Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Published 6/02/2015
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Medicine

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Summary

Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) es un método de acondicionamiento de tejidos contra el estrés perjudicial. Hemos establecido un método de isquemia a distancia hacia la extremidad posterior, inflando un manguito del esfigmomanómetro durante 5-10 minutos. Las capacidades neuroprotectoras de RIP se han demostrado en un modelo de degeneración de la retina en los roedores.

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Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

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Abstract

Isquemia subletal protege los tejidos contra la posterior isquemia, más severa a través de la regulación positiva de mecanismos endógenos en el tejido afectado. Isquemia subletal también se ha demostrado que upregulate mecanismos de protección en los tejidos remotos. Un breve período de isquemia (5-10 min) en la extremidad posterior de mamíferos induce respuestas de autoprotección en el cerebro, los pulmones, el corazón y la retina. El efecto es conocido como el precondicionamiento isquémico remoto (RIP). Es una manera terapéuticamente prometedor de proteger órganos vitales, y ya está en ensayos clínicos para lesiones del corazón y el cerebro. Esta publicación muestra un método controlado, mínimamente invasivo de hacer una extremidad - específicamente la extremidad posterior de una rata - isquémica. Un manguito de presión arterial desarrollado para su uso en neonatos humanos está conectada a un esfigmomanómetro manual y utiliza para aplicar presión 160 mmHg alrededor de la parte superior de la extremidad posterior. Una sonda diseñada para detectar la temperatura de la piel se utiliza para verificar la ischemiuna, mediante el registro de la caída de la temperatura de la piel causado por la oclusión inducida por la presión de las arterias de las piernas, y el aumento de temperatura que sigue a la liberación del manguito. Este método de RIP protege a la retina de ratas contra el daño inducido por la luz brillante y la degeneración.

Introduction

La supervivencia de la mayoría, tal vez todos, los tejidos de la cara de estrés metabólico puede ser mejorada por el condicionamiento previo con un período de isquemia subletal 1,2. El precondicionamiento isquémico (IP) en términos prácticos es la exposición del tejido a la isquemia subletal, antes de las experiencias de tejido factores estresantes más graves, tales como un insulto isquémico posterior. En modelos animales, IP proporciona protección sorprendente con el cerebro, la retina, el corazón y los pulmones 3-6. En consecuencia, las observaciones en pacientes con accidente cerebrovascular mostraron un vínculo entre los ataques isquémicos transitorios anteriores y mejores resultados clínicos 7,8. IP también protege los fotorreceptores de la retina de lesiones no isquémicas 9.

La eficacia de la PI en diversos tejidos y lesiones sugiere que está activando un mecanismo innato de la supervivencia celular presente en todos los tejidos. El precondicionamiento isquémico de miocardio se ha sugerido que tiene efectos protectores a través de la regulación al alzadel factor inducible por hipoxia (HIF), conocido para regular las diferentes vías metabólicas a través de la liberación de adenosina o mediante la apertura de canales de potasio ATP mitocondrial 10,11. Canales de liberación de adenosina y el ATP de potasio están implicados en la isquemia cerebral, pero, las investigaciones sobre los mecanismos neuroprotectores de condicionamiento isquémico hasta la fecha se han centrado en las modificaciones de anti-excitotoxicidad, vías anti-apoptóticos y anti-inflamatorios 12,13. En general, la comprensión del proceso molecular de acondicionamiento isquémico para la protección de las neuronas es limitado.

Intentos precondicionamiento isquémico remoto para acondicionar distantes órganos críticamente importantes (corazón, cerebro, pulmón) por generar isquemia en los tejidos menos críticas. Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) usando la extremidad posterior ha demostrado ser neuroprotector en modelos de roedores de accidente cerebrovascular 14-17. El método descrito por nosotros proporciona un prot simple, fiable y no invasivoocol para inducir RIP.

La gran mayoría de protocolos RIP implica la extremidad posterior, presumiblemente debido a la arteria femoral situada en la extremidad posterior superior se puede identificar fácilmente y se accede para la sujeción quirúrgica y la aplicación del torniquete. En las extremidades isquémicas invasiva estudios para el estudio de cerebro y protección de la piel, la isquemia se indujo mediante la separación de la arteria femoral de la ingle y los ligamentos pinzamiento de la arteria femoral 2,15,18.

La isquemia resultante de cualquiera extremidad manguitos de sujeción o femoral de la arteria ha sido confirmado por los cambios en la extremidad incluyendo una pérdida de pulso, disminución en la oxigenación y una caída en la temperatura de la piel. Isquemia a distancia puede ser confirmado por la pérdida de pulso utilizando Doppler láser o ultrasonido Doppler 17-19. Temperatura de la piel se puede utilizar como alternativa a Doppler aunque la relación no es lineal 20,21. Grabaciones precisas de temperatura son comunes en los laboratorios y lataser fácilmente incorporados en los estudios isquémicas remotas.

Una alternativa a la cirugía de fijación femoral es la inducción de isquemia usando un torniquete. Aplicación del torniquete produce isquemia comparable al conseguido con sujeción buque; Kutchner et al. comparación de la arteria femoral invasiva de sujeción para un torniquete no invasivo y encontraron ambos métodos detuvieron el flujo sanguíneo a la extremidad y daño de la piel reducido en un modelo de cirugía plástica de la isquemia colgajo de piel 18. Manguitos ya sea la pierna o el brazo y el aumento de la presión del manguito a encima de la presión arterial sistólica se ha encontrado para ser protector contra el daño isquémico en cerdos y seres humanos 17,19,22.

Different torniquete se acerca a inducir remoto incluye isquémica el uso de un manguito de presión arterial o un 17,22,23 banda elástica. Sin embargo, el uso de una banda elástica para inducir isquemia es un método inseguro, potencialmente dando lugar a una cantidad no regulada de presión en elextremidad, con aumentos de presión por encima de 500 mmHg siendo grabado en los seres humanos 24. Además, isquemia de las extremidades usando una banda elástica conduce a daño muscular en ratas después de la eliminación de la banda 23, según la evaluación de colorante azul de Evans, un marcador in vivo de la permeabilidad de miofibras 25. En contraste, la entrega de una presión controlada para el torniquete se puede lograr utilizando un manguito de presión arterial conectado a un 17,19,22,26 esfigmomanómetro.

En este estudio, se utilizó un modelo de lesión de luz de degeneración de los fotorreceptores para demostrar la eficacia neuroprotectora de precondicionamiento isquémico remoto. Isquemia a distancia se indujo inmediatamente antes de la lesión luz, evitando la posterior degeneración de los fotorreceptores según lo confirmado por las pruebas de la función retiniana. El video que acompaña demostrará la aplicación de isquemia a distancia no invasiva.

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Protocol

Declaración de Ética: El protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney, AEC # 5657. La anestesia fue aprobado por el comité de ética animal (Universidad de Sydney, AEC # 5657).

1. Preparación del equipo

  1. Utilice el seguimiento de la temperatura de la piel en tiempo real. Encienda el ordenador, y el hardware de adquisición de datos.
  2. Software de registro de la temperatura Abrir y ajustar el ajuste de temperatura de entre 30 a 35 ° C y la frecuencia de muestreo de cada 100 ms.
  3. Opcional: Inserte el termómetro rectal para garantizar la temperatura central se mantiene estable en 37,5 ° C.

2. La calibración del esfigmomanómetro manual

  1. Conecte brazalete neonatal a sphygmomanometer.Use un manguito de tamaño 2 de 250 a 550 g de rata. Un adaptador puede ser necesario conectar el tubo del manguito de esfigmomanómetro.
  2. Desinflar el manguito por cualquiera de aflojar la válvula de escape de aire o desconectar el tubo del manguito de la adaptacióno. Asegurar ninguna presión permanece en el tubo y la aguja del manómetro se apoya en cero dentro del óvalo / rectángulo.
  3. Compruebe la presión entre la tubería, manómetro y brazalete. Inflar el manguito con bombas suaves de la bombilla de la inflación hasta que lea 100 mmHg en el manómetro. Asegúrese de que la presión se mantiene constante. Desinflar el manguito abriendo lentamente el valor de liberación de aire.

3. Preparación Animal

Nota: Los animales que han de someterse a una lesión luz requerir adaptación oscura la noche antes de la isquemia a distancia. Animales sometidos a daño de la luz requieren cría (12 h de luz: oscuridad ciclo (5 lux)) oscuro

  1. Realizar isquemia a distancia, ya sea en roedores despiertos o anestesiados. Asegúrese de que los animales tienen un tono muscular saludable. Asegurar esta pellizcando la extremidad posterior superior para confirmar que no es adecuada presente muscular. Protección RIP inducida por la luz contra la lesión ha sido probado en ratas sedentarias hasta 6 meses de edad.
  2. Preparación anestesiado para RIP
    1. Inyectar las ratas con una inyección intraperitoneal de 60 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina. Comprobar la profundidad de la anestesia mediante la extensión de la pierna y pellizcando la piel en la parte inferior del pie. El animal no tiene reflejo si está profundamente anestesiado. Aplicar las lágrimas artificiales para evitar la sequedad de la córnea mientras bajo anestesia.
    2. Coloque ratas en cualquiera de una almohadilla de calor o circulación tubo calentador de agua para mantener una temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Coloque la rata en la posición prona con almohadillas de las patas de las extremidades inferiores "hacia arriba. O bien la derecha o la izquierda extremidad pueden sufrir isquemia a distancia.
  3. Preparación Awake para RIP
    Nota: Despierta la experimentación animal requiere de dos personas. A una persona le restringe el animal y la segunda persona opera el esfigmomanómetro manual. Los experimentadores deben estar seguros para llevar a cabo el procedimiento como restricción aumenta el riesgo de lesiones a los manipuladores. Las ratas sometidas a isquemia a distancia deben estar condicionadas to la restricción manual. En función de las directrices intuitivas moderación manual debe ser el progreso de 30 segundos a un máximo de 5 minutos durante un número de semanas. Animales tímidos que no logran aclimatarse a la moderación manual tienen que ser excluidos de la experimentación despierto. Por último, la moderación manual es probable que cause estrés (y potencialmente introducir confunde con el estudio) a los animales y una cohorte simulada (colocación de manguito sin inflamación) debe ser utilizado para interpretar con precisión los resultados del estudio de RIP.
    1. Cortar una toalla en un 15 cm x 30-50 cm pieza y colocar el borde corto perpendicular a la espina dorsal de la rata, que cubre la cabeza de la parte superior de las extremidades posteriores.
    2. Meta el borde corto bajo el torso de la rata con fuerza y ​​empezar a envolver la rata con el borde largo restante de toalla. Asegurar el animal envuelto bajo el brazo en una posición supina. Si la rata se lleva a cabo bajo el brazo izquierdo, liberar la extremidad derecha de la rata de la toalla.

O 4. Aplicaciónf Temperatura de la piel de la sonda

  1. Extender la pata de la rata que ha de someterse a la isquemia y colocar la sonda de piel en la almohadilla de la pata. Coloque la sonda de la piel para maximizar el contacto entre la sonda de temperatura y la piel. Empuje firmemente la sonda en la almohadilla plantar y colocar la sonda con cinta de papel.
  2. Compruebe la colocación de la sonda de la piel mediante el seguimiento de la temperatura en el software de registro de la temperatura. Asegúrese de que la temperatura de la piel es de entre 30 a 34 ° C y se mantiene estable. Seguimiento de la temperatura de la piel durante 1-2 minutos. Ajustar la sonda de la piel si la temperatura es inestable o por debajo de 30 ° C.

5. La isquemia a distancia

  1. Desinflar el manguito y asegurar la válvula de presión de aire se cierra. Extienda la pierna y sin apretar rodear el brazalete en la extremidad posterior superior. Utilice el dedo índice y el pulgar para extender la pierna y los dígitos más bajos para mantener el brazalete suelta en su posición.
  2. Elevar la presión del manguito del animal anestesiado a 160 mmHg, y en animales despiertos INCREase la presión del manguito a 180 mmHg.
    Nota: La presión arterial anestesiado de ratas oscila 120-140 mmHg y se eleva a 160 mmHg cuando consciente. Comenzar las grabaciones con temporizador y la temperatura del pie una vez que se alcanza la presión correcta.
    Nota: La temperatura del pie debe caer por 2 ° C después de 5 minutos de presión constante.
  3. Mantener la posición del manguito por encima "rodilla" del animal durante toda la isquemia. Presión del manguito comenzará a bajar después de unos minutos, o si la extremidad de la rata está en movimiento.
  4. Repetidamente bombear la pera de inflado en ráfagas cortas para mantener la presión del manguito deseada corta ráfaga repetitivo de bombeo
  5. Isquemia remoto se puede enviar de forma continua durante entre 5 y 15 min. El protocolo de isquemia reperfusión incluye 2 periodos de 5 min de isquemia con una intervenir 5 min de reperfusión.
  6. Desinflar la presión del manguito aflojando la válvula de presión de aire. Compruebe el cambio de temperatura en el transcurso de la pro isquemiaProtocolo. Suelte el puño.
  7. Continuar con la experimentación lesión. Animales bajo el efecto de la anestesia tendrán que ser colocado sobre una almohadilla de calor. Continuar monitoreando animales hasta ambulatoria. Los animales no pueden ser devueltos a la vivienda hasta caminando.

6. Lesiones Luz - Retina Degeneración Modelo

  1. Oscuro adaptarse a los animales durante la noche (15.12 h). Inmediatamente después de la isquemia acondicionado remoto o isquemia a distancia simulada (contención de los animales) lugar animales en la vivienda de plexiglás con los alimentos y el agua.
  2. Encienda la iluminación fluorescente (1000 lux) situado por encima de plexiglás vivienda a las 9 am durante 24 horas. A raíz de exposición a la luz, devolver los animales a la luz tenue cíclica durante 7 días.

Procedimientos Isquemia 7. Post-remotas

  1. Evaluación Vision con Electrorretinograma (ERG):
    Nota: El ERG configuración y el protocolo de flash siguieron Brandli y la piedra 26.
    1. Oscuro se adaptan los animales durante la noche (12.15 h). Bajotenue iluminación roja anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina (60 mg / kg y 5 mg / kg, respectivamente). Midriática (sulfato de atropina 1,0%), anestesia corneal (proximetacaína 0,5%).
    2. Aplicar la hidratación corneal (Carbomer polímero) gotas para los ojos inmediatamente a la córnea. Aplique el gel del ojo en intervalos de 20 minutos para mantener la hidratación de la córnea.
    3. Dibuja un hilo suelto atada alrededor del globo ocular para ayudar grabaciones ERG estables. Monitorear la temperatura usando una sonda rectal y mantener la temperatura corporal del animal en 37 a 37,5 ° C.
    4. Coloque la cabeza dentro de una esfera de integración Ganzfeld.
      Nota: El Ganzfeld es un estímulo luminoso totalmente programable que ofrece la pizca parpadea uniformes de los LED en el ojo.
    5. Registre el electrorretinograma usando un 4 mm de platino electrodo positivo a medida tocando ligeramente la córnea y un diámetro de 2 mm Ag / AgCl electrodo pellet insertado en la boca. Referencia ambos electrodos a una aguja de acero inoxidableinsertado por vía subcutánea en la grupa.
    6. Señales de registro con ajuste de paso de banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), con una velocidad de adquisición de 2 kHz (Instrumentos AD). Después de que se estableció una grabación estable ERG sujeto al animal a un adaptación a la oscuridad 10 min antes de iniciar las grabaciones.
    7. Siga el protocolo de flash como se describe anteriormente por Brandli y la piedra 26.
      1. Programar la duración del flash (se utilizó flashes 2.1 ms de duración), y establecer su intensidad de -4,4 a 2,0 log scot cd.sm -2. Utilice destellos brillantes (log 2,0 scot cd.sm -2, 1 ms) para medir la función de la retina. En este estudio es la comparación entre el control, lesiones leves y lesiones de luz con RIP.

8. TUNEL ensayo

  1. La eutanasia a los animales mediante inyección intraperitoneal de sobredosis de fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear los ojos y fijar en paraformaldehído al 4%.
  2. Lave los ojos en PBS antes cyroprotectingojos durante la noche en sacarosa al 30% (w / v). Insertar los ojos en compuesto OCT y cortar en 20 micras secciones sagital utilizando un criostato.
  3. Realizar el ensayo TUNEL en secciones de la retina con tinción DAPI siguiendo el protocolo de Maslim et al. 27
  4. Utilice microscopía de fluorescencia para el recuento de TUNEL de la retina. Células TUNEL se registraron a partir de la capa nuclear externa (ONL); la capa más externa de la retina que contiene núcleos fotorreceptoras. En este estudio, los recuentos de TUNEL se realizaron por triplicado para cada ojo, con 5 ojos para cada grupo de tratamiento.
  5. Utilice un modelo lineal al grupo estadístico comparar medios de control, lesiones leves y lesiones + RIP luz ratas.

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Representative Results

Un manguito de presión arterial elevada por encima de 160 mmHg detiene el flujo sanguíneo a la extremidad posterior como se ve claramente en la figura 1B. La falta de oxigenación de los tejidos resultó en una reducción de la temperatura del pie del animal para un protocolo de isquemia-reperfusión (Figura 2). La temperatura del pie (33 ° C) fue menor que la temperatura central y la reducción de forma fiable durante la elevación de presión del manguito (31 ° C) aumentando cuando el brazalete se desinfla (32 ° C). Una sola lesión luz 1000 lux fue entregado en Dim planteado ratas albinas con o sin precondicionamiento isquémico remoto. Función de la retina fue grabado y evaluó mediante el electrorretinograma (ERG).

El ERG es la suma de respuestas eléctricas procedentes de las neuronas interior y exterior de la retina a la estimulación de luz como se muestra en la Figura 3. La forma de onda ERG tiene un pico negativo temprano que surge de la fototransducción (mínimo aproximadamente 10 mseg después de light flash) denomina la onda A y un gran pico positivo de la retina interna (máximo de aproximadamente 80 milisegundos después de la luz del flash) denominan la onda b. El ERG adaptada a la oscuridad de un dim normal de rata criado mostró una gran fotorreceptor y la respuesta retiniana interna a un brillante registro de 2,0 cd.sm -2 flash (Figura 3A). Una semana después de la lesión luz las grabaciones ERG tenían una severa reducción en la amplitud relativa a los controles, lo que refleja la pérdida de fotorreceptores; véase la Figura 3B. Preacondicionamiento la extremidad posterior con isquemia reperfusión utilizando un protocolo de 2 x 5 min inmediatamente antes de la isquemia protege los fotorreceptores de la lesión luz. Las amplitudes RIP ERG fueron mayores que la lesión luz sola, con una ligera reducción de la onda una sede (Figura 3C). Desoxinucleotidil transferasa fin de etiquetado dUTP nick Terminal (TUNEL) de ensayo en secciones crioconservadas de la retina confirmó una reducción de células apoptóticas en los animales de luz dañadas recibir rel RIPanimales de lesiones ligeras ativa a la farsa tratados (Figura 4).

La inducción de isquemia de la extremidad posterior se basa en la correcta colocación del manguito, como se ve en la Figura 1. Un manguito colocado por debajo de la "rodilla" no protege los fotorreceptores de la lesión la luz como se refleja en la reducción de las amplitudes del ERG, véase la Figura 3D.

En conclusión, cuando se administra correctamente isquemia de las extremidades traseras fue capaz de proteger a las neuronas de la retina de una lesión luz.

Figura 1
Figura 1:. Colocación Cuff y el efecto de la presión del manguito por encima de 160 mmHg (a) muestra la extremidad posterior de pies y manos antes de elevación de la presión del manguito. (B) Muestra el pie durante la elevación de la presión del manguito por encima de 160 mmHg. Tenga en cuenta la posición del manguito por encima de la "k nee ". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. La temperatura del pie se reduce durante el inflado del manguito inflado del brazalete en la extremidad posterior de 2 x 5 min a 160 mmHg reducido temperatura de la piel durante la isquemia. (A) muestra la media del grupo de 2 x 5 min pie RIP cambios de temperatura. (B) Muestra una temperatura del pie representante (° C) el seguimiento de 2 x 5 min de isquemia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3:. RIP preserva la función de la retina como se demuestra en el ERG en comparación con ligeros daños ratas La exposición a luz brillante durante 24 hr daños los fotorreceptores de la retina. El ERG mide la salud de la retina interna y externa como una respuesta eléctrica (microvoltios [mV]) a la estimulación de luz. La respuesta normal de la retina a cd.sm registro de 2,0 -2 estimulación de la luz se ve en (A). Daño fotorreceptor de brillantes resultados de luz en una amplitud ERG más pequeño (B). RIP fue capaz de rescatar a los fotorreceptores después de una lesión de luz (C). La colocación del manguito incorrecta durante RIP no protege los fotorreceptores de la lesión (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: TUNEL + celulares cuenta. Un gráfico de barras que compara resultado del grupo de lesiones leves, lesiones + RIP demostrar la reducción de la apoptosis con RIP. TUNEL + células se contaron en todo el lapso de la retina (8.000 m). Panel superior: promedio del grupo de células TUNEL + fueron menores para RIP ratas tratadas (210 ± 4,9, n = 5) en comparación con lesiones leves sola (255 ± 10, n = 5), p <0,01, ANOVA de una vía. Retinas no dañadas (sin lesiones de luz) tenían muy baja (3,0 ± 1,4, n = 5) células apoptóticas. (A) Imagen Representante de luz superior retina lesionada. (B) Imagen Representante de superiores RIP-luz retina lesionada. (C) Imagen Representante de la luz heridos retina inferior. (D) Imagen Representante de RIP-luz de la retina lesionada inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

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Discussion

Roedor extremidad posterior isquemia se indujo con éxito con un esfigmomanómetro manual de la entrega de la neuroprotección y el manguito de los fotorreceptores de la retina. Un hallazgo consistente con isquemia inducida acondicionado protección de los fotorreceptores de una lesión ligera 9,28.

En esencia, la isquemia a distancia hace que la privación breve de oxígeno a los tejidos. Por lo tanto, el precondicionamiento isquémico remoto tiene muchas similitudes con acondicionado isquémica o tolerancia isquémica denominado alternativamente, precondicionamiento hipóxico, y en cierta medida, el ejercicio anaeróbico. Las células responden a desafío isquémica mediante la liberación de una gran variedad de factores de proteínas, nucleósidos y de transcripción que, o bien ofrecen neuroprotección directa o afectar a las células para convertirse en tolerante de estrés metabólico posterior 13.

En la literatura, los protocolos de isquemia a distancia han incluido una serie de duraciones y frecuencias. Nuestro laboratorio ha probado 5, 10,y 2 x 5 protocolos min de isquemia en la función normal de la retina 26. De estos protocolos de 2 x 5 min produjo el mayor cambio de amplitud ERG en ratas normales y fue seleccionado para poner a prueba en un modelo de lesión luz. 5 min eventos isquémicos cortas y repetidas también se han demostrado para ser preventiva en los accidentes cerebrovasculares recurrentes en los seres humanos y para reducir el tamaño del infarto en el accidente cerebrovascular experimental en cerdos 17,22. Sin embargo, la duración más adecuada de precondicionamiento isquémico es probable que sea dependiente en el modelo animal utilizado. Por ejemplo, una reducción en el tamaño del infarto contra la isquemia focal se ha observado en más 2 x 15 min y 3 x 15 min protocolos, pero no en 3 x 5 min protocolos en ratas 15.

También necesita El tiempo entre la propiedad intelectual y la lesión isquémica para ser considerado para la neuroprotección eficaz. Dos ventanas de tiempo se han clasificado para la cardioprotección inducida por IP. Estos son la ventana "condicionamiento clásico", que se produce 0-12 horas después de la propiedad intelectual yla "segunda ventana", que se produce 3-4 días después de IP 29. En un modelo de derrame cerebral focal, RIP resultó ser protectora en múltiples puntos de tiempo, incluyendo los que están fuera de las ventanas clásicas y segunda 15. Sin embargo, ha habido pocos estudios que han comparado los períodos de tiempo de neuroprotección en RIP e IP.

Una consideración adicional para la protección de la isquemia a distancia es el momento del acondicionamiento, incluyendo si se aplica antes de la lesión (preacondicionamiento) o después de una lesión (poscondicionamiento). La mayoría de las pruebas de isquemia a distancia ha utilizado preacondicionamiento pesar fase post haber sido encontrados recientemente estudios para tener un efecto protector de las neuronas de la retina y cerebral 30,31.

En resumen, la inducción de la neuroprotección en la extremidad posterior isquémica acondicionado es específico para el modelo de enfermedad, las especies animales, la duración de la isquemia, y el momento de la isquemia. Una revisión por Kaniora et al. provides más detalles acerca de la variedad de protocolos remotos isquemia, incluyendo las especies, protocolos RIP, RIP sitios, modelos de lesión, resultados de las lesiones y los mecanismos de protección propuestos 32.

El manguito mínimamente invasiva en la extremidad posterior permite RIP tanto despierto y animales siempre que la temperatura corporal se mantiene. En la experimentación anestesiado, la temperatura corporal del animal se debe mantener para evitar la hipotermia. Vigilancia de la temperatura interna evitará que el animal sometido a la hipotermia o hipertermia. La hipotermia y la hipertermia son conocidos estímulos de acondicionamiento previo de ambos modelos de accidente cerebrovascular y lesión luz 33-36. El método JoVE presentado se puede realizar en animales despiertos evitando así confunde la temperatura corporal.

Los anestésicos pueden introducir un conjunto diferente de factores de confusión en la experimentación RIP. El isoflurano puede participar en la protección del miocardio a través de la apertura de la ch de potasio sensibles a ATPAnnels, un mecanismo de protección similares reportados en el condicionamiento isquémico 37. Aunque el tamaño del infarto en los modelos de accidente cerebrovascular sigue siendo grande en animales tratados con placebo dadas isoflurano, el mecanismo molecular subyacente acondicionado isquémico remoto puede estar enmascarado por los efectos de los anestésicos. La ketamina, un antagonista de NMDA, tiene una multitud de efectos protectores in vivo 38, incluyendo el potencial de prevenir la excitotoxicidad a las neuronas, activar la vía de mTOR y liberar BDNF en el suero 39-41. La ketamina se ha informado a mejorar la supervivencia neuronal después de un traumatismo cerebral en los seres humanos y reducir las lesiones luz en fotorreceptores de roedores 42,43. Las investigaciones sobre el mecanismo de condicionamiento isquémico remoto con manguitos de presión arterial despierto evitarán confusiones anestésicos.

Efectiva isquemia de la extremidad posterior se basa en la correcta colocación del manguito, la consistencia de la presión del manguito y la elevación de presión del manguito por encima de systopresión arterial lic como se ve en la figura 1. Un manguito colocado por debajo de la "rodilla" no protege los fotorreceptores de una lesión luz que se refleja en las amplitudes electrorretinograma reducida (ERG). La diferencia en el condicionamiento basado en la posición del manguito es probablemente debido a las diferencias en la masa muscular y la proximidad a la arteria femoral. Además, los animales deben ser estandarizados para la edad, el peso, la temperatura corporal y el género.

En resumen, isquemia a distancia puede ser inducida por un manguito de presión arterial no invasiva, lo que evita la lesión muscular y tiene la flexibilidad para la experimentación despierto o anestesiados. Precondicionamiento isquémico remoto es una estrategia neuroprotectora emergentes y en este protocolo permitirá a más estudios en sus mecanismos y aplicaciones.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

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References

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