Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектральные визуализации тканей человека разделах, направленные на совершенствование патологии

* These authors contributed equally
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектроскопического изображения является Новый подход для получения детальных изображений, которые связанные биохимический информацию. FT-IR визуализации ткани на основе принципа, что различные регионы в средней инфракрасной области поглощаются различными химическими связями (например, C = O, CH, NH) в клетках или ткани, которые затем могут быть связаны с наличием и составом биомолекул (например, липиды, ДНК, гликоген, белок, коллаген). В ИК-изображения, каждый пиксель в изображении содержит всю Инфракрасный (ИК) спектра, который может дать информацию о биохимического статуса клеток, которые затем могут быть использован для развития клеток типа или болезнь типа классификации. В этой статье мы покажем,: как получить ИК-изображения из человеческих тканей с использованием системы FT-IR, как изменить существующий инструментарий для обеспечения возможности получения изображений с высоким разрешением, и как визуализировать FT-ИК-изображений. Затем мы представим некоторые приложения FT-IRПри патологии с помощью печени и почек в качестве примеров. FT-IR изображений держит интересные приложения в обеспечении новый маршрут, чтобы получить в совершенно без наклеек невозмущающие маршруту биохимический информацию от клеток и тканей к предоставлению новому взглянуть на молекулярно-биологических изменений как часть болезненных процессов. Кроме того, это биохимический информация может потенциально позволяют объективно и автоматизированного анализа некоторых аспектов диагностики заболеваний.

Introduction

ИК-спектроскопия была аналитический инструмент доступен в той или иной форме с 1930-х годов; Однако, это только было в последнее десятилетие, что площадь ткани изображений с FT-IR имеет разобранном. Достижения в области ИК-Фурье для визуализации тканей были вынуждены в значительной части на три ключевых событий: 1) увеличение скорости получения данных из-за наличия большого фокальной плоскости (FPA) детекторов, которые, как правило, имеют тысячи ИК детекторов 1 , 2, 2) развитие передовых алгоритмов обработки и вычислительной мощности, чтобы обрабатывать большие гиперспектральные наборов данных 3, и 3) моделирование систем ИК-изображений, чтобы максимизировать пространственное разрешение 4,5. Там были многочисленные высокое качество и очень обширные статьи с анализом того, поле ИК-Фурье спектроскопии недавно 6-16, в дополнение к работе Природа протоколы, которые подробно описываются действия, чтобы получить спектры точки или карты из тканей 17. В этой статье мы сосредоточимся на протocol для получения изображения тканей с использованием 128 х 128 FPA детектора в модифицированной системе FT-IR с возможностями высокой четкости.

FT-IR изображений уже давно предложил, чтобы быть потенциально желательно инструмент для клетки и визуализации тканей из-за способности для получения изображений, в которой каждый пиксель имеет богатый биохимический информации. FT-IR томография основана на принципе, что различные биомолекулы в образце будет количественно поглощать различные регионы средней инфракрасной; это позволяет при выводе в «биохимической отпечаткам пальцев». Это отпечатков пальцев был показан во многих исследованиях для изменения между различными типами клеток и болезненных состояний. В отличие от обычной патологии практике, когда пятна и иммуногистохимических маркеров должны быть использованы для визуализации и идентификации типов клеток и тканевых структур, которые используются для диагностирования и лечения варианты, изображения из ИК-Фурье формируются на основе присущего биохимии ткани. Ток Techniqие окрашивания ткани для диагностики занимает много времени, разрушительное, кропотливая и требует субъективной экспертизы патологоанатома, в то время как FT-IR предлагает потенциал, чтобы сделать этот процесс быстрым, неразрушающим, высокой степенью автоматизации и более объективным. Кроме того, FT-IR обеспечивает новый маршрут для получения дополнительной биохимической информации, которая не может быть легко доступны с помощью обычных методов окрашивания.

Один из самых интересных достижений в последние годы наличие широких подходов изображений разрешением, которые теперь могут позволить для визуализации и характеризации типов клеток и тканевых структур, которые важны для комплексной диагностики заболеваний. Один из этих методов является нарушенного полного отражения (ATR) FT-IR, который включает в себя твердый иммерсионного объектива (SIL) по высоким показателем преломления, который позволяет с высоким разрешением изображения 18, и многие очень интересные исследования, показывающие свои приложения 19-25. Кроме того, шкак недавно показали, что увеличилось пространственное разрешение связано с изображениями ATR может позволить для визуализации и классификации эндотелиальных и миоэпителиальных клеток в ткани молочной железы, которые образуют ключевой компонент диагностики 26 рака молочной железы. В то время как изображения ATR является очень полезным, этот метод требует SIL вступить в контакт с тканью, чтобы сформировать FT-ИК-изображений; поэтому ее использование несколько ограничена для ткани патологии, где большие участки ткани должны быть быстро изображаемого.

Второй подход был продемонстрирован путем связывания с большим увеличением цели к существующей FT-IR системе, которая использует синхротрон как яркий источник ИК, можно полностью освещать FPA и изображение с эффективным размером пикселя 0,54 х 0,54 мкм. Это позволило нам визуализировать ключевые структуры в груди и простаты ткани, которые не были разрешимых с помощью обычных ИК-систем 4. В то время как эти драматические увеличивается в ИК изображения пространственного Resolutioн были захватывающими, его использование по-прежнему ограничено из-за требуя синхротрона. Впоследствии, оптимальная система была разработана, которые также могут обеспечить высокой четкости возможности визуализации с размером 1,1 х 1,1 мкм пикселей без необходимости в источнике синхротронного а скорее с использованием традиционного GLOBAR источник ИК-5. В этой статье мы покажем, как изменить существующий коммерческую систему визуализации FT-IR, чтобы для дифракционного предела тепловидения тканей с приемлемым отношением сигнала к шуму с использованием нескольких ИК целей (15x, 36x, и 74X). Эффективный размер пикселя с тремя целями составляет 5,5 х 5,5 мкм (15X), 2,2 х 2,2 мкм (36X) и 1,1 х 1,1 мкм (74X). Затем мы приведем несколько примеров важности достижения в пространственным разрешением для выявления заболевания печени и почек биопсии 27.

Protocol

1. Настройка ИК-микроскоп и приобретения Tissue изображений

  1. Раздел фиксированных формалином парафин ткани блок на 4 мкм толщиной на-совместимый слайд ИК с использованием микротома. С другой стороны, секция жидкий азот замороженной ткани на 4 мкм толщины на совместимый слайд ИК использованием криостата.
    Примечание: Как правило, серийный разделе также будут приобретены на предметное стекло и окрашивают специальным (например, гематоксилином и эозином (H & E)) или иммуногистохимического окрашивания. Кроме того, культивируемые клеточные линии можно вырастить на слайдах ИК совместимых. ИК совместимые горки может быть ИК отражающих горки для отражения режиме съемки (например, MirrIR слайд, золото) или ИК прозрачных слайдов для визуализации режима передачи (например, BaF 2, CaF 2).
  2. Purge микроскоп FT-IR спектрометра и с использованием либо сухим воздухом или сухим азотом для удаления атмосферной воды из системы. Подождите, по крайней мере, 45 минут до визуализации, чтобы обеспечить тщательное Пюрге.
  3. Холодный и детектор FPA (до 79 К), и внутренний детектор МСТ в ИК-микроскопом с использованием жидкого азота. Прохладный детекторы каждые 6 ч.
    ВНИМАНИЕ! Жидкий азот криогенной жидкости и может вызвать ожоги от холода, обморожения и в закрытых помещениях удушья.
  4. Установите образец слайда на сцене микроскопа для ИК-изображений.
  5. Убедитесь, что видимый свет является "ON", а затем либо с помощью бинокля или программы захвата образца (который обеспечивает в режиме реального времени видеть изображения ткани), фокус на образец.
  6. Откройте пакет комплект программного обеспечения, таких как резолюции про и нажмите кнопку "Collect", то нажмите кнопку "Диагностика" и выберите "Align спектрометр. Убедитесь, что путь луча спектрометра внутреннего детектора ничто не мешает.
  7. Нажмите на кнопку 'с изображениями Setup ».
  8. На вкладке "электроника", выберите соответствующий "Скорость", "Под Sampling Соотношение (UDR) »и« Настройки Filters "в зависимости от системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, установка скорость = 2,5 кГц, UDR = 4 и фильтры = None.
  9. На вкладке "Optics" убедитесь, что "Mid-IR источник», «Открытая диафрагма» и «100% луч аттенюатора 'выбирают.
  10. Для калибровки системы, на вкладке "Optics", выберите "детектор" как "Ground", "Микроскоп детектор 'как' Левый ', а затем выберите либо' пропускания 'или' коэффициент отражения в разделе 'режиме оптики" в зависимости от типа слайд используется.
  11. Нажмите Настройка, которая откроет окно 'Lancer контроля ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме отражения следуйте инструкциям в 1,12 и 1,13 и режим передачи следуйте инструкциям в 1,14 до 1,16. Продолжайте с 1,17 как для отражения и пропускания.
  12. В режиме отражения, в &# 8216; 'выберите' Lancer Control Raw ». Использование регулирующей ступени джойстик и смотреть живой вид интерферограммы изображения ИК-(справа вверху изображения), перейти к экологически чистом районе на слайде.
  13. Установите такое время интегрирования до приблизительно 8000 пунктам. Затем, переместите на сцену, чтобы найти кусок ткани со структурой, предпочтительно края ткани, и совершенствовать фокусировки изображения. Change 'Тепло »и« Контраст »варианты, чтобы помочь сформировать изображение, чтобы улучшить фокусировку, это не будет иметь никакого влияния на ИК-данных. Продолжайте с 1,18.
  14. В режиме передачи, в клик "Lancer управления '' Raw». Использование регулирующей ступени джойстик и смотреть живой вид интерферограммы изображения ИК-(справа вверху изображения), перейти к экологически чистом районе на слайде.
  15. Установите такое время интегрирования до приблизительно 8000 пунктам.
  16. Регулировка нижней фокусировка / конденсатора Цель увеличить количество отсчетов в его Maximuм. Смотрите форму в правом нижнем изображения в Lancer управления, чтобы убедиться, что он является гауссовым по внешнему виду и относительно равномерным. Установите такое время интегрирования снова примерно 8000 пунктам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо из пикселей в интерферограммы изображения ИК-белеют, сократить время внедрения.
  17. Перемещение на сцену, чтобы найти кусок ткани со структурой, предпочтительно края ткани и совершенствовать фокусировки изображения. При необходимости измените тепло и контрастности варианты, чтобы помочь сформировать изображение, чтобы улучшить фокусировку, но не будет иметь никакого влияния на ИК-данных.
  18. Использование регулирующей ступени джойстик, перейдите на экологически чистом районе на слайде. Нажмите кнопку "калибровать". Убедитесь, "Out Of Range (ООР)" значение меньше 50, а разница между «High Flux» и рассчитывает 'с малым потоком ", по крайней мере 4000 на счету.
  19. Выберите 'OK' в два раза. В оптике вкладок выберите; "МСТ" = "детектор", "Microsсправиться '=' детектор право ", а затем нажмите кнопку" Настройка ". В этот момент будет интерферограммы ИК-на экране. Нажмите на ссылку "Найти Centerburst. Нажмите "Хорошо".
  20. На вкладке "Optics", повторно = 'детектора' 'Ground', 'Микроскоп детектор' = 'Left' и выберите 'Setup'.
  21. В Lancer Control - обеспечить изображение все еще находится на экологически чистом районе и нажмите кнопку "Калибровка" снова. Нажмите "Хорошо".
  22. Далее, собрать фоновый FT-IR изображение для коррекции поглощения из атмосферы, системы и слайда. Перейдите на вкладку "электроника" и выберите соответствующий спектральное разрешение, обычно 4 см -1 или 8 см -1 для ткани.
  23. Перейдите на вкладку "Фон" и введите 128 в "Сканирование для совместного добавить. Выберите "Новый файл ..." кнопку и поместите фона файл в соответствующем разаэ. Проверьте вкладку "томография", чтобы обеспечить мозаик 1 на 1. Нажмите на кнопку "Фон", дождитесь окончания сканирования до конца и подтвердить, куда сохранить файл. Нажмите область на фоне ИК-изображения и проверить спектр.
  24. Для того, чтобы большой мозаичное изображение образца, перейдите на вкладку "томография" и ввести номер Х и Y кадров для мозаики размера вы хотите приобрести.
  25. Нажмите 'Setup' и Lancer контролировать использование живой вид ИК, чтобы найти интересующую область. Если брать мозаику, Центр живой корм в середине области интереса. Нажмите "Хорошо". Перейдите на вкладку "электроника" и введите количество сканирований, для совместного добавить (как правило, в пределах между 2 и 16 сканирований для ткани). Нажмите кнопку "Сканировать".
  26. Проверьте собранную FT-IR изображение на экране, чтобы убедиться, что он выглядит целенаправленным. Нажмите на изображение, чтобы воспитывать ИК-спектр с этого места и убедитесь, что он выглядит иметь приемлемый сигнал-шум. АкуиRe видимое изображение образца.
  27. Сохранить изображение и экспортировать его в требуемом формате, например, ENVI-IDL.

2. Адаптация FT-IR микроскоп для High-Definition возможностей

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство ИК-Фурье системы оснащены объективом примерно 15X увеличением и 0,5 числовая апертура (NA). Для изображения в режиме высокой четкости, ИК совместимы 36X или 74X цель может быть использован для дифракции ограниченные возможности визуализации.

  1. Удалить 15X цели системы, открутив против часовой стрелки.
  2. Винт в любом цели 36X или 74X на своем месте. Совместите цель перед использованием. При использовании удлинителя объектив трубы, чтобы принести цель достаточно близко к образцу.
  3. Поместите ткань под новый объективный и фокусировку с помощью видимого света, используя либо бинокль или образец программы Capture.
    ПРИМЕЧАНИЕ: изображения высокой четкости должно быть сделано в режиме передачи. Очень близко рабочее расстояниеSE цели (1-2 мм) и очень мелкой глубины фокуса требует фокусировки медленно и осторожно, принимая время, чтобы снизить цели, не касаясь образца.
  4. Следуйте инструкциям от 1,6 до 1,11.
    Примечание: Из-за того, чтобы значительно труднее сосредоточиться и гораздо меньше света достигает детектора, следующий протокол корректируется на основе 1,14.
  5. В режиме передачи, нажмите на "сырые". Использование регулирующей ступени джойстик и смотреть живой вид интерферограммы изображения ИК-(справа вверху изображения), перейти к ткани и сосредоточиться (в идеале на краю).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть трудно, поэтому настроить "теплоту" и "контрастности" варианты, чтобы помочь сформировать изображение, чтобы улучшить фокусировку (эти опции не влияет на ИК данных).
  6. После фокусировки, используя контрольный этап джойстик и живой ИК Посмотреть переход к экологически чистом районе на слайде. Установите такое время интегрирования до приблизительно 8000 пунктам. Настройте нижнюю фокусировки цельувеличить число отсчетов до максимума. Установите такое время интегрирования снова примерно 8000 пунктам.
  7. Перемещение на сцену, чтобы найти кусок ткани со структурой, предпочтительно края ткани, и совершенствовать фокусировки изображения.
  8. Если мозаик изображения с высоким разрешением, отрегулируйте на сцену, чтобы позволить правильное движение, необходимое на расстояние для точного мозаик. Чтобы изменить настройки расстояния сцене, выйти на "стадии установки» в Lancer контролировать и регулировать горизонтальные и вертикальные параметры выравнивания для обеспечения правильной мозаике.
  9. Использование регулирующей ступени джойстика переход к экологически чистом районе на слайде. Нажмите кнопку "калибровать". Убедитесь, что выходит за пределы диапазона значения (ООР) меньше, чем 50 как для 36х и 74X целей. Убедитесь, разница между High Flux и ценностей с малым потоком, по крайней мере 1000 рассчитывает на цели 74X и 2000 рассчитывает на цели 36x.
  10. Продолжить с 1.19 до 1.27. Сканирований в 1,23 число и1.25 должны быть скорректированы в связи с сокращением сигнала примерно 256 осмотров на фоновое изображение и от 16 до 128 сканирований для изображения тканей.

3. Визуализация и классификации ИК-спектра наборов данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе мы обсудим, как визуализировать и извлекать данные из спектральных изображений с использованием геопространственных обработки изображений и анализа программного обеспечения, таких как ENVI + IDL, однако процесс очень похож на любом запасном программного обеспечения, таких как MATLAB, свободного программного обеспечения, таких как CytoSpec или собственного программного обеспечения приборной разработчика. Есть несколько различных методов спектральной обработки, которые могут быть выполнены на данных ИК.

  1. Открыть обработки геопространственных изображений и анализа программного обеспечения и загрузите файл ИК данных.
  2. Применить алгоритм коррекция базовой линии данным ИК, выбрав "Спектральный инструменты" и прокрутите вниз и нажмите кнопку "спектры поглощения". Соблюдайте всплывающее меню и выберите "Базовый соотие "
    ПРИМЕЧАНИЕ: коррекция базовой линии будет удалить смещение базовой линии склона по данным из-за рассеяния
  3. Выполнение спектрального нормализации, с помощью ratioing данные определенного спектрального пика (обычно Амид I (1650 см -1) или амид II (1550 см -1)) или площади под определенной области спектра. Для этого выберите "Нормальный спектры" в разделе "спектры поглощения" меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральный нормализация выполняется так, что любые различия в спектрах реальные биохимические различия и не из-за толщины или различия в плотности между образцами.
  4. Используйте алгоритм шумоподавления для удаления шума из спектров, если это необходимо 28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько подходов, доступные с помощью которых коррекция базовой линии, спектральный нормализация и уменьшение шума может быть достигнуто, с наиболее программным обеспечением, имеющим автоматизированные алгоритмы, построенные в Кроме того, есть появляются несколько подходов, которые поправят.спектральные аберрации, которые были подробно обсудили 29-42; Однако, сообщество пока не согласен на которой из них необходимы.
  5. Заметим, список всех частотах ИК собранных в изображении (обычно в спектральном диапазоне от 900 до 4000 см -1). Нажмите на частотах, которые соответствуют конкретным биомолекул наблюдать изображение ткани на выбранной частоте.
    1. Например, нажмите на 1650 см -1 группы, чтобы наблюдать распределение белков в образце. В качестве альтернативы нажмите на 1080 см -1 полосы, чтобы наблюдать распределение нуклеиновых кислот в образце. Используйте волновое 1650 см -1.
  6. Создание дополнительных изображений путем вычисления спектральных коэффициентов высоты пика, соотношение площади пика и т.д., которые позволят для визуализации различных молекулярно-биологических компонентов. Нажмите на "спектральных Сервис" и выберите либо 'соотношениях высоты пика "или" Рассчитать изображение области "для создания изображений.
  7. Сканирование в соответствующем разделе прилежащих тканей, которые окрашивают с помощью отдельного всю систему слайд-датчик, фиксирует светлого изображения. Наряду с ИК-изображения, воспитывать цифровое изображение окрашенных тканей с видимой имиджевой программы.
  8. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении в зоне интереса и выберите "Z профиль". Это даст спектральную информацию в выбранного пикселя.
  9. Посмотрите на ИК-спектров множества пикселей из нескольких классов, таких как сравнение типов клеток, болезненных состояний. Все конкретные пиксели на изображении с помощью «Регионы интереса» (ROI) инструмент. Для этого щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "инструмент ROI». Создание классов, которые должны быть помечены, например, нормального, дисплазии и рака классов. Затем выберите, "тип ROI» - «точка». Затем выберите класс, чтобы выбрать пиксели, и опираться на соответствующие пикселей на ИК изображении. Вывести среднюю спектры Fили каждый из классов, использующих "Средняя ROI" инструмент.
  10. Сравните полученный спектры, откладывая в графическое программное обеспечение.

Representative Results

FT-IR изображений позволяет при выводе ИК изображений ткани, которые могут дать разные контрасты в зависимости от ИК интересующей частоте. Кроме того, в ИК-изображения, каждый пиксель состоит из всей ИК-спектре, при различных пиков, соответствующих различных биомолекул, которые могут дать информацию о биохимических свойств типов клеток или болезненных состояний (рисунок 1). Здесь мы показали, как сравнивать спектральные подписи между классами, однако, более усовершенствованной автоматизированной классификации можно с помощью дополнительных алгоритмов 3,43-50, например, байесовский классификации, Случайные леса, искусственных нейронных сетей, и Архиерейский кластерного анализа могут быть выполнены на Данные. Руководил подходы классификации позволит на строительство классификатора, который может быть обучен позволяют для автоматизированного распознавания типов клеток или болезненных состояний. Неконтролируемые подходы классификации могут быть использованы для поиска в природе DIFконференциях в ткани или клетки из-за биохимического дисперсии.

FT-IR-измерительные приборы развивалась на протяжении последних нескольких десятилетий, от измерения в точке / однопользовательском режиме отображения с помощью ИК непрозрачные отверстия в режим визуализации с использованием целей Кассегрена, используя либо освещая цель сочетании с сборный цели в передаче режиме или в режиме единой цели что оба загорается и собирает в отражения режиме (рисунок 2). Это было недавно показано, что сбор цель в режиме передачи может быть остановлена ​​на более высоком увеличении и численного апертура объектива, чтобы дифракционного ограниченной тепловидения, что приводит к существенному увеличению пространственного разрешения, собранных ИК изображений 4,5. Достижения в области пространственного разрешения для работы с изображениями тканей были критически важное значение, как и сейчас, мы можем идентифицировать типы клеток и тканевых структур, например функциональные единицы почки, почечных клубочков, используя адаптированы в домеИК-Фурье системы (Рисунок 3).

Высокой четкости ИК-изображений позволяет детальные изображения тканей, которые будут рассмотрены, чтобы определить аномальные участки и определить биохимические различия между разными типами клеток. В ядре ткани печени, можно визуализировать гепатоциты и регионы проникновения фиброз, который делит два различных областях дисплазии и без дисплазии печени (рис 4). Мы работаем, чтобы воспользоваться этим в направлении обеспечения автоматизированных диагностических инструментов для использования в сложных случаях заболеваний печени.

Важно отметить, что увеличилось пространственное разрешение может теперь позволяют нам выделить конкретные структурные особенности, которые могут быть химически модифицированы заболевания, прежде чем гистологические изменения очевидны. Например, мы сосредоточены на выявлении биохимические изменения в почках клубочков структур, таких, как капсула Боумена, мезангиум, гломерулярной базальной мембраны и трубчатой ​​базальной мембраны, до Изменения, выявленные патологоанатом может наблюдаться (рис 5). В частности, мы заинтересованы в выявлении изменений, связанных с прогрессированием диабетической нефропатии и хронического отторжения в трансплантации пациентов, где современные методы не в состоянии определить изменения в достаточно раннем моды для успешного вмешательства.

Рисунок 1
Рисунок 1. ИК-Фурье изображения и спектр с сердечником печени. Изображение (а) Н & Е окрашивали сердцевину из биопсии печени и изображений ИК поглощение последовательного сечения той же ядра в точке (В) 3286 см -1 и (C) 2603 см -1, в котором подчеркивается различные структурные особенности. (D) Типичный ИК-спектр ткани, с важными пиками меченых. Шкала бар = 100 мкм.fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Оптическая схематические подробным режима эксплуатации ИК-микроскопом. (A) в режиме передачи, образец облучается через нижнюю цели, и свет, проходящий через образец собирают верхней цели. (В) В режиме отражения, верхняя цель служит как для освещения образца и сбора отраженного света. Нижняя цель не используется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сравнение дифферет микрообъективов на ИК-Фурье образов клубочка почки в 2925 см -1. () 15X сбора объективных с NA = 0,5 (размер 5,5 х 5,5 мкм пикселей). (B) 36X сбор объектив с NA = 0,5 (размер 2,2 х 2,2 мкм пикселей). (C) 74X сбора цели с NA = 0,65 (размер 1,1 х 1,1 мкм пикселей). Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Спектральные различия между фиброзом и гепатоцитов в ядре печени. () H & E окрашенных ядро от биопсии печени. (B) Изображение серийного сечения сердечника проверяемых в FT-IR (36X цель установки). (С) Группаставитель спектры гепатоцитов и фиброза, взяты из областей ткани, указанных стрелками на (А) и (В). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Дифференцирование почечной ткани биопсии функций за счет использования высокой четкости ИК-изображений. (А) периодическое кислотно-Шифф окрашенных раздела с характеристиками должны быть извлечены помечены. (Б) высокой четкости ИК-изображение CH 2 асимметричного растяжения области (36X Цель установки) серийного части одной и той же ткани. (С) Характеристики маркировку (А) экстрагируют, используя изображение FT-IR в (б), чтобы иметь возможность химически DIFсовыми четыре функции ткани. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

FT-IR является новым модальность для знака без биохимического визуализации срезов тканей, с потенциалом, чтобы играть важную роль в улучшении текущий стандарт диагностики при патологии. В настоящее время золотым стандартом патологии требует ткани для биопсии, фиксировали в формалине, заливали в парафин, разрезали несколько раз, и окрашивали с несколькими пятнами. Высококвалифицированные патологоанатом имеет субъективно визуально оценить структуру ткани и клеточной морфологии для определения диагноза. Здесь мы показываем, как собирать ИК-изображений с высоким разрешением и того же типа секций и обсудить некоторые из вычислительных методов для изучения химических различий между типами клеток и болезненных состояний.

Критические шаги в рамках этого протокола для того, чтобы ткани очень тщательно предметными и система хорошо откалиброван для обеспечения спектроскопические данные очень высокого качества. Осторожность при настройке системы, в частности, criti кал при работе с высокими целями увеличения. Чтобы помочь в устранении неполадок, следующий список охватывает некоторые из потенциальных трудностях;

Проблема: Низкая интенсивность ИК при визуализации при отражении. Решение: Проверьте ориентацию ИК слайдов как отражающее покрытие может быть на той стороне слайда.

Проблема: Низкий уровень сигнала / красный предупреждающий знак в Lancer контроля. Решение: Классные детекторы с LN2. Жидкий азот необходим для детекторов FPA функционировать и требует периодически их пополнять.

Ошибки Ошибка / движения Скорость: проблема. Решение: Сброс спектрометр и уменьшить вибрации. Вибрации вызовет перемещение зеркала в интерферометре, чтобы его беспокоили.

Проблема: шипы водяного пара в данных. Решение: Увеличьте чистку по системе и защитить образец из воздуха.

Проблема: Неверный centerburst. Решение: Найти centerburst снова.

e_content "> Проблема:. Низкая разница в поток передачи, даже если направлены Решение. Установите нижнюю конденсатор Это будет происходить, как ИК свет не сфокусирован в точке на образце.

В этой статье мы сосредоточились на том, как получить высокой четкости ИК-изображений тканей в любом передачи или в режиме отражени. Характер ИК-изображений, в том, что существует несколько модификаций, которые могут быть сделаны с приобретением данных, такие как, типа подложки, способа фиксации, толщины образца, спектральным разрешением, интерферометр скорости зеркала и т.д. Влияние этих параметров имеет В последнее время 4,5,17,51 обсуждается в обширной подробно.

Есть целый ряд модификаций, которые могут быть сделаны в системе формирования изображения в том числе изображений в режиме ATR 10,24,26 и с использованием наноразмерных тепловые подходы 52,53, чтобы обеспечить ИК изображений с высоким разрешением. Основным ограничением с ИК-изображений высокого разрешения является то, что TiОПРОСЫ должны быть тщательно подготовлены и достаточно тонкий для ИК пройти через (обычно 4 толщины мкм). Кроме того, передачи и отражения изображения ИК-требует образцы быть сухой из-за поглощения ИК водой. Тем не менее, ИК-изображений имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами, в том, что она может очень быстро изображения большие площади ткани, а возникающие богатую и подробную информацию биохимический. Другие аналогичные методы, которые получают биохимический информацию в этикетки без моды включают спектроскопии комбинационного рассеяния света, однако время сбора данных намного медленнее, позволяющих получать изображения. Новый комбинационного подходы изображений появляются в том числе вынужденного комбинационного рассеяния (ВКР) и когерентные антистоксовом комбинационного рассеяния (КАРС); Однако, они имеют ряд доступ ограничен спектральный или изображений одной частоте.

Достижения в скорости сбора данных, пространственное разрешение и доступности вычислительных подходов были огромное значение в создании FT-IR Imagчисле более реальным подход к переводу в качестве нового инструмента визуализации при патологии. Последние достижения в пространственным разрешением были особенно важны для тканевой патологии, вызванной ключевых типов клеток, не являющихся разрешимыми с помощью обычных систем визуализации FT-IR. Недавняя статья Редди и др. показал, как смоделировать идеальную систему для получения оптимальной пространственной разрешающей способности системы ИК-изображений 5. Пример ткани почки представлены в этой статье, свидетельствуют о важности высоких пространственных разрешений для того, чтобы извлечь биохимический информацию из клубочков структур (рис 3 и рис 5). В будущем, новые достижения в квантовой каскадных лазеров очень ярких ИК источников света 54-57, 3D спектральных изображений 58 и прорывы в области наноразмерных ИК технологий 52,53,59,60 провести новые захватывающие направления исследований, которые могут иметь огромные последствия в будущем визуализации ткани.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, E. N., et al. Fourier transform spectroscopic imaging using an infrared focal-plane array detector. Anal Chem. 67, (19), 3377-3381 (1995).
  2. Dorling, K. M., Baker, M. J. Rapid FTIR chemical imaging: highlighting FPA detectors. Trends Biotechnol. 31, (8), 437-438 (2013).
  3. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23, (4), 469-474 (2005).
  4. Nasse, M. J., et al. High-resolution Fourier-transform infrared chemical imaging with multiple synchrotron beams. Nat Methods. 8, (5), 413-416 (2011).
  5. Reddy, R. K., Walsh, M. J., Schulmerich, M. V., Carney, P. S., Bhargava, R. High-definition infrared spectroscopic imaging. Appl Spectrosc. 67, (1), 93-105 (2013).
  6. Walsh, M. J., Bhargava, R. Chapter 10; Infrared spectroscopic imaging: an integrative approach to pathology. Nanobiophotonics. McGraw Hill. (2010).
  7. Walsh, M. J., Reddy, R. K., Bhargava, R. Label-Free Biomedical Imaging With Mid-IR Spectroscopy. Ieee J Sel Top Quant. 18, (4), 1502-1513 (2012).
  8. Matthaus, C., et al. Chapter 10: Infrared and Raman microscopy in cell biology. Methods Cell Biol. 89, 275-308 (2008).
  9. Walsh, M. J., et al. IR microspectroscopy: potential applications in cervical cancer screening. Cancer Lett. 246, (1-2), 1-11 (2007).
  10. Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138, (7), 1940-1951 (2013).
  11. Sahu, R. K., Mordechai, S. Spectral signatures of colonic malignancies in the mid-infrared region: from basic research to clinical applicability. Future Oncol. 6, (10), 1653-1667 (2010).
  12. Kendall, C., et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics. Analyst. 134, (6), 1029-1045 (2009).
  13. Steiner, G., Koch, E. Trends in Fourier transform infrared spectroscopic imaging. Anal Bioanal Chem. 394, (3), 671-678 (2009).
  14. Biswas, S., Walsh, M. J., Bhargava, R. Ch. 16. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 475-504 (2014).
  15. Bhargava, R. Infrared Spectroscopic Imaging: The Next Generation. Appl Spectrosc. 66, (10), 1091-1120 (2012).
  16. Malek, K., Wood, B. R., Bambery, K. R. Ch. 15. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 419-473 (2014).
  17. Martin, F. L., et al. Distinguishing cell types or populations based on the computational analysis of their infrared spectra. Nat Protoc. 5, (11), 1748-1760 (2010).
  18. Sommer, A. J., Tisinger, L. G., Marcott, C., Story, G. M. Attenuated Total Internal Reflection Infrared Mapping Microspectroscopy Using an Imaging Microscope. Appl Spectrosc. 55, (3), 252-256 (2001).
  19. Glassford, S. E., Byrne, B., Kazarian, S. G. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta. 1834, (12), 2849-2858 (2013).
  20. Andanson, J. M., Chan, K. L., Kazarian, S. G. High-throughput spectroscopic imaging applied to permeation through the skin. Appl Spectrosc. 63, (5), 512-517 (2009).
  21. Kuimova, M. K., Chan, K. L., Kazarian, S. G. Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc. 63, (2), 164-171 (2009).
  22. Chan, K. L., Kazarian, S. G. Attenuated total reflection-Fourier transform infrared imaging of large areas using inverted prism crystals and combining imaging and mapping. Appl Spectrosc. 62, (10), 1095-1101 (2008).
  23. Gajjar, K., et al. Diagnostic segregation of human brain tumours using Fourier-transform infrared and/or Raman spectroscopy coupled with discriminant analysis. Anal Methods. 5, 89-102 (2012).
  24. Holton, S. E., Walsh, M. J., Bhargava, R. Subcellular localization of early biochemical transformations in cancer-activated fibroblasts using infrared spectroscopic imaging. Analyst. 136, (14), 2953-2958 (2011).
  25. Gulley-Stahl, H. J., Bledsoe, S. B., Evan, A. P., Sommer, A. J. The advantages of an attenuated total internal reflection infrared microspectroscopic imaging approach for kidney biopsy analysis. Appl Spectrosc. 64, (1), 15-22 (2010).
  26. Walsh, M. J., Kajdacsy-Balla, A., Holton, S. E., Bhargava, R. Attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopic imaging for breast histopathology. Vib Spectrosc. 60, 23-28 (1016).
  27. Investigating the Biochemical Progression of Liver Disease Through Fibrosis, Cirrhosis, Dysplasia and Hepatocellular Carcinoma using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging. Sreedhar, H., et al. Biomedical Vibrational Spectroscopy VI: Advances in Research and Industry, 89390J (2014).
  28. Reddy, R. K., Bhargava, R. Accurate histopathology from low signal-to-noise ratio spectroscopic imaging data. Analyst. 135, (11), 2818-2825 (2010).
  29. Bassan, P., et al. The inherent problem of transflection-mode infrared spectroscopic microscopy and the ramifications for biomedical single point and imaging applications. Analyst. 138, (1), 144-157 (2013).
  30. Bassan, P., et al. FTIR microscopy of biological cells and tissue: data analysis using resonant Mie scattering (RMieS) EMSC algorithm. Analyst. 137, (6), 1370-1377 (2012).
  31. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering in infrared spectroscopy of biological materials--understanding the 'dispersion artefact'. Analyst. 134, (8), 1586-1593 (2009).
  32. Bassan, P., et al. RMieS-EMSC correction for infrared spectra of biological cells: extension using full Mie theory and GPU computing. J Biophotonics. 3, (8-9), 609-620 (2010).
  33. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples. Analyst. 135, (2), 268-277 (2010).
  34. Bassan, P., et al. Reflection contributions to the dispersion artefact in FTIR spectra of single biological cells. Analyst. 134, (6), 1171-1175 (2009).
  35. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of mid-infrared absorption microspectroscopy: II. Heterogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3487-3499 (2010).
  36. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of midinfrared absorption microspectroscopy: I. Homogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3474-3486 (2010).
  37. Kohler, A., et al. Estimating and correcting mie scattering in synchrotron-based microscopic fourier transform infrared spectra by extended multiplicative signal correction. Appl Spectrosc. 62, (3), 259-266 (2008).
  38. Miljkovic, M., Bird, B., Lenau, K., Mazur, A. I., Diem, M. Spectral cytopathology: new aspects of data collection, manipulation and confounding effects. Analyst. 138, (14), 3975-3982 (2013).
  39. Miljkovic, M., Bird, B., Diem, M. Line shape distortion effects in infrared spectroscopy. Analyst. 137, (17), 3954-3964 (2012).
  40. Bird, B., Miljkovic, M., Diem, M. Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue. J Biophotonics. 3, (8-9), 597-608 (2010).
  41. Mohlenhoff, B., Romeo, M., Diem, M., Wood, B. R. Mie-type scattering and non-Beer-Lambert absorption behavior of human cells in infrared microspectroscopy. Biophys J. 88, (5), 3635-3640 (2005).
  42. Bambery, K. R., Wood, B. R., McNaughton, D. Resonant Mie scattering (RMieS) correction applied to FTIR images of biological tissue samples. Analyst. 137, (1), 126-132 (2012).
  43. Kwak, J. T., Reddy, R., Sinha, S., Bhargava, R. Analysis of variance in spectroscopic imaging data from human tissues. Anal Chem. 84, (2), 1063-1069 (2012).
  44. Trevisan, J., Angelov, P. P., Carmichael, P. L., Scott, A. D., Martin, F. L. Extracting biological information with computational analysis of Fourier-transform infrared (FTIR) biospectroscopy datasets: current practices to future perspectives. Analyst. 137, (14), 3202-3215 (2012).
  45. Trevisan, J., et al. Measuring similarity and improving stability in biomarker identification methods applied to Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. J Biophotonics. 7, (3-4), 254-265 (2014).
  46. Bhargava, R., Fernandez, D. C., Hewitt, S. M., Levin, I. W. High throughput assessment of cells and tissues: Bayesian classification of spectral metrics from infrared vibrational spectroscopic imaging data. Biochim Biophys Acta. 1758, (7), 830-845 (2006).
  47. Menze, B. H., et al. A comparison of random forest and its Gini importance with standard chemometric methods for the feature selection and classification of spectral data. BMC bioinformatics. 10, 213 (2009).
  48. Kelly, J. G., et al. Biospectroscopy to metabolically profile biomolecular structure: a multistage approach linking computational analysis with biomarkers. J Proteome Res. 10, (4), 1437-1448 (2011).
  49. Bird, B., et al. Infrared micro-spectral imaging: distinction of tissue types in axillary lymph node histology. BMC Clin Pathol. 8, 8 (2008).
  50. Baker, M. J., et al. Investigating FTIR based histopathology for the diagnosis of prostate cancer. J Biophotonics. 2, (1-2), 104-113 (2009).
  51. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9, (8), 1771-1791 (2014).
  52. Katzenmeyer, A. M., Aksyuk, V., Centrone, A. Nanoscale Infrared Spectroscopy: Improving the Spectral Range of the Photothermal Induced Resonance Technique. Anal Chem. 85, (4), 1972-1979 (2013).
  53. Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Appl Spectrosc. 66, (12), 1365-1384 (2012).
  54. Kole, M. R., Reddy, R. K., Schulmerich, M. V., Gelber, M. K., Bhargava, R. Discrete frequency infrared microspectroscopy and imaging with a tunable quantum cascade laser. Anal Chem. 84, (23), 10366-10372 (2012).
  55. Vrancic, C., et al. Continuous glucose monitoring by means of mid-infrared transmission laser spectroscopy in vitro. Analyst. 136, (6), 1192-1198 (2011).
  56. Mid-infrared microspectroscopic imaging with a quantum cascade laser. Yeh, K., Schulmerich, M., Bhargava, R. Next-Generation Spectroscopic Technologies VI, 8726, 87260E (2013).
  57. Brandstetter, M., Volgger, L., Genner, A., Jungbauer, C., Lendl, B. Direct determination of glucose, lactate and triglycerides in blood serum by a tunable quantum cascade laser-based mid-IR sensor. Appl. Phys. B. 110, (2), 233-239 (2013).
  58. Martin, M. C., et al. 3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography. Nat Meth. 10, (9), 861-864 (2013).
  59. Kwon, B., et al. Infrared microspectroscopy combined with conventional atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 116, 56-61 (2012).
  60. Marcott, C., et al. Nanoscale infrared (IR) spectroscopy and imaging of structural lipids in human stratum corneum using an atomic force microscope to directly detect absorbed light from a tunable IR laser source. Exp Dermatol. 22, (6), 419-421 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics