Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Medicine

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Summary

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

Adiposo hizo una aparición notable en la atención de los medios, debido al aumento espectacular de la obesidad durante las últimas décadas del siglo 20. La obesidad afecta actualmente a más de un tercio de los adultos y el 17% de los niños y adolescentes en los Estados Unidos (US) 1. Que abarca todos los grupos étnicos, la investigación estadística que rodea la epidemia de la obesidad se ha demostrado que los negros no hispanos tienen la tasa ajustada por edad más alta de obesidad (49,5%) en comparación con los mexicano-americanos (40,4%), los hispanos (39.1%), y no los blancos no hispanos (34,3%) 2. El efecto económico de la obesidad es también una preocupación cada vez mayor para el sistema sanitario. En 2012, se estimó que el costo anual de la atención médica para la obesidad en los EE.UU. en 2005 fue de $ 190,2 mil millones, casi el 21% del presupuesto total de los gastos médicos. Tristemente, la obesidad infantil se estima que es responsable por $ 14 mil millones en costos médicos directos solo. Estadísticamente, se determinó que el costo médico promedio deindividuos con obesidad fue $ 2,741 superior al año que aquellos sin esta morbilidad 3-5.

La obesidad es un factor de riesgo importante para una variedad de condiciones tales como: la diabetes tipo 2, dislipidemia, enfermedad cardiovascular, cáncer, trastornos esqueléticos musculares y la inflamación crónica. La obesidad está profundamente ligada a la patogénesis del síndrome metabólico y otras enfermedades crónicas 6-8. Con este tipo de conexiones drásticas y negativas entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación científica ha centrado la atención para comprender mejor la epidemia actual y los papeles diversos y esencial desempeñada por adiposo.

Históricamente, el tejido adiposo se considera intrascendente y fue visto simplemente como un tejido simple relleno. Actualmente, adiposo se ha demostrado que desempeñan muchas funciones esenciales en la función del cuerpo en: metabolismo, la regulación hormonal, la inflamación, la protección y el aislamiento 9. El tejido adiposo está compuesto principalmente deadipocitos, pero también contiene los pericitos, células endoteliales, monocitos, macrófagos y células madre pluripotentes 8. El tejido adiposo se distribuye por todo el cuerpo en depósitos distintos. Los principales depósitos se pueden encontrar por vía subdérmica, subcutánea, intramuscular, y visceral 10. Depósitos adiposos se han demostrado tener unos perfiles metabólicos específicos de depósito, que han demostrado una susceptibilidad específica de depósito a la obesidad y trastornos relacionados 8.

Tradicionalmente, el tejido adiposo se ha clasificado en dos tipos principales: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT); aunque la literatura reciente indica las presencias de un tercer grupo bautizaron adiposo brite o beige 11. El tejido adiposo se ha demostrado que tienen diferentes colores, morfologías, funciones metabólicas, las características bioquímicas y patrones de expresión genéticos 10. Los adipocitos en WAT tienen un único y gran gotas de lípidos y cantidades variables de las mitocondrias. WATse encuentra predominantemente en las localidades subcutáneos y viscerales del cuerpo. Funciones WAT principalmente como un sitio de almacenamiento de energía y la protección de órganos. Los adipocitos en BAT tienen una morfología multilocular y abundantes mitocondrias. BAT se encuentra principalmente en el cuello y los grandes vasos sanguíneos del tórax, así como las escápulas 12. BAT funciona principalmente en los comportamientos de gastar energía que regulan la termogénesis 7. Adiposo Brite o beige se ha demostrado que compartir una morfología y la expresión análoga a BAT pero se ha encontrado para ser originado a partir de adipocitos blancos 11.

El método quirúrgico se describe en este manuscrito proporciona a los investigadores la capacidad de analizar los diferentes efectos que factores tales como: medio ambiente, productos farmacéuticos, y la genética, tienen sobre adiposo; así como el papel adiposo beneficioso o perjudicial juega en la enfermedad y la salud en general. Además, proporcionando una manera de identificar y aislar diferentes tipos de tejido adiposo parapermitirá comprender mejor las relaciones bioquímicas y diferencias entre los depósitos. Esto puede ayudar en la determinación de la relación entre la ubicación, la función y tipos de grasa en el cuerpo. Este método descrito logra esto proporcionando los medios para la visualización bruto, el análisis de la expresión génica, análisis de la expresión de proteínas, el examen histológico, y el aislamiento de líneas celulares primarias para estudios in vitro. Actualmente hay muchos artículos que proporcionan información sobre el comportamiento metabólico de los diferentes depósitos de tejido adiposo, así como sus localizaciones anatómicas; pero no proporcionan un método en profundidad sobre cómo localizar de forma específica, identificar y aislar a estos depósitos. Este método proporciona una técnica quirúrgica precisa que permite el aislamiento de múltiples depósitos con una cantidad mínima de la disección y la contaminación en comparación con otros métodos diseñados para el aislamiento de uno o dos depósitos 13-14.

El objetivo de este protocolo es proporcionarun método preciso para la identificación y el aislamiento de diferentes tipos de depósitos de grasa desde múltiples localizaciones anatómicas.

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Protocol

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Cincinnati y de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No . 85-23, revisado 1996).

1. La eutanasia y esterilizar el ratón

  1. Coloca el ratón en un dropbox que contiene una dosis supratheraputic de isoflurano y permitir a inhalar a efecto. Una vez que el ratón es sacrificado, retirar de la caja.
  2. Cervical dislocar como un segundo medio de la eutanasia.
  3. Esterilizar la superficie externa del ratón por la limpieza del animal con etanol al 70%.

2. Identificación y aislamiento de tres diferentes depósitos adiposos

  1. Tejido adiposo marrón (BAT) Aislamiento:
    1. Asegúrese de que la piel está húmeda de la limpieza de alcohol para ayudar a la corte a través de la epidermis y la dermis layers.
    2. Coloque el ratón en una posición supina con la espalda contra la mesa.
    3. Coge la piel justo debajo del diafragma con fórceps, ascensor y una incisión con tijeras.
    4. Cortar transversalmente alrededor de la circunferencia del ratón para exponer el peritoneo.
    5. Revelar la BAT depósito en forma de mariposa por degloving la mitad superior del ratón. Mantenga los apéndices inferiores y el abdomen en una mano y tirando de la piel hacia la cabeza.
    6. Orientar el ratón, de modo que se coloca boca abajo en la mesa. Tenga cuidado de no contaminar el depósito expuesto con el pelo.
    7. Instrumentos quirúrgicos limpios y el cambio a un nuevo par de guantes.
    8. Busque la escápula y depósito correspondiente. Retire con cuidado el adiposo blanco superficial encima de la mariposa y luego diseccionar la mariposa de la grasa marrón interescapular. Tenga cuidado de evitar que el músculo estrechamente asociado con la grasa parda.
      NOTA: El uso de un microscopio de disección se recomienda para la eliminación de la white adiposo, así como en la separación de la adiposo marrón de las escápulas.
    9. Quite la grasa de depósito y transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
    10. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación. Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
  2. Aislamiento de tejido adiposo subcutáneo (SC), un blanco tejido adiposo Depot (WAT):
    1. Póngase un par de guantes nuevos como a la contaminación cruzada entre los depósitos de grasa.
    2. Revelar la inguinal, depósitos SQ triangulares por DE-enguantado la mitad inferior del ratón. Mantenga los apéndices superiores y tórax en una mano y tirando de la piel hacia abajo hacia los pies con la otra mano.
    3. Oriente el ratón en una posición supina con cuidado de no contaminar el depósito expuesto con el pelo.
    4. Surgica Cleaninstrumentos l y el cambio a un nuevo par de guantes.
    5. Diseccionar cuidadosamente los triángulos de grasa SQ. Tenga cuidado de no contaminar la muestra con el músculo, la vecina de grasa, glándulas mamarias o cortando cualquier barco y contaminar la muestra de sangre.
      NOTA: El uso de un microscopio de disección se recomienda si las fronteras no están claramente definidos.
    6. Retire los depósitos de grasa y la transferencia a 2 ml tubos de microcentrífuga.
    7. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación.
    8. Para la tinción, arreglar o incrustar en octubre Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
  3. Aislamiento de gonadal Fat un tejido adiposo visceral (IVA) y el tejido adiposo blanco (WAT) Depot:
    1. Póngase un par de guantes nuevos como a la contaminación cruzada entre los depósitos de grasa.
    2. Con cienciassors, cortar el peritoneo transversalmente, directamente debajo del diafragma. Cortar el peritoneo desde el diafragma hasta mediados recto coronalmente para exponer los órganos abdominales.
    3. Localizar los testículos o los ovarios e identificar el tejido adiposo blanco adjunto, conocido como el adiposo del epidídimo en varones o adiposo gonadal en las hembras.
    4. Instrumentos quirúrgicos limpios y el cambio a un nuevo par de guantes
    5. Diseccionar cuidadosamente ambos depósitos de grasa del epidídimo de los testículos, epidídimos y conductos deferentes. O si es mujer, diseccionar cuidadosamente ambas almohadillas de grasa gonadal de los ovarios.
    6. Retire los depósitos de grasa y transferirlos a 2 tubos de microcentrífuga ml.
    7. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación.
    8. Para la tinción, arreglar o incrustar en octubre Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).

    3. Aislamiento de tejido adiposo perivascular (IVAP)

    1. Aislamiento del Corazón:
      1. Coloque el ratón en una posición supina con apéndices superior e inferior extendidas hacia afuera.
      2. Apéndices Seguros que utilizan una cinta quirúrgica.
      3. Después de colocar el ratón como se indica anteriormente, crear tensión levantando el proceso xifoides con fórceps. Cortar horizontalmente a través del diafragma, la exposición de la parte inferior de la cavidad torácica.
      4. Mientras mantiene la tensión, levantando el proceso xifoides, cortar a través de la caja torácica superiormente hacia la cabeza, sólo para el lado del esternón.
      5. Recoger la caja torácica justo por debajo de la clavícula, y cortar a lo largo de la longitud inferior de la clavícula hacia fuera hacia la axila en ambas direcciones. La cavidad torácica y su contenido (corazón, pulmones, etc.) deben ahora ser claramente visible.
      6. Limpie la cavidad torácica de la sangre ajena y líquido utilizando ga estériluze para absorber el fluido. Si órganos o recipientes colectores asegúrese de profuso (información complementaria).
      7. Una vez que el área se borra de líquido, cortar los vasos y bronquios de fijación para eliminar los pulmones, lo que permite una mejor exposición del corazón.
    2. Localización y Escisión de tejido adiposo perivascular aórtica (IVAP):
      1. Quite los siguientes órganos como para identificar mejor las porciones inferiores de la aorta: hígado, estómago, bazo, páncreas, intestinos y colon.
      2. En primer lugar comenzar con la identificación del estómago y el esófago. Cortar el esófago en la unión gastro-esofágica para liberar el estómago del cuerpo.
      3. A continuación, identificar los intestinos y el mesenterio circundante. Cortar superficialmente a través de mesenterio, ya que se encuentra muy de cerca a la porción renal de la aorta, luego "ejecutar el intestino."
      4. Cortar el colon libre como cerca del recto posible. Por lo tanto, liberando el estómago, intestino y colon de ratón.
      5. Remover el estómago, intestino, colon, páncreas y el bazo cortando a través del mesenterio de fijación y los vasos. El páncreas y el bazo deben venir libre con el estómago, intestino y colon.
      6. Retire el hígado por el corte a través de las venas hepáticas y adjuntando mesenterio, retire todos los lóbulos.
      7. Cortar la capa visceral y la grasa rodean los riñones. Deja los riñones unidos a la aorta in vivo para servir como marcadores geográficos para los diferentes segmentos de la aorta.
      8. Enjuague el área con 1x PBS estéril y eliminar todo el fluido por absorción con una gasa estéril.
      9. El uso de micro-tijeras y micro-pinzas, separar la aorta de su apego a la espina dorsal y su enganche ventral al esófago.
      10. Aislar la aorta siguiendo y desconexión de la aorta de la longitud de la aorta descendente desde el origen en el corazón hasta la bifurcación en la región ilíaca.
      11. Identificar y aislar los vasos subclavia. Aislar estas embarcacionesdesde el cuello hasta la raíz aórtica para exponer mejor la unión aórtica y la raíz en el corazón.
      12. Retire el timo a continuación, cortar el tronco braquiocefálico, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda, permitiendo el movimiento del corazón.
      13. Con la ayuda de un microscopio de disección, ver la capa de tejido adiposo perivascular (IVAP) que rodea la aorta.
      14. Teniendo mucho cuidado para no pellizcar o apretar el IVAP, tire suavemente de la manera IVAP de la aorta con micro-forceps. Cortar suavemente la fijación de la IVAP a la aorta con micro-tijeras a partir de la región torácica justo por encima de donde se encuentra el diafragma.
        NOTA: Se recomienda utilizar un microscopio de disección.
      15. Repita este proceso toda la longitud de la aorta, terminando en la región de la aorta infrarrenal, que se encuentra justo por encima de la bifurcación ilíaca del vaso aórtico.
      16. Si se desea arco IVAP aórtica, que se utiliza el mismo método para eliminar el IVAP de la menor curvature del arco.
      17. Coloque las muestras IVAP en 2 ml tubo (s) de microcentrífuga.
      18. Si el ARN o proteína es a extraer, congelar el tejido por inmersión en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Congelar la muestra a la vez para evitar la degradación. Si el cultivo, cubrir el tejido en DMEF-12 y establecer en hielo hasta que se recogen todas las muestras para cultivo (información complementaria).
        NOTA: los depósitos adiposos adicionales a tener en cuenta si está interesado en un análisis exhaustivo de depósito adiposo incluye: retroperitoneal, mesentérica, omental, pericárdico y poplítea.

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Representative Results

Identificación y localización de inguinal adiposo subcutáneo, tejido adiposo marrón interescapular, adiposo del epidídimo visceral (Figura 1), así como el adiposo perivascular arco aórtico, la aorta torácica adiposo, tejido adiposo aórtica suprarrenal y el tejido adiposo de la aorta infrarrenal (Figura 2) se logró con éxito utilizando el método quirúrgico descrito. El examen histológico y la diferenciación entre muestras MTD y WAT fueron evaluados positivamente mediante hematoxilina y eosina (H & E) tinción (Figura 3). Análisis de los niveles de ARN de adiponectina (AdipoQ), peroxisomas gamma del receptor activado por el proliferador (PPAR-γ), se midieron induce a la muerte celular DFFA-como un efector (CIDEA), y otras grasas de marcadores específicos para todos los depósitos aislados y extirpados anteriores (datos no presentados).

Líneas celulares primarios de adipocitos subcutáneos y adipocitos perivasculares se cultivaron y diferenciada de preadipocito s a adipocitos con éxito para el análisis de microarrays. Los preadipocitos cultivados convertidos a adipocitos se confirmaron con la tinción con Oil Red O (Figura 4). El éxito de aislamiento, cultivo y diferenciación de adipocitos se logró para su uso en estudios in vitro, y la actividad de la proteína se midió con éxito. La actividad enzimática de la matriz metaloproteasa-2 (MMP2) se midió en un grupo de tratamiento en comparación con el control. La actividad de MMP2 se midió in situ en una línea de adipocitos perivascular primaria a través de zimografía (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. localizaciones anatómicas de C57BL / 6 machos depósitos adiposos ratón. Depósito (A) interescapular adiposo marrón grasa. (B) inguinal depósito de grasa adiposo subcutáneo. (C) del epidídimo depósito de grasa visceral adiposo.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. localizaciones anatómicas de depósitos IVAP en un ratón macho C57BL / 6. (A) de la aorta depósito adiposo perivascular arco. (B) de la aorta torácica depósito adiposo perivascular. (C) suprarrenal aórtica depósito adiposo perivascular. (D) infrarrenal aórtica depósito adiposo perivascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. H & E tinción de BAT y adiposo WAT. (A) H E tinción de paraformaldehído fijo, parafina embebido C57BL 6 muestra ratón macho / de adiposo WAT con un aumento de 40X (B) Tinción H & E de paraformaldehído fijo, parafina C57BL incrustado 6 muestra ratón macho / de BAT con un aumento de 40X; 8.. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Oil Red O tinción de preadipocitos IVAP cultivadas y adipocitos. Tinción (A) Oil Red O de los preadipocitos perivasculares aórticas cultivadas al inicio del estudio de la diferenciación de 20 aumentos con contraste de fase. (B) Oil Red O tinción de los adipocitos perivasculares aórticas cultivadas después de 5 días de diferenciación de 20 aumentos con contraste de fase.en / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. La zimografía de los adipocitos diferenciados, aisladas de tejido adiposo perivascular, demostró una disminución de la actividad de MMP2 liberado después de tratamiento en comparación con las células no tratadas (control), * P <0,01 en comparación con el control.

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Discussion

La obesidad puede conducir a una gran cantidad de morbilidades y la plena comprensión del papel que juega adiposo no se entiende completamente; Por lo tanto, la investigación continuada en el campo de la adiposo es necesario. Los modelos animales, específicamente modelos murinos son ideales para la investigación inicial en la progresión de las enfermedades y las pruebas de los posibles tratamientos farmacéuticos. En el uso de estos modelos, el aislamiento y la escisión precisa de los depósitos de tejido adiposo es una herramienta extremadamente importante y necesario en el estudio de la patología de las enfermedades adiposo afectados.

En la literatura actual con respecto a los depósitos de tejido adiposo, hay una cantidad sustancial de literatura con respecto al comportamiento metabólico y la variación entre los depósitos de tejido adiposo, así como sus localizaciones anatómicas. Sin embargo, son pocos los que proporcionan un método en profundidad sobre cómo localizar de forma específica, identificar y aislar a estos depósitos. Con base en la revisión de los métodos de aislamiento actuales de adiposo, hay un pequeño subconjunto de protocolos tsombrero de proporcionar la metodología sobre cómo aislar uno o dos depósitos a la vez. Sin embargo, una técnica precisa que permite el aislamiento de múltiples depósitos con una cantidad mínima de la disección y la contaminación, así como direcciones diferentes métodos de estudio de las muestras recogidas se distingue a este protocolo 13-14.

Dentro de esta metodología, hay varios pasos que son de vital importancia para el aislamiento y la pureza de la muestra. Limpieza de herramientas, guantes y superficies con frecuencia para eliminar el vello y los contaminantes es un paso imprescindible para evitar la contaminación de depósito. Al cortar transversalmente la piel alrededor de la circunferencia del ratón para exponer el peritoneo para degloving, es vital para evitar cortar demasiado profundamente. Cortar el peritoneo hará degloving muy difícil y aumentará la posibilidad de contaminación de la muestra. Cuando la escisión de los depósitos adiposos SQ es vital para identificar los límites triangulares del depósito antes de la escisión de cualquiera de los anunciosipose. Además, se deben hacer recortes cuidadosos para evitar muscular, y adyacente vasos, glándulas y adiposo. Esto evitará la contaminación de la muestra desde adiposo alternativa, el tejido glandular, muscular o de la sangre.

La principal limitación para el aislamiento y la escisión de los depósitos adiposos, en este método y otros métodos comparables se puede encontrar en la definición de los límites de ciertos depósitos. Debido a los bordes mal definidos en depósitos, como los depósitos subcutáneos, sin aislar una pequeña cantidad de contaminación por adiposo vecino puede ser un reto. Otra limitación se puede encontrar en asegurar suficiente tejido se recoge para la experimentación suplementaria en depósitos vasculares asociadas. Esta limitación a veces requiere la puesta en común de las muestras, aunque esto depende en el sitio de aislamiento y la dieta asociado con el animal.

Después se aíslan los depósitos de tejido adiposo, que pueden ser utilizados para una variedad de ensayos. El tejido adiposo puede ser usod para los estudios moleculares, tales como la expresión de proteínas, la actividad enzimática y el análisis de la expresión génica. Además, se puede aislar adipocitos para línea celular primaria en estudios in vitro. Líneas de células inmortalizadas se pueden utilizar también para los estudios in vitro, sin embargo células inmortales no son tan creíble como líneas celulares aisladas primarias. Finalmente, el tejido adiposo puede ser fijo o congeladas en OCT para el examen histológico para identificar la infiltración de leucocitos, la localización de proteínas, así como la caracterización de la morfología de los adipocitos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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References

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