Lokalisering, Identifiering och Excision av murina Fett Depåer

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

På grund av den drastiska och negativa samband mellan fetma och andra sjukdomstillstånd, forskning om vilken roll fett spelar i sjukdom och hälsa är motiverad. Vi presenterar ett protokoll för isolering och excision av fettdepåer som möjliggör studier av fett med in situ och in vitrometoder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J. Vis. Exp. (94), e52174, doi:10.3791/52174 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Fett gjorde en anmärkningsvärd utseende i media, på grund av fetma dramatiska ökning under de senaste decennierna av 20-talet. Fetma drabbar idag mer än en tredjedel av de vuxna och 17% av barn och ungdomar i USA (US) 1. Spänner alla etniska grupper, har statistisk forskning kring fetmaepidemin visat att icke-spansktalande svarta har den högsta åldersjusterade fetman (49,5%) jämfört med mexikanska amerikaner (40,4%), alla Hispanics (39,1%) och icke- Hispanic vita (34,3%) 2. Den ekonomiska effekten av fetma är också ett växande problem för sjukvården. År 2012 uppskattades det att den årliga medicinska kostnaderna för vård för fetma i USA under 2005 var $ 190.200.000.000, nästan 21% av den totala budgeten medicinska utgifter. Tyvärr var barnfetma uppskattas vara ansvarig för 14 miljarder dollar i direkta sjukvårdskostnader ensam. Statist, bestämdes det att den genomsnittliga medicinska kostnaderna förindivider med fetma var $ 2741 högre per år än de utan denna sjuklighet 3-5.

Fetma är en stor riskfaktor för en rad olika tillstånd såsom: typ 2-diabetes, höga blodfetter, hjärt-kärlsjukdomar, cancer, muskel- och skelettsjukdomar och kronisk inflammation. Fetma är djupt knuten till patogenesen av metabola syndromet och andra kroniska sjukdomar 6-8. Med sådana drastiska och negativa kopplingar mellan fetma och andra sjukdomstillstånd, har vetenskaplig forskning fokuserad uppmärksamhet för att bättre förstå den pågående epidemin och de olika och avgörande roller spelas av fett.

Historiskt var fettvävnad anses oviktiga och sågs bara som en enkel fyllning vävnad. För närvarande har fett visats spela många viktiga roller i kroppens funktion i: ämnesomsättning, hormonreglering, inflammation, skydd och isolering 9. Fettvävnad består främst avadipocyter men innehåller också pericyter, endotelceller, monocyter, makrofager och pluripotenta stamceller 8. Fettvävnad distribueras i hela kroppen i olika depåer. De huvudsakliga depåer kan hittas subdermalt, subkutant, intramuskulärt, och viscerally 10. Fett depåer har visats ha depå specifika metaboliska profiler, som har visat en depå specifik känslighet för fetma och relaterade sjukdomar 8.

Traditionellt har fettvävnad klassificerats i två huvudtyper: vit fettvävnad (WAT) och brun fettvävnad (BAT); även nyare litteratur indikerar närvaro av en tredje grupp döpte brite eller beige fett 11. Fettvävnad har visat sig ha olika färger, morfologier, metaboliska funktioner, biokemiska egenskaper och genetiska uttrycksmönster 10. Adipocyter i WAT har en enda, stor lipiddroppe och varierande mängder mitokondrier. WATär dominant finns i subkutana och viscerala orter i kroppen. WAT fungerar främst som ett område av energilagring och skyddsorgan. Adipocyter i BAT har en multilocular morfologi och rikliga mitokondrier. BAT ligger främst i nacken och stora blodkärlen i bröstkorgen, liksom scapulae 12. BAT fungerar främst inom energi spilla beteenden som reglerar thermogenesis 7. Brite eller beige fett har visat sig dela en analog morfologi och uttryck till BAT men har visat sig vara härstammar från vita adipocyter 11.

Den beskrivna kirurgisk metod i detta manuskript ger forskarna med kapacitet att analysera olika effekter att faktorer som: miljö, läkemedel och genetik, har på fett; samt den gynnsamma eller skadliga roll adipose spelar i sjukdom och hälsa. Dessutom, för att tillhandahålla ett sätt att identifiera och isolera olika typer av fettvävnad tillmöjliggöra bättre förstå de biokemiska relationer och skillnader mellan depåer. Detta kan hjälpa till att bestämma sambandet mellan plats, funktion, och olika typer av fett i kroppen. Denna beskrivna metod åstadkommer detta genom att tillhandahålla organ för grov visualisering, genuttrycksanalys, proteinexpressionsanalys, histologisk undersökning, och isolering av primära celllinjer för in vitro-studier. För närvarande finns det många artiklar som ger insikt i det metabola beteende olika fettdepåer, samt deras anatomiska platser; men ger inte en djupgående metod för att specifikt lokalisera, identifiera och isolera dessa depåer. Denna kirurgisk metod ger en exakt teknik som möjliggör isolering av flera depåer med en minimal mängd dissekering och föroreningar jämfört med andra metoder avsedda för isolat av en eller två depåer 13-14.

Målet med detta protokoll är att geen exakt metod för identifiering och isolering av olika typer av fettdepåer från flera anatomiska ställen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati och i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur från National Institutes of Health (NIH publikation Inga . 85-23, reviderad 1996).

1. Euthanize och Sterilisera Mouse

  1. Placera musen i en fördelningsväxellåda innehållande en supratheraputic dos av isofluran och tillåta att inhalera till verkan. När musen avlivas, ta bort från lådan.
  2. Cervically rubba som ett andra medel för dödshjälp.
  3. Sterilisera den yttre ytan av musen genom rensning djuret med 70% etanol.

2. Identifiering och isolering av tre olika Fett Depåer

  1. Brun fettvävnad (BAT) Isolering:
    1. Se till att pälsen är våt från alkohol rensning för att hjälpa till att skära genom epidermal och dermal Layers.
    2. Placera musen i ryggläge med ryggen mot bordet.
    3. Ta huden strax under membranet med pincett, hiss och incisionsfilm med sax.
    4. Skär tvären runt omkretsen av musen för att exponera bukhinnan.
    5. Avslöja fjärilen formade BAT depå genom degloving den övre halvan av musen. Håll nedre bihang och mage i ena handen och dra huden upp mot huvudet.
    6. Rikta musen, så att den är placerad benägna på bordet. Var noga med att inte förorena exponerade depå med hår.
    7. Rengör kirurgiska instrument och byt till ett nytt par handskar.
    8. Leta reda på scapulae och motsvarande depå. Ta försiktigt bort eventuella ytliga vita fett ovanpå fjärilen och sedan dissekera fjärilen av interscapular brunt fett. Var noga med att undvika muskeln nära knutna till brunt fett.
      OBS: Användning av en dissektion mikroskop rekommenderas för avlägsnande av white adipös, liksom vid separation av den bruna adipose från scapulae.
    9. Avlägsna fett depå och överför till en 2 ml mikrocentrifugrör.
    10. Om RNA eller protein ska extraheras, frysa vävnaden genom nedsänkning i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Frys provet på en gång för att förhindra nedbrytning. Om odling, täcka vävnaden i DMEF-12 och ligger på is tills alla prover samlas in för kultur (kompletterande information).
  2. Isolering av subkutan fettvävnad (SQ), en vit fettvävnad Depot (WAT):
    1. Sätt på ett nytt par handskar för att inte kors förorena mellan fettdepåer.
    2. Reveal inguinal, triangulära SQ depåer av DE-handskar den nedre halvan av musen. Håll de övre bihang och thorax i ena handen och dra huden ner mot fötterna med den andra handen.
    3. Orientera musen i ryggläge och samtidigt vara noga med att inte förorena exponerade depå med hår.
    4. Ren surgical instrument och förändring till ett nytt par handskar.
    5. Försiktigt dissekera trianglarna i SQ fett. Var noga med att inte kontaminera provet med muskler, grann fett, mjölkkörtlar eller genom att skära några fartyg och förorena provet med blod.
      OBS: Användning av en dissektion mikroskop rekommenderas om gränser inte är tydligt definierade.
    6. Ta bort fettdepåer och överföra till 2 ml mikrocentrifugrör.
    7. Om RNA eller protein ska extraheras, frysa vävnaden genom nedsänkning i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Frys provet på en gång för att förhindra nedbrytning.
    8. För färgning, fixa eller bädda in i oktober Om odling, täcka vävnaden i DMEF-12 och ligger på is tills alla prover samlas in för kultur (kompletterande information).
  3. Isolering av gonadal Fat en visceral fettvävnad (moms) och Vit fettvävnad (WAT) Depot:
    1. Sätt på ett nytt par handskar för att inte kors förorena mellan fettdepåer.
    2. Med scissors, skär bukhinnan tvären, direkt under membranet. Skär bukhinnan från membranet till rektum mitten koronalt att exponera bukorganen.
    3. Leta testiklarna eller äggstockar och identifiera den bifogade vita fettvävnad, känd som epididymal adipose hos män eller gonadal adipose hos kvinnor.
    4. Rengör kirurgiska instrument och förändring till ett nytt par handskar
    5. Försiktigt dissekera båda epididymala fettdepåer från testiklarna, bitestiklar och vasa deferentia. Eller om kvinnlig, försiktigt dissekera båda gonadala fettkuddar från äggstockarna.
    6. Ta bort fettdepåer och överföra dem till 2 ml mikrocentrifugrör.
    7. Om RNA eller protein ska extraheras, frysa vävnaden genom nedsänkning i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Frys provet på en gång för att förhindra nedbrytning.
    8. För färgning, fixa eller bädda in i oktober Om odling, täcka vävnaden i DMEF-12 och ligger på is tills alla prover samlas in för kultur (kompletterande information).

    3. Isolering av perivaskulär fettvävnad (PVAT)

    1. Isolering av Heart:
      1. Placera musen i ryggläge med övre och nedre bihang förlängda utåt.
      2. Säkert bihang använder kirurgtejp.
      3. Efter att placera musen enligt ovan, skapar spänningar genom att lyfta upp xiphoid processen med pincett. Skär horisontellt genom membranet, exponera den nedre delen av brösthålan.
      4. Under upprätthållande spänningar, genom att lyfta upp xiphoid processen, skär genom bröstkorgen superiorly mot huvudet, precis vid sidan av bröstbenet.
      5. Plocka upp bröstkorgen bara underlägsen den nyckelbenet, och skär längs den underlägsna längden av nyckelbenet ut mot armhålan i båda riktningarna. Brösthålan och dess innehåll (hjärta, lungor, etc.) ska nu synas tydligt.
      6. Rengör brösthålan av främmande blod och vätska genom att använda sterila gaUze att absorbera vätskan. Om samla organ eller kärl ska du ymnig (kompletterande information).
      7. När området är rensad på vätska, skär bronkerna och förenade kärl för att avlägsna lungorna, möjliggör bättre exponering av hjärtat.
    2. Lokalisering och Excision av Aorta perivaskulär fettvävnad (PVAT):
      1. Ta följande organ att bättre identifiera de underlägsna delar av aorta: lever, mage, mjälte, bukspottkörtel, tarmar och kolon.
      2. Första start med identifiering av magen och matstrupen. Skär matstrupen vid gastro-esophageal junction att befria magen från kroppen.
      3. Nästa, identifiera tarmarna och den omgivande tarmkäx. Skär ytligt genom tarmkäxet, eftersom det ligger mycket nära till njur delen av aortan, sedan "kör tarmen."
      4. Skär kolon frigöra så nära rektum som möjligt. Således, vilket frigör magen, tarmen och kolon från musen.
      5. Reflytta mage, tarm, kolon, pankreas och mjälte genom att skära genom fäst tarmkäx och fartyg. Bukspottkörteln och mjälten bör komma fri med magen, tarmen och kolon.
      6. Ta levern genom att skära igenom lever venerna och fästa tarmkäx, ta bort alla lober.
      7. Skär bort den viscerala lagret och fett omger njurarna. Lämna njurarna anslutna till aortan in vivo för att tjäna som geografiska markörer för olika segment av aorta.
      8. Skölj området med steril 1x PBS och ta bort all vätska genom absorption med en steril gasbinda.
      9. Använda mikro-sax och mikro pincett, separera aorta från dess rygg infästning i ryggraden och dess ventrala infästning i matstrupen.
      10. Isolera aorta genom att följa och demontering aortan längden av den nedåtgående aorta från origo i hjärtat till bifurkationen i höftområdet.
      11. Identifiera och isolera subclavia kärlen. Isolera dessa fartygfrån halsen till aortaroten för att bättre exponera aorta korsningen och rot i hjärtat.
      12. Avlägsna tymus sedan klippa den brachiocephalic artären, den vänstra gemensamma halspulsådern, och den vänstra nyckelbensartären, som tillåter rörelse av hjärtat.
      13. Med hjälp av en dissektion mikroskop, visa perivaskulära fettvävnad (PVAT) skikt som omger aorta.
      14. Med stor omsorg för att inte klämma eller pressa PVAT, försiktigt dra PVAT vägen från aorta med mikro pincett. Skär försiktigt infästningen av PVAT till aortan med mikro-sax startar vid thoraxregionen strax överlägsen där membranet är beläget.
        OBS: En dissektion mikroskop rekommenderas.
      15. Upprepa denna process hela längden av aortan, med avslutning vid den infrarenala aortaregionen, som ligger strax överlägsen höftbifurkationen av aortakärlet.
      16. Om aortabågen PVAT önskas, används samma metod för att ta bort PVAT från den mindre curvature av bågen.
      17. Placera PVAT prover i 2 ml mikrocentrifugrör (er).
      18. Om RNA eller protein ska extraheras, frysa vävnaden genom nedsänkning i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Frys provet på en gång för att förhindra nedbrytning. Om odling, täcka vävnaden i DMEF-12 och ligger på is tills alla prover samlas in för kultur (kompletterande information).
        OBS: Ytterligare fettdepåer för att överväga om intresserade av en omfattande fettdepå analys inkluderar: retroperitoneal, mesenteriska, omental, perikardiell och Poplietallymfknutor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifiering och lokalisering av inguinal subkutan fettvävnad, interscapular brunt fett, visceral epididymal fett (figur 1), samt aortabågen perivaskulära fett, bröstkorg aorta fett, suprarenala aorta fett och infrarenala aortafett (Figur 2) uppnåddes framgångsrikt använder den beskrivna kirurgiska metoden. Histologisk undersökning och differentiering mellan BAT och WAT prover bedömdes positivt med hjälp hematoxylin och eosin (H & E) färgning (Figur 3). Analys av RNA-nivåer av adiponectin (AdipoQ), peroxisomproliferator-activated gamma (PPAR-γ), celldöd framkallande DFFA liknande effektor en (CIDEA), och annat fett specifika markörer mättes för alla ovanstående isolerade och utskurna depåer (data visas ej).

Primära cellinjer av subkutana adipocyter och perivaskulära adipocyter odlades och differentierad från preadipocyt s till adipocyter framgångsrikt för microarray analys. De odlade preadipocyter konverteras till adipocyter bekräftades med Oil Red O färgning (Figur 4). Framgångsrik isolering, kultur och differentiering av adipocyter uppnåddes för användning i in vitro-studier och proteinaktivitet framgångsrikt uppmättes. Enzymatisk aktivitet hos matris metaloprotease-2 (MMP2) mättes i en behandlingsgrupp i jämförelse med kontrollen. Aktiviteten av MMP2 mättes in situ i en primär perivaskulär adipocyt ledning via zymografi (Figur 5).

Figur 1
Figur 1. Anatomiska platser av C57BL / 6 manliga musen fettdepåer. (A) interscapular brunt fett fettdepå. (B) Inguinal subkutant fett fett depå. (C) Visceral epididymal fett fettdepå.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Anatomiska platser av PVAT depåer i en C57BL / 6 hanmus. (A) aortabågen perivaskulära fettdepå. (B) Thoracic aorta perivaskulära fettdepå. (C) suprarenala aorta perivaskulära fettdepå. (D) infrarenala aorta perivaskulära fettdepå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. H & E färgning av BAT och WAT fett. (A) H 8; E färgning av paraformaldehyd fast, paraffin inbäddad C57BL / 6 hanmus prov WAT fett vid en 40X förstoring (B) H & E färgning av paraformaldehyd fast, paraffin inbäddad C57BL / 6 hanmus prov av BAT vid 40X förstoring.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Olje Red O färgning av odlade PVAT preadipocyter och adipocyter. (A) Olje Red O färgning av odlade aorta perivaskulära preadipocyter vid baslinjen av differentiering vid 20X förstoring med faskontrast. (B) Oil Red O färgning av odlade aorta perivaskulära adipocyter efter 5 dagar av differentiering vid 20X förstoring med faskontrast.es / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. zymografi differentierade adipocyter isolerade från perivaskulära fettvävnad, visade en minskad aktivitet av MMP2 släpptes efter behandling jämfört med obehandlade (kontroll) celler, * P <0,01 jämfört med kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fetma kan leda till en stor mängd morbiditeter och full förståelse för den roll som fett spelar är inte helt klar; därför fortsatt forskning inom området fett är nödvändigt. Djurmodeller, speciellt musmodeller är idealiska för inledande forskning i utvecklingen av sjukdomar och testning av potentiella läkemedelsbehandlingar. Vid användning av dessa modeller är exakt isolering och excision av fettdepåer ett oerhört viktigt och nödvändigt verktyg i studiet av patologi adipösa drabbade sjukdomar.

I aktuell litteratur angående fettdepåer, finns det en betydande mängd litteratur rörande metabolisk beteende och variation mellan fettdepåer, samt deras anatomiska platser. Men det är få som ger en fördjupad metod för att specifikt lokalisera, identifiera och isolera dessa depåer. Utifrån granskningen av aktuella isoleringsmetoder fett, det finns en liten delmängd av protokoll thatt ger metodik om hur man isolerar en eller två depåer i taget. Dock är en exakt teknik som möjliggör isolering av flera depåer med en minimal mängd dissekering och föroreningar samt adresser olika metoder för att studera de insamlade proverna utmärkande för detta protokoll 13-14.

Inom denna metod, det finns flera steg som är oerhört viktigt att isoleringen och renheten hos provet. Rengöring verktyg, handskar och ytor ofta för att ta bort hår och föroreningar är ett viktigt steg för att undvika depå kontamination. När du skär huden tvären runt omkretsen av musen för att exponera bukhinnan för degloving, är det viktigt att undvika att skära för djupt. Cutting bukhinnan gör degloving mycket svår och kommer att höja potentialen för kontaminering av provet. När skära av SQ fettdepåer är det viktigt att identifiera de triangulära gränser depån innan skära någon av annonsenipose. Dessutom bör noggranna nedskärningar göras för att undvika muskel, och intill fartyg, körtlar och fett. Detta kommer att förhindra kontaminering av provet från alternativa fett, körtelvävnad, muskler eller blod.

Den största begränsningen till isolering och excision av fettdepåer, i denna metod och andra jämförbara metoder kan hittas i definiera av gränserna för vissa depåer. På grund av de dåligt definierade gränser i depåer, såsom subkutana depåer, kan isolering saknar en liten mängd förorening från angränsande fett vara utmanande. En annan begränsning kan hittas för att säkerställa tillräckligt med vävnad samlas för kompletterande experiment i vaskulära associerade depåer. Denna begränsning kräver ibland sammanslagning av prover, även om detta är beroende av platsen för isolering och dieten förknippad med djuret.

Efter de fettdepåer är isolerade, kan de användas för en mängd olika analyser. Den adipos kan användasd för molekylära studier såsom proteinuttryck, enzymaktivitet och genuttryck analys. Dessutom kan en isolera adipocyter för primär cellinje in vitro studier. Immortaliserade cellinjer kan också användas för in vitro-studier, men odödliga celler är inte lika trovärdiga som primära isolerade cellinjer. Slutligen kan fett vara fast eller frysas i OCT för histologisk undersökning för att finna leukocytinfiltration, protein lokalisering, samt karakterisering av adipocyt morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% Ethanol Fisher 07-678-001
DMEF-12 Sigma Aldrich D-6421 Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes Midsci MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
  2. Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010. 307, (5), 491-497 (2012).
  3. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical care costs of obesity: an instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31, (1), 219-230 (2012).
  4. Obesity accounts for 21 percent of U.S. health care costs, study finds. Cornell University. Available from: http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm (2012).
  5. Marder, W., Chang, S. Childhood Obesity: Costs, Treatment Patterns, Disparities in Care, and Prevalent Medical Conditions. Thomson Medstat Research Brief. (2006).
  6. Cortez, M., Carmo, L. S., Rogero, M. M., Borelli, P., Fock, R. A. A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells. Inflammation. 36, (2), 379-386 (2013).
  7. Sanchez-Gurmaches, J., Hung, C. M., Sparks, C. A., Tang, Y., Li, H., Guertin, D. A. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metab. 16, (3), 348-362 (2012).
  8. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res. 48, (6), 1253-1262 (2007).
  9. Aarsland, A., Chinkes, D., Wolfe, R. R. Hepatic and whole-body fat synthesis in humans during carbohydrate overfeeding. Am J Clin Nutr. 65, (6), 1774-1782 (1997).
  10. Park, A., Kim, W. K., Bae, K. H. Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells. World J. Stem Cells. 6, (1), 33-42 (2014).
  11. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and. 150, (2), 366-376 (2012).
  12. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, (9), 2992-3000 (2013).
  13. Casteilla, L., Pénicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).
  14. Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity. Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics