瘢痕創傷修復のマウス胎児皮膚モデル

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walmsley, G. G., Hu, M. S., Hong, W. X., Maan, Z. N., Lorenz, H. P., Longaker, M. T. A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair. J. Vis. Exp. (95), e52297, doi:10.3791/52297 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

胎児皮膚創傷は、妊娠後期1まで急速かつscarlessly癒す。胎児の瘢痕創傷修復は、正常な組織構造および機能の再生によって特徴付けられる。瘢痕化の表現型への瘢痕からの移行は、ヒトにおけるマウス2,3における胎生18日(E18)の周りに妊娠後期に起こる。成人と比較して、胎児の創傷修復を迅速上皮、結合組織の堆積、および線維芽細胞の遊走によって特徴付けられる。

多くの研究は、初期の胎児の発達中の瘢痕創傷治癒の現象の可能な説明を提供してきました。炎症は、大人の創傷修復の基本的なコンポーネントです。しかし、胎児の創傷は、急性炎症4の欠如によって特徴づけられる。これは胎児の段階で免疫系の機能的な未熟さの結果であるかどうかは不明なままである。最近の研究では、豊富に違い、マットと示唆urity、およびE18胎児の皮膚対E15における肥満細胞の機能は、少なくともマウス3において、瘢痕の表現型への移行に関与し得る。他の研究では、プロパティと胎児および成人の創傷マクロファージの存在量の違いが胎児の創傷修復5中に、通常の細胞外マトリックス(ECM)の改革のために責任があることを断定。

胎児および成人の発達中の環境要因の違いはまた、創傷の修復に影響する場合があります。 Longakerらは、胎児から創傷液が成人の創傷液6でなしに比べ、ヒアルロン酸刺激活性の高いレベルを持っていることを示した。従って、胎児の創傷環境におけるヒアルロン酸の高いレベル、細胞運動性および増殖につながる微小環境を促進するグリコサミノグリカンは、初期の胎児の発育中に見られる瘢痕の表現型の原因である可能性がある。フェタチーズはその事実に証拠ポイントのその他のラインLの創傷環境は、比較的低酸素および成長因子7に富む無菌羊水中に浸漬される。しかし、決定的な答えは、線維性の修復に瘢痕再生への移行をトリガー胚形成の間の重要なイベントや要因のために提供されていない。

胎児に瘢痕治癒の責任のメカニズムを理解することは、正確で再現性のあるモデルを必要とする。ここでは詳細E16.5(瘢痕)とE18.5(瘢痕化)マウス胚の背で胎児の瘢痕創傷治癒の再現可能なモデル。さらに、このモデルの小さな変化は、胎児の創傷及び皮膚8,9の遺伝子発現解析など、さらなる研究の数を実行するために利用することができる。正確なタイミング妊娠がこの胎児の瘢痕創傷治癒モデルの成功した要約のために重要であることを考えると、私たちは過剰排卵時限妊娠についても詳細私たちのプロトコル。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

注:この論文で説明されているすべての手順は、実験動物管理上のスタンフォードの紛争処理パネル(APLAC)によって確立されたガイドラインに従って実施されている。

1.時限妊娠 - 過排卵技術(図1)

注:正確にE16.5とE18.5での胎児手術のためのマウス胚の妊娠期間のタイミングは非常に重要である。このセクションの我々の詳細には過剰排卵を誘発するために妊娠馬血清(PMS)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)注射を用いて、マウスの妊娠のタイミングのために私たちのプロトコル。

  1. 1日目のために一時と午後3時間100μlのPBSの容量でPMSの3.0から5.0国際単位(IU)でメスのマウス(<ケージ当たり5)を腹腔内(IP)を注入します。
  2. 12:00 3日目(四〇から五PMSの注射後時間〜47)の2:00 PMの間に、100μlのPBSの容量でHCGの3.0から5.0 IUとメスのマウスIPを注入する。
    注:HCG注射を誘導排卵の約12時間後に注射。
  3. 直後にHCGの注射後、8-16週齢の雄と雌交尾。
    注:我々は、典型的には、個々の男性のケージに2人の女性を置く。
  4. 胎児の年齢E0.5として - (10:00 AM 6時00分)とレコード4日目の朝に、男性とは別の雌。
    注:ワギナプラグは、この時点で確認することができます。しかし、膣のプラグの観察は、妊娠を保証するものではありませんし、何プラグが観察されない時に女性が妊娠することができます。妊娠が妊娠年齢のE16.5及びE18.5での目視検査および/または触診によって一般的に観察可能であることを考えると、4日目の朝に膣栓をチェックすると、必ずしも必要ではありません。我々の経験では、歪みに応じて、超排卵の雌の約30から50%はここに記載されている技術を使用して妊娠。

pgの "/>
過排卵技術については、図1の回路図。マウスでの過剰排卵時限妊娠の回路図を示す手順。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

E16.5およびE18.5胚2.マウス胎児手術(背傷つけ処理)(図2)

  1. 手続きの前に、70%のイソプロピルアルコールで手術室や機器の全ての表面をきれいに。また、それらをオートクレーブ処理により手順で使用されるすべての手術用品や楽器を殺菌。いくつかの機関は、ホットビーズ滅菌のその後の使用を可能にすることができる。操作ごとに、ガーゼや手術器具を含む無菌パックを使用しています。
  2. 毎分1リットルでのメンテナンス麻酔に続いて、毎分2リットルで2.5%イソフルラン/酸素混合物の下で妊娠中の母親(胎児の年齢E16.5またはE18.5)で麻酔を誘導する。
  3. CONへしっかりと適切な麻酔、マウスの深いペダル反射が抑制されていることを確認し、腹臥位でマウスを置く。
  4. 手術中眼刺激や乾燥を防ぐためにそのようなPuralubeとして獣医眼軟膏を適用します。
  5. 30秒( 図2A)より、もはや用脱毛クリームの光アプリケーションを投与することにより、腹部を準備します。
  6. ポビドンヨードとアルコール( 図2Bおよび2C)との無菌手術のために腹部を準備します。
  7. 顕微はさみ( 図2Dおよび2E)を用いて顕微鏡下で正中開腹を行います。
  8. 静かに手術( 図2F)用に選択子宮や胎児を公開します。
  9. 鈍い先端の針を用いて温かい(38℃)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で手術野を洗浄
    注:One慎重大口径の針の先端を折り曲げて作製することができる。 ( 図2Gおよび2H)。
  10. 許可するようにした胎児を置き背にフルアクセスだ。
  11. 意図された背側創傷( 図2I)のサイトの上にある子宮を通して7-0ナイロン縫合糸を使用した巾着ステッチを渡します。脊髄の左または右へ、および大血管を欠く子宮壁の領域における背の領域にわたって位置巾着。
  12. 巾着( 図2J)の中央に子宮壁と羊膜嚢を通じて3mmの切開を行います。
  13. 温かい(38℃)PBSで切開部位を洗浄する。
  14. 顕微はさみを使用して、胎児の背に、単一の全層切除傷、長さ約1ミリメートルをカット。
  15. そっとブロット切開部位は、綿チップアプリケーターで乾燥させます。
  16. 傷( 図2K)の場所をマークするために、創傷部位に3μlのボリューム墨汁の皮下に注入します。
  17. インクが創傷部位内に保持されていることを確認するために温かい(38℃)PBSで灌漑。
  18. 外科助手の私を持っているnject巾着など羊膜嚢に鈍い先端10のG注射器を通して温かい(38℃)、PBS( 図2L)を閉じている。巾着の閉鎖が完了します( 図2M)を近づくと注射器を撤回。
  19. 静かに腹腔( 図2N)に子宮を返す。
  20. エバートの皮膚や腹膜。
  21. 温かい(38℃)PBSで腹腔を外科助手を灌漑している。
  22. 皮膚や腹膜ステープルすばやく閉じる腹部が( 図2O)閉じた。標準的な閉鎖は二層で行われる。腹膜および第2層における一方の層、皮下組織および皮膚の腹筋。即時の犠牲と胎児の収穫のために、私たちのデモが1層で閉鎖を示している。
  23. 30分間または動物が胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、37℃に設定した暖かいインキュベーター内で観察下に動物を置きます。
  24. retにしないでくださいそれは完全にプロシージャから回復するまで、他の動物の会社に動物をURN。
  25. 麻酔からとその後の48時間の間に覚醒時には、ブプレノルフィンの皮下注射(0.05 mg / kgを)疼痛評価に基づいて、必要に応じて鎮痛のために12時間ごとに管理する。必要に応じて追加の術後疼痛緩和のために皮下注射を介してカルプロフェン(5ミリグラム/ kg)を管理します。
  26. ケージに動物を返し、食物と水を自由にそれらを提供する。
  27. 痛みの症状のために密接に監視します。
  28. 48時間後に手術、イソフルランと収穫負傷胎児の過剰摂取で妊娠中の母親を生け贄に捧げる。これを行うためには、5%以上にイソフルラン濃度を調整し、呼吸停止後に1分間曝露を維持する。頸椎脱臼で安楽死を確認してください。年齢をマッチさせたコントロールのための無傷胚を収穫。後期胚は、次のような動物実験委員会の勧告、と一貫安楽死の別のメソッドを持っている必要がありますデ人頭、頸椎脱臼、または化学薬品注入。

図2
図2.回路図マウス胎児外科。E16.5及びE18.5マウス胚で負傷背部するための一般的な手順。(A)マウスの腹部の脱毛。(BとC)マウスの腹部の調製。(D)顕微鏡外科に使用子宮を通じて巾着縫合の手順。(E)ミッドライン開腹。(F)子宮の露出を。鈍先端針の(G)の作成 ​​。温かい生理食塩水で子宮の(H)灌漑。(I)の作成​​。(J)切開壁と1ミリメートルフル層切除創傷世代。(K)墨汁の皮下注射。(LとM)巾着縫合の閉鎖。(N及びO)腹部の閉鎖。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

組織学的分析のために、背側の皮膚E16.5及びE18.5における皮膚創傷マウス胚を4%PFAで固定し48時間後創傷、収穫されるべきであり、パラフィン包埋した。蛍光トランスジェニックモデルでは、10月との凍結保存が適切であり得る。細胞および結合組織の構造を可視化するために使用できるいくつかの汚れがある。ヘマトキシリンとエオシン、核青と好酸球の構造( すなわち 、細胞質と細胞外コラーゲン)を染色する二色染色である、赤、ピンク、オレンジのさまざまな色合い。マロリー·トリクロームは、結合組織の周囲の細胞を区別するための最適な、アニリンブルー、酸性フクシンオレンジ色のGからなる三色染色である。

図3
図3.瘢痕E16.5胎児創傷の組織学。 (A)ヘマ ​​トキシリンおよびエオシン染色の再veals完全な再上皮化および炎症細胞の数の穏やかな増加が存在する(矢印)。バー= 25;(100倍;バー= 100μm)は(B)エオシン染色は、再生毛包(矢印)(400倍の周りに墨汁(矢印)を示している。バー=25μmの);μm)は(C)マロリーのトリクローム染色は、毛包(400倍の存在と細かい網状真皮コラーゲンパターンを明らかにする。コルウェル 10から許可を得て転載。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

背側切除創傷は、適切なサイズ(1ミリメートル)と深さ(全層)である場合は、ヘマトキシリン​​及びエオシン染色は、最小限の瘢痕化、完全な再上皮化、および炎症の数のわずかな増加とそのE16.5の皮膚治癒を明らかにする細胞( 図3A)。さらに、これらはwounDSは約正常な皮膚のアーキテクチャで癒し、(矢印; 図3B)損傷の部位の中の毛包を再生させる含まれている必要があります。新規に作成した創傷への墨汁の適切な適用は、損傷部位(; 図3B矢頭)でのインクの堆積をもたらすべきである。最後に、トリクローム染色は、非瘢痕真皮( 図3C)の細かい網状真皮コラーゲンパターン特性を明らかにする必要があります。

図4
図4.瘢痕E18.5胎児創傷の組織学。 (A)ヘマ ​​トキシリンおよびエオシン染色は損傷部位で真皮におけるエオシン染色の増加(矢印)を明らかにする。(200X;バー= 50μm)を(B)マロリーのトリクローム染色は、緻密皮膚コラーゲン(矢印)(400倍を示しています。バー= 25ミクロン)。コルウェルから許可を得て転載。10

E18.5で行われた背側の傷のE16.5、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で行われた傷と比較して、48時間後に創傷が損傷部位( 図4A)での正常な皮膚構造の喪失と密な傷跡を明らかにする必要があります収穫。同様に、トリクローム染色は、無秩序なコラーゲン沈着(矢印; 図4B)の密なパターンを明らかにしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで紹介するの外科的プロトコルは、最初に私たちの研究室10が2006年に出版さ胎児マウスの瘢痕治癒の切除モデルについて説明します。切除創傷11の他の確立されたモデルに加えて、胎児マウス瘢痕治癒の切開モデルが同様に存在する12,13。サル、子羊、ウサギ、オポッサム、ラットで胎児の瘢痕創傷治癒の調査は、14〜17を報告されている。しかし、マウスは、それらの比較的低いあたりの日当ケージコストと十分に特徴付けられたゲノムに胎児の瘢痕創傷治癒を探索するのに理想的なモデルを表す。また、関数の時間的および空間的な遺伝的損失/利得を正確瘢痕修復のメカニズムを解読するための機会を提供するトランスジェニックマウス系を用いて、胚発生の間に達成することができる。

これらの利点にもかかわらず、マウスは、それらのサイズが小さい胎児手術中に特定の技術的な課題を提示する。与えられた妊娠中の母親に麻酔のストレス、細心の注意を投与されているイソフルラン/酸素レベルを監視するために注意が必要です。毎分1リットルのメンテナンス麻酔に続いて、毎分2リットルで2.5%イソフルラン/酸素の混合物を慎重に接着されるべきである。この重要な要因の偏差または変動はかなり罹患率に影響を与えることができます。巾着縫合糸の適切な配置は、手術の最も技術的に困難な側面を表す。正しくこのステッチを配置しないと羊水とPBSポスト決算の漏れが発生します。子宮内の流体の不十分な体積は、胚への外傷になり、早期子宮収縮を誘発し得る。このため、子宮口時に失わ羊水の交換も、この外科モデルにおける重要なステップである。ケアは、巾着が閉じているように継続的に暖かいPBSを排出するように注意しなければならない。これらの要因は重要なトラブルシューティングが必要であり、我々はこれらの詳細にその注意を強調する成功した手術の可能性が高くなります。しかし、それらの経験豊富な外科の手では、E16.5胎児で約40%の罹患率のために計画する必要があります。

胎児の瘢痕創傷治癒を理解することは、開発の成人の段階で線維形成挙動のin vivoでの変調を目的としたトランスレーショナ医学の値を保持します。大人の皮膚と比較して、胎児の皮膚は、現像真皮減少引張強度、発生期の毛包、および異なるECM成分2,4を有している。胎児の皮膚は、大人の皮膚4,9と比較して成人の皮膚、より少ない少ない成熟肥満細胞、ケラチン8および19、およびヒアルロン酸の高いレベルの発現と比較してIを入力するためのコラーゲンタイプIIIの上昇比を有する。胎児における瘢痕治癒のメカニズムを解読することにより、我々は、回生表現型への成人における線維症の原因と分子·細胞経路を操縦し始めることができます。羽化OマウスでトレースF系統と他の遺伝的ツールは、胎児の瘢痕創傷治癒の調査のための有望な新たな道を開いた。罹患率の本質的に高い率と胎児手術に関連した早期子宮収縮を考えると、胎児の瘢痕皮膚の調査は正確で再現性の外科的モデルを必要とし、in vivoで創傷治癒。ここでは詳細E16.5(瘢痕)とE18.5(瘢痕化)マウス胚の背で胎児の瘢痕創傷治癒の再現可能なモデル。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

この作品は、(HPL)は、NIH助成金R01 GM087609、(MTL)は(HPL)のアンソニー·シュウ、NIHのグラントU01のHL099776に敬意を表しイングリッド·レイとビル·シュウからの贈り物、Hagey研究のための助成金によって部分的にサポートされていました小児再生医療と(MTLとHPLへ)オーク財団。 GGWはスタンフォード大学医学部、スタンフォード医学者研修プログラム、及びNIGMS訓練助成金GM07365によってサポートされていました。 MSHはCIRM臨床フェロー研修グラントTG2-01159によってサポートされていました。 WXHはサーノフ循環器財団からの資金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-O MONOSOF Suture eSuture SN-1647G
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Autoclip 9 mm Texas Scientific Instruments 205060
Insulin Syringe Thermo Fisher Scientific 22-272-382
Black Pigment AIMS 242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe BD Biosciences 309596
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS) Millipore 367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG) Sigma-Aldrich CG10
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
  2. Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
  3. Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
  4. Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
  5. Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
  6. Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
  7. Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
  8. Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
  9. Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. (2014).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
  11. Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
  12. Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
  13. Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
  14. Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
  15. Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
  16. Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
  17. Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics