Localizzazione, identificazione, e l'escissione dei Depositi Murine adipose

Medicine

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Summary

Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

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Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

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Abstract

Introduction

Adiposa fatto un'apparizione notevole sotto i riflettori dei media, a causa della notevole aumento di obesità negli ultimi decenni del 20 ° secolo. L'obesità colpisce attualmente più di un terzo degli adulti e il 17% di bambini e adolescenti negli Stati Uniti (US) 1. Spanning tutti i gruppi etnici, ricerca statistica che circonda l'epidemia di obesità ha mostrato che i neri non ispanici hanno il tasso aggiustato per età più alta di obesità (49,5%) rispetto ai messicani americani (40,4%), tutti gli ispanici (39,1%), e non bianchi ispanici (34,3%) 2. L'effetto economico di obesità è anche una preoccupazione crescente per il sistema sanitario. Nel 2012, è stato stimato che il costo medico annuale delle cure per l'obesità negli Stati Uniti nel 2005 è stato di 190,2 miliardi dollari, quasi il 21% del bilancio complessivo di spesa medica. Purtroppo, l'obesità infantile è stata stimata essere responsabile a $ 14 miliardi di dollari in costi medici diretti da solo. Statisticamente, è stato determinato che il costo medio di medicaindividui con obesità è stato $ 2741 superiore di un anno rispetto a quelli senza questa morbosità 3-5.

L'obesità è un importante fattore di rischio per una serie di condizioni, quali: diabete di tipo 2, dislipidemia, malattie cardiovascolari, cancro, disturbi muscolari e scheletrici infiammazione cronica. L'obesità è profondamente legata alla patogenesi della sindrome metabolica e di altre malattie croniche 6-8. Con tali connessioni drastiche e negativi tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca scientifica si è concentrata l'attenzione per capire meglio l'epidemia attuale e le diverse e cardine ruoli adiposo.

Storicamente, il tessuto adiposo è stato considerato irrilevante ed è stato considerato solo come un semplice tessuto di riempimento. Attualmente, adiposo ha dimostrato di giocare molti ruoli essenziali nella funzione del corpo in: metabolismo, regolazione ormonale, l'infiammazione, la protezione e l'isolamento 9. Il tessuto adiposo è composto principalmente daadipociti, ma contiene anche periciti, le cellule endoteliali, monociti, macrofagi e cellule staminali pluripotenti 8. Il tessuto adiposo è distribuito in tutto il corpo in depositi distinti. I principali depositi si trovano subdermally, per via sottocutanea, intramuscolare, e visceralmente 10. Depositi adiposi hanno dimostrato di avere deposito specifici profili metabolici, che hanno mostrato una predisposizione specifica depot di obesità e disturbi correlati 8.

Tradizionalmente, il tessuto adiposo è stata classificata in due tipi principali: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT); anche se recente letteratura indica le presenze di un terzo gruppo battezzato brite o beige adiposo 11. Il tessuto adiposo è stato dimostrato di avere colori diversi, morfologie, funzioni metaboliche, le caratteristiche biochimiche e modelli genetici di espressione 10. Gli adipociti in WAT hanno un unico, grande goccia di lipidi e di quantità variabili di mitocondri. WATsi trova in località prevalentemente sottocutaneo e viscerale del corpo. Funzioni WAT principalmente come un sito di stoccaggio di energia e di protezione d'organo. Gli adipociti in BAT hanno una morfologia multiloculare e mitocondri abbondanti. BAT si trova principalmente nel collo e grandi vasi sanguigni del torace, nonché le scapole 12. BAT funzioni principalmente a comportamenti dispendio energetico che regolano la termogenesi 7. Adiposo Brite o beige ha dimostrato di condividere una morfologia analogo ed espressione BAT, ma è stato trovato per essere originato da adipociti bianchi 11.

Il metodo chirurgico descritto in questo manoscritto fornisce ai ricercatori con la capacità di analizzare diversi effetti che fattori quali: l'ambiente, i prodotti farmaceutici, e la genetica, hanno sulla adiposo; così come il ruolo adiposo benefico o dannoso gioca nella malattia e la salute generale. Inoltre, fornendo un modo per identificare e isolare diversi tipi di tessuto adiposopermettere una migliore comprensione delle relazioni biochimiche e le differenze tra depositi. Questo può aiutare a determinare il rapporto tra posizione, la funzione, e tipi di grassi nel corpo. Questo metodo descritto realizza questo fornendo i mezzi per la visualizzazione lordo, analisi di espressione genica, analisi di espressione della proteina, l'esame istologico, e l'isolamento di linee cellulari primarie per studi in vitro. Attualmente non ci sono molti articoli che forniscono informazioni sul comportamento metabolico dei diversi depositi adiposi, nonché le loro sedi anatomiche; ma non forniscono un metodo di approfondimento su come localizzare in particolare, di identificare e isolare questi depositi. Questo metodo fornisce una tecnica chirurgica precisa che permette l'isolamento di più depositi con una quantità minima di dissezione e la contaminazione rispetto ad altri metodi progettati per l'isolato di uno o due depositi 13-14.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornireun metodo preciso per l'identificazione e l'isolamento di diversi tipi di depositi di grasso di molteplici posizioni anatomiche.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale (IACUC) dell 'Università di Cincinnati ed in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health (NIH Publication No . 85-23, Revised 1996).

1. Euthanize e sterilizzare il mouse

  1. Posizionare il mouse in un set contenente una dose supratheraputic di isoflurano e permettono di inalare a effetto. Una volta che il mouse è eutanasia, rimuoverlo dalla scatola.
  2. Cervicale dislocate come un secondo mezzo di eutanasia.
  3. Sterilizzare la superficie esterna del mouse dalla pulizia del animale con etanolo al 70%.

2. Identificazione e isolamento di tre diversi Depositi adipose

  1. Brown Tessuto adiposo (BAT) Isolamento:
    1. Assicurarsi che il pelo è bagnato dalla pulizia alcol per facilitare il taglio attraverso la epidermico e dermico Layers.
    2. Posizionare il mouse in posizione supina con la schiena contro il tavolo.
    3. Afferra la pelle appena sotto il diaframma con una pinza, ascensore e incidere con le forbici.
    4. Tagliare trasversalmente attorno alla circonferenza del mouse per esporre il peritoneo.
    5. Rivela il deposito BAT a forma di farfalla dal degloving la metà superiore del mouse. Tenere le appendici inferiori e dell'addome in una mano e tirando la pelle verso la testa.
    6. Orientare il mouse, in modo che sia posizionato prono sul tavolo. Fare attenzione a non contaminare il deposito a vista con i capelli.
    7. Strumenti chirurgici pulite e cambiamento per un nuovo paio di guanti.
    8. Individuare le scapole e deposito corrispondente. Rimuovere con cautela qualsiasi adiposo bianco superficiale in cima la farfalla e poi sezionare la farfalla di interscapolare grasso bruno. Fare attenzione a evitare il muscolo strettamente associato con il grasso marrone.
      NOTA: L'uso di un microscopio dissezione è raccomandato per la rimozione del white adiposo, così come nella separazione del adiposo marrone dal scapole.
    9. Rimuovere deposito di grasso e trasferire in una provetta 2 ml.
    10. Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado. Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
  2. Isolamento di sottocutaneo tessuto adiposo (SQ), un bianco Tessuto adiposo Depot (WAT):
    1. Mettere su un nuovo paio di guanti per non contaminare tra depositi di grasso.
    2. Rivela il inguinale, depositi SQ triangolari da DE-guanto la metà inferiore del mouse. Tenere le appendici superiori e torace in una mano e tirando la pelle verso i piedi con l'altra mano.
    3. Orientare il mouse in posizione supina facendo attenzione a non contaminare il deposito a vista con i capelli.
    4. Clean surgicastrumenti l e passare a un nuovo paio di guanti.
    5. Sezionare con cura i triangoli di grasso SQ. Fare attenzione a non contaminare il campione con il muscolo, la vicina di grasso, ghiandole mammarie o tagliando le navi e contaminare il campione di sangue.
      NOTA: L'uso di un microscopio dissezione è consigliata se i confini non sono chiaramente definiti.
    6. Rimuovere depositi di grasso e trasferire a 2 ml microprovette.
    7. Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado.
    8. Per la colorazione, correggere o incorporare in ottobre Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
  3. Isolamento di gonadica Fat un tessuto adiposo viscerale (VAT) e Bianco Tessuto adiposo (WAT) Depot:
    1. Mettere su un nuovo paio di guanti per non contaminare tra depositi di grasso.
    2. Con scissors, tagliate il peritoneo trasversalmente, direttamente sotto il diaframma. Tagliare il peritoneo dal diaframma alla metà del retto coronale per esporre gli organi addominali.
    3. Individuare i testicoli o delle ovaie e identificare il tessuto adiposo bianco attaccato, noto come il adiposo epididimale nei maschi o adiposo gonadica nelle femmine.
    4. Strumenti chirurgici puliti e cambiare per un nuovo paio di guanti
    5. Sezionare con cura entrambi i depositi di grasso dell'epididimo dal testicoli, epididimi, e vasi deferenti. Oppure, se femmina, sezionare accuratamente entrambi cuscinetti di grasso gonadici dalle ovaie.
    6. Rimuovere i depositi di grasso e trasferirli a 2 tubi ml microcentrifuga.
    7. Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado.
    8. Per la colorazione, correggere o incorporare in ottobre Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).

    3. Isolamento di Perivascolare Tessuto adiposo (PVAT)

    1. Isolamento del Cuore:
      1. Disporre il mouse in posizione supina con appendici superiori e inferiori estesi verso l'esterno.
      2. Appendici protetta tramite nastro chirurgico.
      3. Dopo aver posizionato il mouse, come riportato sopra, creare tensione sollevando il processo xifoideo con una pinza. Tagliare orizzontalmente attraverso la membrana, esponendo la parte inferiore della cavità toracica.
      4. Pur mantenendo la tensione, sollevando il processo xifoideo, tagliare la gabbia toracica superiormente verso la testa, appena a lato dello sterno.
      5. Sollevare la gabbia toracica appena inferiore alla clavicola, e tagliare lungo la lunghezza inferiore della clavicola verso il cavo ascellare in entrambe le direzioni. La cavità toracica e il suo contenuto (cuore, polmoni, ecc) ora dovrebbero essere chiaramente visibili.
      6. Pulire la cavità toracica di sangue estraneo e fluido usando ga sterileuze di assorbire il liquido. Se gli organi di raccolta o navi sono sicuri profusa (info supplementare).
      7. Una volta che la superficie è eliminato da fluido, tagliare i vasi bronchi e connessi per rimuovere i polmoni, permettendo una migliore esposizione del cuore.
    2. Localizzazione e Asportazione di aortica Perivascolare Tessuto adiposo (PVAT):
      1. Rimuovere i seguenti organi per identificare meglio le parti inferiori della aorta: fegato, stomaco, milza, pancreas, intestino, e colon.
      2. Prima iniziare con l'identificazione dello stomaco e dell'esofago. Tagliare dell'esofago alla giunzione gastro-esofageo per liberare lo stomaco dal corpo.
      3. Avanti, individuare l'intestino e mesentere circostante. Tagliare superficialmente attraverso mesentere, in quanto si trova molto vicino alla parte renale dell'aorta, poi "eseguire l'intestino."
      4. Tagliare il colon liberare il più vicino al retto possibile. Così, liberando lo stomaco, intestino e colon dal mouse.
      5. Respostare lo stomaco, intestino, colon, pancreas e milza tagliando attraverso il mesentere Collegamento e vasi. Il pancreas e la milza dovrebbe venire gratis con lo stomaco, intestino e colon.
      6. Rimuovere il fegato tagliando attraverso le vene epatiche e allegando mesentere, rimuovere tutti i lobi.
      7. Tagliare via lo strato di grasso viscerale e circondano i reni. Lasciare i reni allegate all'aorta in vivo per servire come marcatori geografiche per diversi segmenti dell'aorta.
      8. Risciacquare la zona con 1x PBS sterile e rimuovere tutto il fluido per assorbimento con una garza sterile.
      9. Utilizzando micro-forbici e micro-pinza, separare l'aorta dal suo attaccamento dorsale per la colonna vertebrale e il suo attaccamento ventrale all'esofago.
      10. Isolare l'aorta seguendo e staccando l'aorta la lunghezza dell'aorta discendente dall'origine nel cuore alla biforcazione della regione iliaca.
      11. Identificare e isolare i vasi succlavi. Isolare questi vasidal collo alla radice aortica per esporre meglio la giunzione aortica e la radice nel cuore.
      12. Rimuovere il timo poi tagliare l'arteria brachiocefalico, l'arteria carotide comune sinistra, e succlavia sinistra, permettendo il movimento del cuore.
      13. Con l'aiuto di un microscopio dissezione, visualizzare il tessuto adiposo (PVAT) strato perivascolare che circonda l'aorta.
      14. Facendo molta attenzione a non schiacciare o spremere il PVAT, tirare delicatamente il modo PVAT dall'aorta con micro-pinza. Tagliare delicatamente il fissaggio del PVAT all'aorta con micro-forbici a partire regione toracica appena superiore al punto in cui si trova il diaframma.
        NOTA: Si consiglia un microscopio a dissezione.
      15. Ripetere questo processo l'intera lunghezza dell'aorta, terminando a regione aortica sottorenale, che si trova appena superiore alla biforcazione iliaca del vaso aortico.
      16. Se aortico PVAT è desiderato, utilizzato lo stesso metodo per rimuovere il PVAT dalla minore curvature dell'arco.
      17. Posizionare i campioni PVAT in 2 ml provetta (s).
      18. Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado. Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
        NOTA: ulteriori depositi adiposi da considerare se interessati in una completa analisi depot adiposo includono: retroperitoneale, mesenterica, omentale, pericardico e poplitea.

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Representative Results

Identificazione e localizzazione delle adiposo sottocutaneo inguinale, interscapolare adiposo bruno, viscerale adiposo epididimale (figura 1), nonché la aortico adiposo perivascolare arco, toracica adiposo aortica, suprarenal adiposo aortica e dell'aorta infrarenale adiposo (Figura 2) è stata ottenuta con successo usando il metodo chirurgico descritto. L'esame istologico e la differenziazione tra i campioni BAT e Wat sono stati positivamente valutati usando ematossilina e eosina (H & E) colorazione (Figura 3). Analisi dei livelli di RNA di adiponectina (AdipoQ), perossisomi recettore gamma attivato dal proliferatore (PPAR-γ), cellule morte che induce DFFA come attuatore un (CIDEA), ed altri grassi di marcatori specifici sono stati misurati per tutti i depositi isolati e asportati sopra (dati non mostrati).

Linee cellulari primarie di adipociti sottocutanei e adipociti perivascolari sono state coltivate e differenziate da preadipocyte s di adipociti con successo per l'analisi microarray. I preadipociti coltura convertiti in adipociti sono stati confermati con Oil Red O colorazione (Figura 4). Successful isolamento, la cultura e la differenziazione degli adipociti è stato raggiunto per l'utilizzo in studi in vitro, e l'attività della proteina è stata misurata correttamente. L'attività enzimatica della matrice metaloprotease-2 (MMP2) è stata misurata in un gruppo di trattamento rispetto al controllo. L'attività di MMP2 è stata misurata in situ in una linea adipociti perivascolare primaria tramite zimografia (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. sedi anatomiche di C57BL / 6 maschi depositi adiposi del mouse. (A) Interscapular marrone adiposo deposito di grasso. (B) depot grasso adiposo sottocutaneo inguinale. (C) epididymal viscerale deposito grasso adiposo.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. sedi anatomiche di depositi PVAT in un topo C57BL / 6 di sesso maschile. (A) aortico deposito adiposo perivascolare arch. (B) depot adiposo perivascolare dell'aorta toracica. (C) depot adiposo perivascolare aortica surrenale. (D) depot adiposo perivascolare aortica infrarenale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. H & E colorazione di BAT e WAT adiposo. (A) H 8; E colorazione di paraformaldeide fisso, paraffina C57BL / 6 campione maschile del mouse di WAT adiposo con un ingrandimento 40X (B) H & E colorazione di paraformaldeide fisso, paraffina C57BL embedded / 6 campioni topo maschio di BAT con un ingrandimento di 40X.. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Oil Red O colorazione di preadipocytes PVAT coltivate e adipociti. (A) Oil Red O colorazione della coltura preadipocytes perivascolari aortico al basale di differenziazione a 20X di ingrandimento con contrasto di fase. (B) Oil Red O colorazione della coltura adipociti perivascolari aortica dopo 5 giorni di differenziazione a 20X di ingrandimento con contrasto di fase.es / ftp_upload / 52.174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. zimografia di adipociti differenziati, isolati dal tessuto adiposo perivascolare, ha dimostrato una ridotta attività di MMP2 rilasciato dopo il trattamento rispetto al controllo (cellule non trattate), * P <0,01 rispetto al controllo.

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Discussion

L'obesità può portare a una grande serie di morbilità e la piena comprensione del ruolo che svolge adiposo non è pienamente compreso; ricerca pertanto continuato nel campo della adiposo è necessaria. I modelli animali, in particolare i modelli murini sono ideali per la ricerca iniziale nella progressione delle malattie e la sperimentazione di potenziali trattamenti farmaceutici. Utilizzando questi modelli, isolamento precisa e escissione di depositi adiposi è uno strumento estremamente importante e necessario nello studio della patologia di malattie adipose colpiti.

In letteratura riguardante depositi adiposi, vi è una quantità sostanziale di letteratura sul comportamento metabolico e variazione tra depositi adiposi, così come le loro sedi anatomiche. Tuttavia, ci sono pochi che forniscono un metodo di approfondimento su come localizzare in particolare, di identificare e isolare questi depositi. Sulla base della revisione delle attuali metodi di isolamento di adiposo, c'è un piccolo sottoinsieme di protocolli tcappello forniscono metodologia su come isolare uno o due depositi alla volta. Tuttavia, una tecnica precisa che permette l'isolamento di più depositi con una quantità minima di dissezione e la contaminazione, così come indirizzi diversi metodi di studio i campioni raccolti è caratteristico di questo protocollo 13-14.

In questo metodo, ci sono diversi passaggi che sono di vitale importanza per l'isolamento e la purezza del campione. Pulizia Gli attrezzi, guanti e superfici spesso per eliminare i peli e contaminanti è un passo indispensabile per evitare la contaminazione deposito. Quando si taglia trasversalmente la pelle attorno alla circonferenza del mouse per esporre il peritoneo per degloving, è indispensabile per evitare di tagliare troppo profondamente. Taglio del peritoneo renderà degloving molto difficile e si alza il potenziale di contaminazione del campione. Quando asportare i depositi adiposi SQ è fondamentale individuare i limiti triangolari del deposito prima di asportare qualsiasi dell'annuncioipose. Inoltre, i tagli dovrebbero essere attenti ad evitare il muscolo, e adiacente vasi, ghiandole e adiposo. Ciò impedirà la contaminazione del campione dalla adiposo alternate, tessuto ghiandolare, muscolare o sangue.

La limitazione principale all'isolamento e asportazione di depositi adiposi, in questo metodo e altri metodi equivalenti possono essere trovate nella definizione dei confini di alcuni depositi. Grazie ai confini mal definiti in depositi, come i depositi sottocutanei, isolamento manca una piccola quantità di contaminazione da adiposo vicina può essere difficile. Un'altra limitazione può essere trovato nel garantire abbastanza tessuto viene raccolto per la sperimentazione supplementare in vascolari associate depositi. Questa limitazione volte richiede pool di campioni, anche se questo dipende dal sito di isolamento e la dieta associata con l'animale.

Dopo i depositi adiposi sono isolati, essi possono essere utilizzati per una varietà di saggi. Il adiposo può essere usod per studi molecolari, come espressione della proteina, l'attività enzimatica e analisi di espressione genica. Inoltre, si può isolare adipociti per linea cellulare primario in studi in vitro. Immortalizzate linee cellulari possono essere utilizzati anche per studi in vitro, ma non sono cellule immortali credibile quanto linee primarie di cellule isolate. Infine, il adiposo può essere fisso o congelato in OCT per esame istologico per identificare l'infiltrazione leucocitaria, localizzazione delle proteine, nonché caratterizzazione di adipociti morfologia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

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References

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