Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

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Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

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Abstract

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) spektroskopischen Bildgebung ist eine neue Herangehensweise, um detaillierte Bilder, die biochemische Information verbundenen erhalten. FT-IR-Bildgebung von Gewebe beruht auf dem Prinzip, daß unterschiedliche Bereiche der mittleren Infrarot durch unterschiedliche chemische Bindungen (z, C = O, CH, NH) innerhalb von Zellen oder Gewebe, die dann auf die Anwesenheit und Zusammensetzung beziehen absorbiert basierend von Biomolekülen (zB Lipide, DNA, Glycogen, Protein, Kollagen). In einem FT-IR-Bild jedes Pixel in dem Bild umfasst eine gesamte Infrarot (IR) -Spektrum, das Informationen über die biochemische Status der Zellen, die anschließend zur Zelltyp oder krankheits Typisierung genutzt werden können geben. In diesem Beitrag zeigen wir: wie man IR Bilder von menschlichen Geweben mit einem FT-IR-System zu erhalten, wie Sie vorhandene Instrumente zu modifizieren, um für hochauflösendes Imaging-Funktionen zu ermöglichen, und wie die FT-IR-Bilder zu visualisieren. Wir stellen dann einige Anwendungen der FT-IRfür Pathologie mit der Leber und Niere als Beispiele. FT-IR-Bildgebung hält spannende Anwendungen bei der Bereitstellung einer neuartigen Zugang zu biochemischen Informationen aus Zellen und Gewebe in einem völlig markierungsfreie störungsfreie Weg zu geben neue Einblicke in biomolekulare Änderungen im Rahmen von Krankheitsprozessen zu erhalten. Darüber hinaus kann diese biochemische Information potenziell ermöglichen objektive und automatisierte Analyse bestimmter Aspekte des Krankheitsdiagnose.

Introduction

IR-Spektroskopie ist ein Analyseinstrument seit den 1930er Jahren in irgendeiner Form; es ist jedoch nur innerhalb der letzten zehn Jahre, dass der Bereich der Gewebebildgebung mit FT-IR explodiert gewesen. 1) erhöhte Geschwindigkeit der Datenerfassung durch die Verfügbarkeit großer Focal Plane Array (FPA) Detektoren, die haben in der Regel Tausende von IR-empfindliche Detektoren 1: Die Fortschritte in der FT-IR für Tissue Imaging haben in einem großen Teil durch drei wesentliche Entwicklungen getrieben , 2, 2) Entwicklung fortschrittlicher Verarbeitungsalgorithmen und Rechenleistung, große hyperspektralen Daten verarbeiten Sätze 3 und 3) Modellierung der FT-IR-Bildgebungssysteme, um die räumliche Auflösung 4,5 maximieren. Es gab zahlreiche qualitativ hochwertige und sehr umfangreiche Artikel Überprüfung der Bereich der FT-IR-Spektroskopie kürzlich 6-16, neben einem Natur Protokolle Papier, das die Schritte zum Punkt Spektren oder Karten aus dem Gewebe 17 zu erhalten Details. In dieser Arbeit werden wir uns auf die prot konzentrierenocol um Bilder von Geweben mit einem 128 x 128 FPA-Detektor in einer modifizierten FT-IR-System mit High-Definition-Fähigkeiten zu erhalten.

FT-IR-Bildgebung ist seit langem vorgeschlagen worden, auf Grund der Möglichkeit, Bilder, in denen jedes Pixel hat eine Fülle von biochemischen Informationen zu erhalten, um ein möglicherweise wünschenswert für Zell- und Gewebebildgebung ist. FT-IR-Bildgebung beruht auf dem Prinzip, daß verschiedene Biomoleküle in der Probe quantitativ zu absorbieren unterschiedliche Regionen des mittleren Infrarot; Dies ermöglicht die Ableitung eines "biochemischen Fingerprint. Dieser Fingerabdruck war in vielen Studien gezeigt, dass zwischen den verschiedenen Zelltypen und Krankheitszustände zu verändern. Anders als bei herkömmlichen Praxis für Pathologie, wo Flecken und immunhistochemischen Marker müssen verwendet werden, um sichtbar zu machen und zu identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, die verwendet werden, um die Diagnose und Behandlungsmöglichkeiten zu führen, werden die Bilder von FT-IR basierend auf der inhärenten Biochemie des Gewebes gebildet. Die aktuelle technique der Färbung Gewebe für die Diagnose ist zeitaufwändig, zerstörerisch, mühsam und erfordert subjektive Expertise des Pathologen, während FT-IR bietet das Potenzial dieser Prozess schnell, zerstörungsfrei, hochautomatisierten und objektiver zu gestalten. Zusätzlich stellt FT-IR einen neuen Weg zur Erlangung zusätzlicher biochemischer Informationen, die nicht leicht zugänglich sein können mit herkömmlichen Färbetechniken.

Eine der aufregendsten Entwicklungen in den letzten Jahren war die Verfügbarkeit von hochauflösenden bildgebenden Methoden, die jetzt für die Visualisierung und Charakterisierung von Zelltypen und Gewebestrukturen, die für die umfassende Diagnose von Krankheiten sind erlauben können. Eine dieser Techniken ist für abgeschwächte Totalreflexion (ATR), FT-IR, die eine feste Immersionslinse (SIL) mit einem hohen Brechungsindex, der für eine hochauflösende Abbildung 18 ermöglicht, wobei viele sehr aufregende Studien zeigen ihre Anwendungen 19-25 enthält. Darüber hinaus ist es wwie kürzlich gezeigt, dass die erhöhte räumliche Auflösung mit ATR-Bildgebung verbunden sind, können für die Visualisierung und Klassifizierung von endothelialen und Myoepithelzellen im Brustgewebe, die eine Schlüsselkomponente der Brustkrebsdiagnose 26 bilden können. Während ATR-Bildgebung ist sehr nützlich, erfordert diese Technik die SIL den Kontakt mit dem Gewebe, um FT-IR-Bilder zu bilden zu machen; daher ist ihre Verwendung etwas für Gewebepathologie denen große Bereiche der Gewebe müssen schnell abgebildet werden begrenzt.

Ein zweiter Ansatz wurde durch Kuppeln einer hohen linearen Ziels an eine vorhandene FT-IR-System, das eine Synchrotronstrahlung als helle Quelle von IR verwendet gezeigt, ist es möglich, vollständig zu beleuchten eine FPA und Bild mit einer effektiven Pixelgröße von 0,54 x 0,54 um. Dies ermöglichte es uns, Schlüsselstrukturen in Brust- und Prostatagewebe, die nicht auflösbar mit herkömmlichen FT-IR-Systeme 4 wurden zu visualisieren. Während dieser dramatischen Anstieg der IR-Bild räumliche resolution waren aufregend, seine Verwendung blieb aufgrund eines Synchrotron erfordern begrenzt. Anschließend wurde ein optimales System entwickelt, die auch für High-Definition-Imaging-Funktionen mit einem 1,1 x 1,1 um Pixelgröße, ohne das Erfordernis einer Synchrotronquelle, sondern mit einem herkömmlichen Globar IR-Quelle 5 ermöglichen kann. In diesem Artikel zeigen wir, wie Sie ein bestehendes Handels FT-IR-Bildgebungssystem für beugungsbegrenzte IR Bildgebung von Gewebe mit einem akzeptablen Signal-Rauschverhältnis mit mehreren IR-Ziele (15X, 36X und 74X) erlauben zu ändern. Die effektive Pixelgröße mit den drei Zielen ist 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) und 1,1 x 1,1 um (74X). Wir geben dann einige Beispiele für die Bedeutung der Gewinne in der räumlichen Auflösung für die Erkennung von Krankheiten in Leber- und Nierenbiopsien 27.

Protocol

1. Einrichtung eines FT-IR-Mikroskop und Erwerb Tissue Bilder

  1. Abschnitt ein Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeblock bei 4 & mgr; m Dicke auf, um einen IR-kompatibel Rutsche mit einem Mikrotom. Alternativ Abschnitt ein mit flüssigem Stickstoff gefrorenen Gewebe bei 4 & mgr; m Dicke auf einem IR-kompatiblen Objektträger unter Verwendung eines Kryostaten.
    HINWEIS: In der Regel wird eine serielle Abschnitt ebenfalls auf einem Glasträger erworben und angefärbt mit einem speziellen (wie Hämatoxylin und Eosin (H & E)) oder immunhistochemische Färbung kommen. Zusätzlich können kultivierte Zelllinien auf IR kompatibel Trägern gezüchtet werden. IR kompatibel Dias IR reflektierenden Folien für Reflexionsmodus Bildgebung (zB mirrir Rutsche, Gold) oder IR-transparente Folien für den Transmissionsmodus Bildgebung (zB BaF 2, CaF 2).
  2. Spülen Sie die FT-IR-Mikroskop und Spektrometer entweder mit trockener Luft oder trockenem Stickstoff auf atmosphärischen Wasser aus dem System zu entfernen. Warten Sie mindestens 45 Minuten vor der Belichtung, um eine gründliche PURG gewährleistene.
  3. Kühle sowohl die FPA-Detektor (bis 79 K) und der Innen MCT-Detektor in der FT-IR-Mikroskop unter Verwendung von flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Detektoren etwa alle 6 Stunden.
    VORSICHT! Flüssiger Stickstoff ist ein Tieftemperaturfluid und kann Kaltverbrennungen, Erfrierungen und in geschlossenen Räumen Ersticken verursachen.
  4. Befestigen Sie den Probenobjektträger auf dem Mikroskoptisch für FT-IR-Bildgebung.
  5. Stellen Sie sicher, das sichtbare Licht ist "ON" und dann entweder mit dem Fernglas oder die Probe-Capture-Programm (die eine Echtzeit-sichtbares Bild des Gewebes bietet), den Schwerpunkt auf die Probe.
  6. Öffnen Sie das Bundle Software-Paket wie Entschließungen Pro und klicken Sie auf "Collect" und klicken Sie auf "Diagnose" und wählen Sie "Ausrichten Spectrometer". Sicherzustellen, dass der Strahlengang des Spektrometers internen Detektor nicht behindert wird.
  7. Klicken Sie auf "Bildeinstellungen".
  8. Auf der Registerkarte "Electronics", wählen Sie die entsprechende "Speed", "Unter Sampling Ratio (UDR) "und" Filter "Einstellungen je nach System.
    HINWEIS: In diesem Beispiel ist die Einstellung Geschwindigkeit = 2,5 KHz, UDR = 4 und Filter = Keine.
  9. Auf der Registerkarte "Optics" sicherzustellen, dass "Mid-IR-Quelle", "Offene Blende" und "100% Strahlabschwächer 'ausgewählt sind.
  10. Um an der "Optics" Registerkarte, wählen Sie "Detector" als "Masse" Kalibrierung des Systems, "Microscope Detector" als "links", und wählen Sie entweder "Durchlässigkeit" oder "Reflexion" unter "Optik-Modus ', je nach Art von schieben verwendet.
  11. Klicken Sie auf Setup, die das Fenster 'Lancer Control' eröffnen wird.
    HINWEIS: Bei Reflexion folgen Sie den Anweisungen in 1,12 und 1,13 und für Übertragungsmodus folgen Sie den Anweisungen in 1,14-1,16. Weiter von 1,17 sowohl für Reflexion und Transmission.
  12. Für Reflexionsmodus in &# 8216; 'auf' Raw 'Lancer Control. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich auf der Folie.
  13. Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Anschließend bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes. Ändern "Wärme" und "Kontrast" Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren, wird dies keinen Einfluss auf die IR-Daten haben. Weiter 1,18.
  14. Für Übertragungsmodus, in klicken Sie auf 'Lancer Control' auf 'Raw'. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich des Objektträgers.
  15. Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte.
  16. Stellen Sie die untere Schwerpunkt / Kondensator Ziel, die Anzahl der Zählungen seiner Maximu erhöhenMeter Sehen Sie sich die Form der unteren rechten Bild in Lancer Kontrolle, um sicherzustellen, dass es Gauß in Aussehen und relativ einheitlich ist. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte.
    HINWEIS: Wenn eine der Bildpunkte in der FT-IR-Bild Interferogramm weiß werden, reduzieren Sie die Integrationszeit.
  17. Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden und perfekt den Fokus des Bildes. Optional können Sie die Wärme und Kontrast Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentriert, aber keine Auswirkungen auf den IR-Daten haben.
  18. Mit der Bühnensteuerung Joystick bewegen, um einen reinen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche "Kalibrieren". Stellen Sie sicher, die "Out Of Range (OOR)" Wert unter 50 und der Unterschied zwischen der 'High Flux "und" Low Flux "zählt mindestens 4000 zählt.
  19. Wählen Sie zweimal auf "OK". In der Optik Registerkarten auszuwählen; "Detector" = "MCT", "Microsbewältigen Detector '=' Rechts 'und klicken Sie auf "Setup". An diesem Punkt wird es eine FT-IR-Interferogramm auf dem Bildschirm sein. Klicken Sie auf 'Suchen Center'. Klicken Sie auf "OK".
  20. Auf der Registerkarte "Optics", wählen Sie erneut "Detector '=' Masse ',' Mikroskop Detector '=' Links 'und wählen Sie" Setup ".
  21. In Lancer Steuerung - sicher, das Bild immer noch auf eine saubere Fläche und klicken Sie auf "Kalibrieren" erneut. Klicken Sie auf "OK".
  22. Als nächstes sammelt ein Hintergrundbild FT-IR zur Absorption aus der Atmosphäre, und Einschub korrigieren. Öffnen Sie die Registerkarte "Electronics" und wählen Sie eine geeignete spektrale Auflösung, in der Regel von 4 cm -1 oder 8 cm -1 für Gewebe.
  23. Öffnen Sie die Registerkarte "Hintergrund" und geben Sie 128 in 'Scans zusammen hinzufügen'. Wählen Sie die "New File ... 'Taste und legen Sie die Hintergrunddatei in entsprechende Falteäh. Registerkarte "Imaging", um sicherzustellen, Mosaik 1 durch 1. Klicken Sie auf "Hintergrund" Überprüfen Sie, warten Sie, bis der Scanvorgang beenden und bestätigen Sie, wo die Datei gespeichert werden. Klicken Sie auf eine Region auf dem Hintergrund FT-IR-Bild und überprüfen Sie das Spektrum.
  24. Um eine große Mosaikbild der Probe zu nehmen, wählen Sie die Registerkarte "Imaging" und die Anzahl der X- und Y-Rahmen-Einsatz für das Mosaik Größe, die Sie erwerben möchten.
  25. Klicken Sie auf "Setup" und im Lancer Steuerung verwenden Sie die Live-IR im Hinblick auf den Bereich von Interesse zu finden. Wenn die ein Mosaik, zentriert den Live-Feed in der Mitte der Bereich von Interesse. Klicken Sie auf "OK". Öffnen Sie die Registerkarte "Electronics" und geben Sie die Anzahl der Scans zusammen hinzufügen (typischerweise einen Wert zwischen 2 und 16 Scans für Gewebe). Klicken Sie auf Durchsuchen.
  26. Überprüfen Sie die gesammelten Bild FT-IR auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass es fokussierter aussieht. Klicken Sie auf das Bild nach oben von diesem Standort zu bringen, ein IR-Spektrum und überprüfen Sie, dass es aussieht, um ein akzeptables Signal-Rausch haben. AcquiRe ein sichtbares Bild der Probe.
  27. Speichern Sie das Bild und exportieren Sie auf das gewünschte Format, wie ENVI-IDL.

2. Die Anpassung eines FT-IR-Mikroskop für HD-Fähigkeiten

HINWEIS: Die meisten FT-IR-Systeme sind mit einer Objektiv etwa 15-facher Vergrößerung und 0,5 numerische Apertur (NA) versehen. Um das Bild in High-Definition-Modus kann ein IR-kompatibel 36X oder 74X Ziel verwendet werden, um Beugungs geben begrenzte Imaging-Funktionen werden.

  1. Entfernen 15X Zielsetzung dieses Systems durch Herausdrehen gegen den Uhrzeigersinn.
  2. Schrauben Sie entweder in der 36X oder 74X Ziel an seinem Platz. Richten Sie das Ziel vor dem Gebrauch. Verwenden Sie Objektivverlängerungsrohre das Ziel nahe genug, um die Probe zu bringen.
  3. Zeigen Gewebe unter dem neuen Ziel und Fokus mit sichtbarem Licht entweder das Fernglas oder Proben Capture-Programm.
    Hinweis: Neben einem HD-Imaging muss in Übertragungsmodus durchgeführt werden. Die sehr enge Arbeitsabstand von derse Ziele (1-2 mm) und sehr flache Schärfentiefe erfordert langsam und vorsichtig konzentrieren, die Zeit nehmen, um das Ziel, ohne die Probe zu berühren zu senken.
  4. Folgen Sie den Anweisungen von 1,6 bis 1,11.
    HINWEIS: Aufgrund signifikant schwieriger zu konzentrieren und weniger Licht den Detektor erreicht, wird das folgende Protokoll basierend auf 1,14 eingestellt.
  5. Im Übertragungsmodus, klicken Sie auf "Raw". Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), um das Gewebe zu bewegen und sich (im Idealfall auf einer Kante).
    Hinweis: Dies kann schwierig sein, daher die "Wärme" und "Kontrast" Optionen einstellen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren (diese Optionen nicht auf der IR-Daten betreffen).
  6. Einmal ausgerichtet, mit dem Bühnensteuerung Joystick und die Live-Ansicht IR Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Stellen Sie die untere Fokussierobjektiv zuErhöhung der Anzahl von Zählungen auf seinen Maximal. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte.
  7. Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes.
  8. Wenn Mosaikieren ein Bild mit einer hohen Auflösung, passen Sie die Bühne, um die korrekte Bewegung über Entfernungen für genaue Mosaik erforderlich ermöglichen. Um die Bühne Abstand Einstellungen zu ändern, gehen Sie auf "Setup-Phase" in Lancer Steuerung und stellen Sie die horizontale und vertikale Ausrichtung Einstellungen zur korrekten Mosaik ermöglichen.
  9. Mit der Bühnensteuerung Joystick Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche "Kalibrieren". Stellen Sie sicher, die außerhalb des Bereichs (OOR) Wert kleiner als 50 für beide 36X und 74X Ziele. Achten Sie darauf, die Differenz zwischen dem Hochfluss und Low Flux-Werte mindestens 1000 zählt für die 74X Objektiv und 2000 zählt für die 36X Ziel.
  10. Weiter 1,19-1,27. Die Anzahl der Abfragen in 1.23 und1.25 müssen aufgrund der reduzierten Signal auf ca. 256 Scans für das Hintergrundbild und 16 bis 128 Scans für das Gewebebild eingestellt werden.

3. Visualisieren und Klassifizieren IR Spectral Datensätze

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden wir besprechen, wie die Visualisierung und Extrahieren von Daten aus spektrale Bilder mit Geo-Bildverarbeitung und Analyse-Software wie ENVI + IDL, aber der Prozess ist für jede alternative Software wie MATLAB, freie Software wie CytoSpec sehr ähnlich oder des Instruments Entwickler eigene Software. Es gibt einige unterschiedliche spektrale Verarbeitungstechniken, die auf der IR-Daten durchgeführt werden kann.

  1. Open Geospatial Bildverarbeitung und Analyse-Software und laden Sie die IR-Datendatei.
  2. Tragen Sie eine Basislinienkorrektur-Algorithmus auf die IR-Daten, indem Sie "Spectral-Tools" und blättern Sie nach unten und klicken Sie auf "Absorptionsspektren". Ein Pop-up-Menü Beobachten und wählen Sie "Baseline correction "
    HINWEIS: Basislinienkorrektur wird eine Baseline Offset Steigung aus den Daten durch Streuung entfernen
  3. Führen Spectral Normalisierung durch Verhältnisbildung der Daten zu einer bestimmten spektralen Spitze (typischerweise Amid I (1650 cm -1) oder Amid II (1550 cm -1)) bzw. Fläche unter einem definierten Bereich des Spektrums. Wählen Sie dazu "Normalspektren" unter den "Absorptionsspektren" Menüoptionen.
    HINWEIS: Spectral Normalisierung so durchgeführt, daß die Unterschiede in den Spektren sind real biochemischen Unterschiede und nicht in Folge der Dicke und Dichte der Unterschiede zwischen den Proben.
  4. Verwenden Sie ein Geräuschreduktionsalgorithmus, um Lärm von der Spektren falls 28 zu entfernen.
    HINWEIS: Es gibt mehrere Ansätze zur Verfügung, mit dem Basislinienkorrektur, spektrale Normalisierung und Rauschunterdrückung erreicht werden kann, wobei die meisten Software, die automatisierte Algorithmen eingebaut Darüber hinaus gibt es ein aufstrebendes Reihe von Ansätzen, die für die Korrektur wird.spektrale Abweichungen, die im Detail 29-42 diskutiert wurden; Allerdings hat die Gemeinschaft noch nicht einigen, welche von diesen benötigt werden.
  5. Beobachten einer Liste aller IR-Frequenzen innerhalb des Bildes (typischerweise von einem Spektralbereich von 900 bis 4000 cm -1) gesammelt. Klicken auf den Frequenzen, die auf bestimmte Biomoleküle entsprechen, um ein Bild des Gewebes bei der ausgewählten Frequenz zu beobachten.
    1. Klicken Sie beispielsweise auf 1650 cm -1 Band um die Verteilung der Proteine ​​in der Probe zu beobachten. Alternativ klicken Sie auf 1080 cm -1 Band um die Verteilung der Nukleinsäuren in der Probe zu beobachten. Verwenden Wellenzahl 1650 cm -1.
  6. Erstellen Sie zusätzliche Bilder durch die Berechnung Spektralspitze Höhenverhältnisse, Peakflächenverhältnisse usw., die für die Visualisierung verschiedener biomolekularer Komponenten ermöglicht. Klicken Sie auf "Spectral Extras" und wählen Sie dann entweder "Peakhöhe Verhältnisse" oder "Berechnen Bildbereich 'um Bilder zu erstellen.
  7. Scannen Sie den entsprechenden benachbarten Gewebeschnitt, die befleckt mit einem separaten gesamte Dia-Imager-System, das Hellfeld Bilder erfasst wird. Neben dem Infrarotbild, um das digitale Bild des gefärbten Gewebe mit einer sichtbaren Bildprogramm.
  8. Rechtsklicken Sie auf das Bild, um einen interessierenden Bereich und wählen Sie "Z-Profil". Dies gibt die spektrale Information zu dem ausgewählten Pixel.
  9. Schauen Sie sich die IR-Spektren von mehreren Pixeln aus mehreren Klassen, wie zum Beispiel den Vergleich Zelltypen, Krankheitszuständen. Mark spezifischen Pixel auf dem Bild mit dem "Regions Of Interest" (ROI) Tool. Um dies durchzuführen, klicken Sie rechts auf das Bild und wählen Sie "ROI-Tool '. Erstellen Sie die Klassen, die gekennzeichnet sind, zum Beispiel normal, Dysplasie und Krebs-Klassen. Wählen Sie dann "ROI-Typ" - "Point". Wählen Sie dann die Klasse, um Pixel zu wählen und stützen sich auf die entsprechenden Pixel auf dem IR-Bild. Leiten Sie die durchschnittlichen Spektren foder jede der Klassen mit dem "Durchschnitts ROI 'Werkzeug.
  10. Vergleichen abgeleiteten Spektren durch Auftragen in Grafik-Software.

Representative Results

FT-IR-Bildgebung ermöglicht die Ableitung der IR-Bilder von Gewebe, das Kontraststufen in Abhängigkeit von der IR-Frequenz von Interesse geben. Zusätzlich ist in einem IR-Bild, nimmt die gesamte IR-Spektrum für jedes Pixel, mit unterschiedlichen Peaks, die den verschiedenen Biomolekülen, die Informationen über die biochemischen Eigenschaften von Zelltypen oder Krankheitszuständen (Abbildung 1) geben kann. Hier haben wir gezeigt, wie man spektralen Signaturen zwischen den Klassen zu vergleichen, jedoch erweiterte automatisierte Klassifizierung ist möglich durch zusätzliche Algorithmen 3,43-50 wie Bayes-Klassifizierung, Random Forests, Künstliche Neuronale Netze und Hierarchische Clusteranalyse kann auf die durchgeführt werden, haben Daten. Wachte Klassifizierung Ansätze für die Konstruktion eines Klassifizierers, die ausgebildet ist, um für die automatische Erkennung von Zelltypen oder Krankheitszustände zu ermöglichen ermöglichen. Unüberwachten Klassifizierung Ansätze können verwendet werden, um natürlich vorkommende dif suchenKonferenzen in Gewebe oder Zellen durch biochemische Varianz.

FT-IR-Messtechnik hat sich in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt, aus der Messung in einem einzigen Punkt / Abbildungsmodus mittels IR undurchsichtig Öffnungen Abbildungsmodus mit Cassegrain Ziele, wobei entweder eine Beleuchtungsobjektiv gekoppelt mit einem Sammelziel der Übertragungsmode oder einer einzigen Objektiv daß beide optisch und sammelt sich in Reflexionsmodus (Abbildung 2). Kürzlich wurde gezeigt, daß das Sammelziel im Transmissionsmodus kann für eine höhere Vergrßerung und numerische Apertur Ziel geschaltet werden, um für die Beugung begrenzten IR-Bildgebung, die zu einer beträchtlichen Erhöhung der räumlichen Auflösung des gesammelten IR-Bilder 4,5 führt zu ermöglichen. Die Fortschritte in der räumlichen Auflösung für eine Gewebe Bildgebung von entscheidender Bedeutung gewesen, da wir nun die Funktionseinheiten der Niere Glomeruli identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, beispielsweise unter Verwendung von in-house angepaßtFT-IR-Systeme (Figur 3).

Neben einem HD-FT-IR-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Bilder von Gewebe untersucht, um anomale Regionen zu identifizieren und biochemischen Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen zu identifizieren. Bei einer Lebergewebe Kern ist es möglich, Hepatozyten und Regionen infiltrierenden Fibrose, die zwei verschiedene Bereiche von Dysplasie und nicht-dysplastischen Zirrhose (Figur 4) trennt visualisieren. Wir arbeiten daran, diese dazu bei, automatisierte Diagnose-Tools für den Einsatz in schwierigen Fällen von Lebererkrankungen zu nutzen.

Wichtig ist, dass die erhöhte räumliche Auflösung nun ermöglicht es uns, bestimmte strukturelle Merkmale, die durch Krankheit chemisch modifiziert werden kann, bevor histologischen Veränderungen erkennbar sind, zu isolieren. Zum Beispiel haben wir die Identifizierung biochemischen Veränderungen in der Niere Glomeruli wie die Bowman-Kapsel, mesangium, glomerulären Basalmembran und Rohr Basalmembran fokussiert werden, bevor Änderungen durch den Pathologen identifiziert beobachtet werden (Abbildung 5). Insbesondere interessieren wir uns bei der Identifizierung von Änderungen mit dem Fortschreiten der diabetischen Nephropathie und chronischer Abstoßung bei Transplantationspatienten, in denen aktuelle Techniken nicht zu Änderungen in einem ausreichend frühen Mode für erfolgreiche Intervention zu identifizieren verbunden.

Figur 1
Abbildung 1: FT-IR-Spektrum von Bildern und von einer Leberkern. Bild von (A) H & E gefärbten Kern von Leberbiopsie und Bilder der IR-Absorption der Serienschnitt der gleichen Kern an (B) 3286 cm -1 und (C) 2603 cm -1, die unterschiedliche Strukturmerkmale hervorgehoben. (D) Typische IR-Spektrum von Gewebe, mit bedeutenden Peaks markiert. Balken = 100 um.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2 schema Optics Detaillierung FT-IR-Mikroskop Betriebsarten. (A) In-Übertragungsmodus wird die Probe durch den Boden Ziel beleuchtet, und das Licht durch die Probe durch die obere Objektiv gesammelt. (B) Im Reflexionsmodus dient das vorrangige Ziel, sowohl die Probe zu beleuchten und das reflektierte Licht zu sammeln. Die untere Ziel nicht verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Vergleich der different Mikroskopobjektive auf FT-IR-Bild einer Niere Glomeruli bei 2925 cm -1. (A) 15X Sammeln Objektiv mit NA = 0,5 (5,5 x 5,5 um Pixelgröße). (B) 36X Sammelobjektiv mit NA = 0,5 (2,2 x 2,2 um Pixelgröße). (C) 74X Sammeln Objektiv mit NA = 0,65 (1,1 x 1,1 um Pixelgröße). Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Spektrale Unterschiede zwischen Fibrose und Leberzellen in der Leber Kern. (A) H & E gefärbten Kern von Leberbiopsie. (B) Bild einer Serienteil Kern in FT-IR gescannt (36X Ziel Setup). (C) Repsentativ Spektren von Hepatozyten und Fibrose, aus Regionen von Gewebe durch die Pfeile in (A) angegeben entnommen und (B). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Differenzierung der Nierengewebebiopsie Funktionen durch den Einsatz von High-Definition-FT-IR-Bildgebung. (A) Periodic-Acid-Schiff gefärbt Abschnitt mit den Merkmalen extrahiert gekennzeichnet werden. (B) einen HD-FT-IR-Bild der CH 2 asymmetrische Streckbereich (36X Ziel Setup) eines Serienschnitt des gleichen Gewebes. (C) Eigenschaften in (A) unter Verwendung des FT-IR-Bild (B) in der Lage, chemisch dif sein extrahiertes markierteszieren die vier Merkmale des Gewebes. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

FT-IR ist ein aufstrebendes Modalität für markierungsfreie biochemischen Bildgebung von Gewebeschnitten, mit dem Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der aktuellen Standard der Diagnose in der Pathologie haben. Der aktuelle Gold-Standard für Pathologie erfordert Gewebe biopsiert werden, in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mehrfach geschnitten und mit mehreren Färbemitteln angefärbt. Eine gut ausgebildete Pathologen muss subjektiv visuell beurteilen die Gewebestruktur und Zellmorphologie, um eine Diagnose zu bestimmen. Hier zeigen wir, wie man hochauflösende IR-Bilder zu sammeln aus der gleichen Art von Teilen und diskutieren einige der computergestützten Ansätzen zur chemischen Unterschiede zwischen Zelltypen und Krankheitszuständen zu untersuchen.

Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind, um sicherzustellen, dass das Gewebe sehr sorgfältig ausgerichtet, und dass das System gut kalibriert ist, um eine sehr hohe Qualität spektroskopischen Daten zu gewährleisten. Die Sorgfalt bei der Einrichtung des Systems ist besonders kri cal beim Arbeiten mit stark vergrößernden Objektiven. Um bei der Fehlersuche, die folgende Liste deckt einige der potenziellen Schwierigkeiten;

Problem: Niedrige IR-Intensität bei der Abbildung in der Reflexion. Lösung: Überprüfen Sie IR-Folie-Ausrichtung wie die reflektierende Beschichtung kann auf der falschen Seite der Folie ist.

Problem: Low-Signal / rot Warnzeichen in Lancer Control. Lösung: Kühle Detektoren mit LN2. Flüssiger Stickstoff wird für die FPA Melder funktionieren erforderlich und erfordert regelmäßig nachgefüllt wird.

Problem: Geschwindigkeit Fehler / Bewegungsfehler. Lösung: Setzen Sie Spektrometer und Vibrationen zu reduzieren. Vibrationen bewirkt, dass der bewegliche Spiegel in dem Interferometer gestört werden.

Problem: Die Wasserdampfspitzen Daten. Lösung: Erhöhen Sie auf Purge-System und Probe aus der Luft zu schützen.

Problem: Ungültige Center. Lösung: Suchen Center erneut.

e_content "> Problem. Niedrige Flussdifferenz Übertragung, obwohl fokussiert. Lösung: Anpassen Sumpfkondensator Dies wird auftreten, wenn das IR-Licht wird nicht bis zu einem Punkt auf der Probe fokussiert.

In dieser Arbeit haben wir, wie hochauflösenden IR-Bilder von Gewebe entweder in Transmission oder Transflektanzbetriebsweise erwerben konzentriert. Die Natur des FT-IR-Bildgebung besteht darin, dass es mehrere Modifikationen, die an der Datenerfassungs gemacht werden können, wie zum Beispiel, die Art des Substrats, Fixiertechnik, Probendicke, Spektralauflösung Interferometerspiegel Geschwindigkeit etc. Die Wirkung dieser Parameter aufweist kürzlich 4,5,17,51 in umfangreichen ausführlich diskutiert.

Es gibt eine Reihe von Modifikationen, die an dem Bilderzeugungssystem mit Bilderzeugungs in ATR Modus 10,24,26 und nanoskalige thermische Ansätze 52,53 für hochauflösende IR Imaging ermöglichen gemacht werden können. Die wichtigste Einschränkung mit hoher Auflösung IR-Bildgebung ist, dass der tiHEMEN muss sorgfältig vorbereitet werden und dünn genug für IR durch (typischerweise 4 & mgr; m Dicke) bestehen. Zusätzlich Transmission und Reflexion FT-IR-Abbildungs ​​erfordert die Proben trocken sein aufgrund der Absorption des IR von Wasser. Jedoch weist FT-IR-Abbildungs ​​signifikante Vorteile gegenüber anderen Techniken, da sie sehr schnell große Flächen von Gewebe bei der Ableitung reichen und detaillierten biochemischen Informationen. Andere ähnliche Techniken, die in einer markierungsfreien Mode biochemische Information abzuleiten schließen Raman-Spektroskopie, wird jedoch die Zeit der Datenaufnahme ist viel langsamer, um Bilder zu erfassen. New Raman Imaging Ansätze entstehen, einschließlich stimulierter Raman-Streuung (SRS) und Coherent Antistokes Raman-Streuung (CARS); sie haben jedoch Zugang begrenzten Spektralbereich oder Einzelfrequenz-Bildgebung.

Die Fortschritte in der Geschwindigkeit der Datenerfassung, räumliche Auflösung, und die Verfügbarkeit von Rechen Ansätze von unschätzbarem Wert bei der Herstellung von FT-IR imag gewesening ein praktikabler Ansatz für die Übersetzung als neuen Imaging-Tool in der Pathologie. Die jüngsten Fortschritte in der räumlichen Auflösung, besonders wichtig für die Gewebepathologie wurde durch Tastenzelltypen nicht in der auflösbaren Verwendung herkömmlicher FT-IR-Abbildungssystemen. Die jüngste Veröffentlichung von Reddy et al. gezeigt, wie ein ideales System die optimale räumliche Auflösung eines FT-IR-Abbildungssystem 5 erhalten modellieren. Das Nierengewebe beispielsweise in diesem Papier zeigt, wie wichtig eine höhere räumliche Auflösung, um die biochemischen Informationen aus glomeruläre Strukturen (Abbildung 3 und Abbildung 5) zu extrahieren. In der Zukunft, neue Fortschritte in der Quantenkaskadenlaser, wie sehr helle IR-Lichtquellen 54 bis 57, 3D Spectral Imaging 58 und Durchbrüche im Bereich der nanoskaligen IR Technologien 52,53,59,60 halten spannende neue Wege der Forschung, die möglicherweise enorme Auswirkungen in der Zukunft von Gewebe-Bildgebung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
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