en WAT ont un seul, de grosses gouttelettes de lipides et des quantités variables de mitochondries. WATest dominante trouvée dans les localités sous-cutanées et viscérales du corps. WAT fonctions essentiellement comme un site de stockage d'énergie et la protection des organes. Adipocytes dans BAT ont une morphologie multiloculaire et de nombreuses mitochondries. BAT se trouve principalement dans le cou et les gros vaisseaux sanguins du thorax, ainsi que les omoplates 12. MTD fonctions principalement dans les comportements dépenser d'énergie qui régulent la thermogenèse 7. Adipeux Brite ou beige a été montré pour partager une morphologie analogue et d'expression aux MTD, mais a été trouvé à l'origine de 11 adipocytes blancs.

La méthode chirurgicale décrite dans ce manuscrit offre aux chercheurs la capacité d'analyser des effets différents que des facteurs tels que: l'environnement, les produits pharmaceutiques, et de la génétique, ont sur adipeux; ainsi que le rôle bénéfique ou néfaste adipeux joue dans la maladie et la santé globale. En outre, en fournissant un moyen pour identifier et isoler les différents types de tissu adipeux àpermettre de mieux comprendre les relations et les différences biochimiques entre les dépôts. Cela peut aider à déterminer la relation entre la localisation, la fonction et le type de graisse dans le corps. Ce procédé décrit parvient en fournissant les moyens de visualisation brut, l'analyse de l'expression des gènes, l'analyse d'expression de protéine, l'examen histologique, et l'isolement de lignées de cellules primaires pour les études in vitro. Actuellement, il ya beaucoup d'articles qui fournissent des informations sur le comportement métabolique des différents dépôts adipeux, ainsi que leurs emplacements anatomiques; mais ne fournit pas une méthode sur la façon de localiser précisément, identifier et isoler ces dépôts en profondeur. Cette méthode fournit une technique chirurgicale précise qui permet l'isolement de plusieurs dépôts avec une quantité minimale de dissection et la contamination par rapport aux autres méthodes destinées à l'isolat d'un ou de deux dépôts de 13 à 14.

L'objectif de ce protocole est de fournirun procédé précis pour l'identification et l'isolement de différents types de dépôts de graisse à partir de plusieurs emplacements anatomiques.

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Protocol

NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées avec l'approbation de la Commission institutionnelle de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Cincinnati et en conformité avec le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH Publication Aucun . 85-23, révisée en 1996).

1. Euthanasier et stériliser la souris

  1. Placez la souris dans une sélection contenant une dose supratheraputic de l'isoflurane et de permettre de respirer à l'effet. Une fois que la souris est euthanasié, retirer de la boîte.
  2. Cervicale disloquer tant que second moyen d'euthanasie.
  3. Stériliser la surface externe de la souris par le nettoyage de l'animal avec 70% d'éthanol.

2. Identification et isolement de Trois différents dépôts adipeux

  1. Le tissu adipeux brun (BAT) Isolement:
    1. Assurez-vous que la fourrure est humide de la purification de l'alcool pour aider à couper à travers l'épiderme et du derme layers.
    2. Placez la souris dans une position couchée avec son dos contre la table.
    3. Prenez la peau juste en dessous du diaphragme avec une pince, un ascenseur et inciser avec des ciseaux.
    4. Couper transversalement autour de la circonférence de la souris pour exposer le péritoine.
    5. Révéler le dépôt de BAT en forme de papillon par dégantage la moitié supérieure de la souris. Tenez les appendices et de l'abdomen dans une main et en tirant la peau vers le haut vers la tête.
    6. Orienter la souris, de sorte qu'il est positionné à plat ventre sur la table. Faites attention de ne pas contaminer le dépôt exposée avec des cheveux.
    7. Instruments chirurgicaux et les changements à une nouvelle paire de gants.
    8. Repérez les omoplates et le dépôt correspondant. Retirez soigneusement toute adipeux blanc superficielle sommet le papillon puis disséquer le papillon de la graisse brune interscapulaire. Soyez prudent pour éviter le muscle étroitement associé à la graisse brune.
      NOTE: L'utilisation d'un microscope de dissection est recommandé pour l'enlèvement de la white adipeux, ainsi que dans la séparation du tissu adipeux brun à partir de la scapula.
    9. Retirer le gras de dépôt et de transférer à un tube de 2 ml à centrifuger.
    10. Si l'ARN ou la protéine est à extraire, geler le tissu par immersion dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Congeler l'échantillon à la fois à prévenir la dégradation. Si la culture, couvrir le tissu dans DMEF-12 et mis sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont prélevés pour la culture (info supplémentaire).
  2. Isolement de tissu adipeux sous-cutanée (SQ), un tissu adipeux blanc Depot (WAT):
    1. Mettez sur une nouvelle paire de gants pour éviter la contamination croisée entre les dépôts de graisse.
    2. Révélez la inguinale, triangulaires dépôts de la SQ par De gantage la moitié inférieure de la souris. Tenez les appendices supérieurs et du thorax dans une main et en tirant la peau vers le bas vers les pieds de l'autre main.
    3. Orientez la souris en position couchée tout en faisant attention de ne pas contaminer le dépôt exposée avec des cheveux.
    4. Surgica Cleaninstruments de l et le changement à une nouvelle paire de gants.
    5. Disséquer soigneusement les triangles de graisse de la SQ. Veillez à ne pas contaminer l'échantillon avec le muscle, la graisse, les glandes mammaires voisin ou en coupant des vaisseaux et de contaminer l'échantillon de sang.
      NOTE: L'utilisation d'un microscope de dissection est recommandé si les frontières ne sont pas clairement définis.
    6. Retirer dépôts de graisse et transfert à 2 ml microtubes.
    7. Si l'ARN ou la protéine est à extraire, geler le tissu par immersion dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Congeler l'échantillon à la fois à prévenir la dégradation.
    8. Pour la coloration, fixer ou intégrer en octobre Si la culture, couvrir le tissu dans DMEF-12 et mis sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont prélevés pour la culture (info supplémentaire).
  3. Isolement de gonadique Fat un tissu adipeux viscéral (VAT) et le tissu adipeux blanc (WAT) Depot:
    1. Mettez sur une nouvelle paire de gants pour éviter la contamination croisée entre les dépôts de graisse.
    2. Avec la SCIssors, couper transversalement le péritoine, directement au-dessous du diaphragme. Couper le péritoine du diaphragme et le milieu du rectum coronaire pour exposer les organes abdominaux.
    3. Repérez les testicules ou des ovaires et d'identifier le tissu adipeux blanc ci-joint, connu sous le nom adipeux de l'épididyme chez les hommes ou adipeux gonadique chez les femmes.
    4. Instruments chirurgicaux et les changements à une nouvelle paire de gants
    5. Disséquer soigneusement les deux dépôts de graisse épididyme des testicules, épididyme et canal déférent. Ou si féminine, décortiquer soigneusement les deux coussinets adipeux gonadiques par les ovaires.
    6. Retirer dépôts de graisse et les transférer à deux tubes ml à centrifuger.
    7. Si l'ARN ou la protéine est à extraire, geler le tissu par immersion dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Congeler l'échantillon à la fois à prévenir la dégradation.
    8. Pour la coloration, fixer ou intégrer en octobre Si la culture, couvrir le tissu dans DMEF-12 et mis sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont prélevés pour la culture (info supplémentaire).

    3. Isolement de tissu adipeux périvasculaire (TVAP)

    1. Isolement du Cœur:
      1. Placez la souris dans une position couchée avec des appendices supérieurs et inférieurs étendus vers l'extérieur.
      2. Appendices sécurisées à l'aide du sparadrap.
      3. Après avoir positionné la souris comme indiqué ci-dessus, créer des tensions en soulevant la pointe du sternum avec une pince. Couper horizontalement à travers la membrane, ce qui expose la partie inférieure de la cavité thoracique.
      4. Tout en maintenant la tension, en soulevant la pointe du sternum, couper à travers la cage thoracique supérieurement vers la tête, juste à côté du sternum.
      5. Ramassez la cage thoracique juste inférieure à la clavicule, et couper le long de la longueur inférieure de la clavicule sur vers l'aisselle dans les deux directions. La cavité thoracique et son contenu (cœur, poumons, etc.) devraient maintenant être clairement visible.
      6. Nettoyez la cavité thoracique de sang étrangère et fluide en utilisant ga stérileuze pour absorber le fluide. Si des organes ou des récipients collecteurs être sûr de profuse (info supplémentaire).
      7. Une fois la zone dégagée de fluide, couper les vaisseaux des bronches et attachés à supprimer les poumons, ce qui permet une meilleure exposition du cœur.
    2. Localisation et Excision de tissu adipeux périvasculaire aortique (TVAP):
      1. Retirez les organes suivants de mieux identifier les parties inférieures de l'aorte: foie, de l'estomac, la rate, le pancréas, les intestins, et du côlon.
      2. D'abord commencer par l'identification de l'estomac et l'œsophage. Couper l'œsophage à la jonction gastro-œsophagienne de l'estomac pour libérer du corps.
      3. Ensuite, identifier les intestins et le mésentère environnante. Couper superficiellement par mésentère, car il se trouve très près à la partie rénale de l'aorte, puis "exécuter l'intestin."
      4. Couper le colon libre comme près du rectum que possible. Ainsi, la libération de l'estomac, de l'intestin et du colon de la souris.
      5. Rédéplacer l'estomac, de l'intestin, du colon, du pancréas et de la rate en coupant à travers le mésentère de fixation et les vaisseaux. Le pancréas et de la rate devraient venir gratuit avec l'estomac, de l'intestin et du côlon.
      6. Retirer le foie en coupant à travers les veines hépatiques et de fixation mésentère, retirez tous les lobes.
      7. Coupez la couche de graisse viscérale et entourent les reins. Laissez les reins attachés à l'aorte in vivo pour servir de marqueurs pour différents segments géographiques de l'aorte.
      8. Rincer la zone avec PBS 1x stérile et retirer tout le liquide par absorption avec une gaze stérile.
      9. Utilisation de micro-ciseaux et micro-pinces, séparer l'aorte de son attache dorsal à la colonne vertébrale et de son attache ventral à l'oesophage.
      10. Isoler l'aorte et en suivant l'aorte détacher la longueur de l'aorte descendante à partir de l'origine dans le coeur de la bifurcation dans la région iliaque.
      11. Identifier et isoler les vaisseaux sous-clavière. Isoler ces naviresà partir du cou à la racine aortique pour mieux exposer la jonction de l'aorte et la racine dans le cœur.
      12. Retirez le thymus puis couper l'artère brachiocéphalique, l'artère carotide commune gauche et l'artère sous-clavière gauche, permettant un mouvement du cœur.
      13. Avec l'aide d'un microscope de dissection, voir le tissu adipeux (TVAP) couche périvasculaire entourant l'aorte.
      14. En prenant grand soin de ne pas pincer ou serrer la TVAP, tirez doucement le chemin de la TVAP de l'aorte avec des micro-pince. Couper doucement la fixation de la TVAP de l'aorte avec des micro-ciseaux à partir de la région thoracique juste au-dessus de l'endroit où se trouve le diaphragme.
        REMARQUE: Un microscope de dissection est recommandé.
      15. Répéter ce procédé, la totalité de la longueur de l'aorte, de finition dans la région de l'aorte sous-rénale, qui est situé juste au-dessus de la bifurcation iliaque du navire aortique.
      16. Si arc aortique TVAP est souhaitée, utilisé la même méthode pour supprimer la TVAP de la moindre curvature de l'arc.
      17. Placez échantillons de TVAP dans 2 ml tube (s) à centrifuger.
      18. Si l'ARN ou la protéine est à extraire, geler le tissu par immersion dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Congeler l'échantillon à la fois à prévenir la dégradation. Si la culture, couvrir le tissu dans DMEF-12 et mis sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont prélevés pour la culture (info supplémentaire).
        REMARQUE: les dépôts adipeux supplémentaires à considérer si intéressé par une analyse complète de dépôt adipeux comprennent: rétropéritonéale, mésentérique, omental, péricardique et poplitée.

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Representative Results

Identification et la localisation du tissu adipeux inguinal sous-cutanée, adipeux brun interscapulaire, adipeux de l'épididyme viscérale (figure 1), ainsi que le tissu adipeux arc périvasculaire aortique, adipeux de l'aorte thoracique, adipeux aortique surrénale et adipeux aorte abdominale (figure 2) a été réalisée avec succès en utilisant la méthode chirurgicale décrite. L'examen histologique et la différenciation entre les échantillons sur les MTD et Wat ont été évalués positivement utilisant hématoxyline et de l'éosine (H & E) coloration (Figure 3). L'analyse des niveaux d'ARN de l'adiponectine (AdipoQ), peroxysomes récepteur gamma activé par les proliférateurs (PPAR-γ), la mort cellulaire induisant effecteur DFFA analogue à un (CIDEA), et autres graisses marqueurs spécifiques ont été mesurés pour tous les dépôts isolés et excisés ci-dessus (données non présentées).

Lignées de cellules primaires d'adipocytes sous-cutanés et périvasculaires adipocytes ont été cultivées et différenciée de préadipocyte s en adipocytes succès pour l'analyse des microréseaux. Les pré-adipocytes en adipocytes en culture convertis ont été confirmés avec Oil Red O coloration (figure 4). Isolement réussi, la culture et la différenciation des adipocytes a été atteint pour une utilisation dans des études in vitro, et l'activité de la protéine a été mesurée. L'activité enzymatique de la matrice metaloprotease-2 (MMP-2) a été mesuré dans un groupe de traitement par rapport au témoin. L'activité de MMP-2 a été mesurée in situ dans une lignée adipocytaire périvasculaire primaire par zymographie (figure 5).

Figure 1
Figure 1. emplacements anatomiques de C57BL / 6 mâles adipeux de souris dépôts. (A) Interscapular adipeux brun dépôt de graisse. (B) inguinale adipeux sous-cutané de dépôt de graisse. (C) de l'épididyme viscérale dépôt de graisse adipeuse.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. emplacements anatomiques des dépôts de TVAP une souris mâle C57BL / 6. (A) aortique dépôt adipeux arc périvasculaire. (B) de l'aorte thoracique de dépôt adipeux périvasculaire. (C) suprarénale aortique de dépôt adipeux périvasculaire. (D) infrarénale aortique de dépôt adipeux périvasculaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. coloration H & E des MTD et WAT adipeux. (A) H 8; E coloration de paraformaldéhyde fixe, inclus en paraffine C57BL / 6 échantillon de souris mâle du WAT adipeux à un grossissement 40X (B) coloration H & E de paraformaldéhyde fixe, la paraffine C57BL intégré / 6 échantillon de souris mâle des MTD à un grossissement 40X.. Se il vous plaît cliquez sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Oil Red O et coloration des préadipocytes en adipocytes en culture TVAP. (A) Oil Red O coloration des préadipocytes périvasculaires aortiques cultivées au départ de différenciation à 20X avec un contraste de phase. (B) Oil Red O coloration des adipocytes périvasculaires aortiques cultivées après 5 jours de différenciation à 20X avec un contraste de phase.es / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. zymographie des adipocytes différenciés, isolés à partir de tissu adipeux périvasculaire, a montré une diminution de l'activité de la MMP-2 libérée après traitement par rapport aux cellules non traitées (témoins), * P <0,01 par rapport au témoin.

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Discussion

L'obésité peut mener à une grande foule de morbidités et la pleine compréhension du rôle que joue adipeux ne est pas bien compris; recherche donc poursuivi dans le domaine de adipeux est nécessaire. Des modèles animaux, en particulier des modèles murins sont idéales pour la recherche initiale à la progression des maladies et des essais de traitements pharmaceutiques potentiels. En utilisant ces modèles, l'isolement et l'excision des dépôts adipeux précise est un outil extrêmement important et nécessaire dans l'étude de la pathologie des maladies adipeux touchés.

Dans la littérature actuelle concernant les dépôts adipeux, il existe une quantité importante de littérature concernant le comportement métabolique et la variation entre les dépôts adipeux, ainsi que leurs emplacements anatomiques. Cependant, rares sont ceux qui fournissent une méthode sur la façon de localiser précisément, identifier et isoler ces dépôts en profondeur. Sur la base de l'examen des méthodes d'isolation actuelles de adipeux, il ya un petit sous-ensemble de protocoles tfournir méthodologie chapeau sur la manière d'isoler une ou deux dépôts à la fois. Cependant, une technique précise qui permet l'isolement de plusieurs dépôts avec une quantité minimale de la dissection et la contamination, ainsi que des adresses différentes méthodes d'étude des échantillons prélevés est distinctive à ce protocole 13-14.

Dans cette méthode, il ya plusieurs étapes qui sont d'une importance vitale à l'isolement et la pureté de l'échantillon. Nettoyage des outils, des gants et des surfaces fréquemment pour enlever les poils et les contaminants est une étape indispensable pour éviter la contamination dépôt. Lors de la coupe transversalement la peau autour de la circonférence de la souris pour exposer le péritoine pour dégantage, il est essentiel d'éviter de couper trop profondément. Couper le péritoine fera dégantage très difficile et augmenter le risque de contamination de l'échantillon. Lorsque exciser les dépôts adipeux SQ, il est essentiel d'identifier les limites triangulaires du dépôt avant toute excision de l'annonceipose. En outre, les réductions prudentes devraient être faits pour éviter musculaire, et à côté des navires, les glandes et adipeux. Cela permettra d'éviter la contamination de l'échantillon de remplacement à partir de tissu adipeux, le tissu glandulaire, le muscle ou le sang.

La limitation majeure à l'isolement et l'excision de dépôts adipeux, dans cette méthode et d'autres méthodes similaires peuvent être trouvées dans la définition des limites de certains dépôts. En raison des frontières mal définies dans les dépôts, tels que les dépôts sous-cutanées, l'isolement manque une petite quantité de contamination par adipeux voisin peut être difficile. Une autre limitation peut être recherchée en assurant suffisamment de tissu est recueilli pour l'expérimentation supplémentaire dans vasculaires associée dépôts. Cette limitation nécessite parfois la mise en commun d'échantillons, bien que cela dépend de l'emplacement de l'isolement et de l'alimentation associée à l'animal.

Après les dépôts adipeux sont isolés, ils peuvent être utilisés pour une variété de dosages. Le tissu adipeux peut être utiliséj pour les études moléculaires telles que l'expression des protéines, l'activité enzymatique et l'analyse de l'expression génique. En outre, on peut isoler les adipocytes pour la ligne de cellules primaires des études in vitro. Des lignées cellulaires immortalisées peuvent également être utilisés pour des études in vitro, cependant cellules immortelles ne sont pas aussi crédible que des lignées cellulaires isolées primaires. Enfin, le tissu adipeux peut être fixe ou congelé dans de l'OCT pour un examen histologique pour déterminer l'infiltration des leucocytes, la localisation des protéines, ainsi que la caractérisation de la morphologie des adipocytes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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References

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