Murin Isolerad Hjärta Modell av Myocardial Fantastisk associerade med kardioplegisk Arrest

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cordeiro, B., Clements, R. Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest. J. Vis. Exp. (102), e52433, doi:10.3791/52433 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Följande protokoll är till nytta för utvärdera nedsatt hjärtfunktion eller hjärt fantastiska följande moderata ischemiska förolämpningar. Tekniken är användbar för modellering ischemisk skada i samband med ett stort antal kliniskt relevant fenomen inklusive hjärtkirurgi med kardioplegiska gripande och hjärt-bypass, off-pump CABG, transplantation, angina, kort ischemi, osv. Protokollet visar en generell metod för att modellera hypotermi hyperkalemisk kardioplegiska gripande och reperfusion i gnagare hjärtan med fokus på mätning av hjärtmuskelsammandragningsfunktion. I korthet, en mus hjärta perfusion i Langendorff läge, instrumenterade med en intraventrikulär ballong, och initial hjärt funktionella parametrar registreras. Efter stabilisering, är hjärtat sedan föremål för korta infusion av en hjärtskyddande hypotermisk kardioplegilösning att inleda diastoliskt stillestånd. Kardioplegi levereras intermittent över 2 timmar. Hjärtat sedan reperfuseras och warmed till normotermisk temperaturer och återvinning av hjärtmuskelfunktionen övervakas. Användning av detta protokoll resulterar i tillförlitlig deprimerad hjärtsammandragningsfunktion fri från grov myocardial vävnadsskada hos gnagare.

Introduction

Myokardial bedövning definieras som reversibel minskad kontraktil aktivitet trots återställning av tillräckligt blodflöde efter en kort period av ischemi eller utdragna perioder av ischemiska skador med kardioprotektion 1,2,3,4,5. Den metod som presenteras är specifikt används för att modellera kliniskt relevanta ischemiska förolämpningar som kan resultera i reversibla försämringar i kontraktil funktion (dvs ischemiska förolämpningar i samband med hjärtkirurgi utnyttjar kardioplegisk stillestånd, korta perioder av ischemi, angina, etc.). I motsats till svåra ischemi studier (hjärtinfarkt, nekros) detta protokoll har utvecklats för att utvärdera hjärtinfarkt funktionell återhämtning och kardioprotektion utan vävnadsskada, ombyggnad, och celldöd. Majoriteten av uppsats diskuterar en standard kardioplegisk gripande protokoll med element liknande en hjärtkirurgi med användning hypotermi och intermittent kardioplegi leverans.

Myokardiell protvsnitt under större delen av hjärtoperationer förlitar sig på kardioplegi och hjärt-bypass. Även kardioplegi (CP) lösningar och strategier varierar kraftigt (blod, kristalloid, kallt, varmt etc.) de vanligaste elementen är 1) hyperkalemi och / eller andra strategier för att arrestera hjärtat i diastole, vilket begränsar energiutnyttjande till följd av hjärtmuskelsammandragning, och 2) hypotermi att bromsa ämnesomsättning och bidra till att upprätthålla ATP och andra energireserver medan greps. Nuvarande kardioplegi lösningar ger skydd till hjärtat mot ischemiska förolämpningar som annars skulle visa sig dödliga. Men hjärtskyddande strategier under kirurgiska ischemiska förolämpningar är inte perfekt, och den resulterande mild ischemisk skada kan leda till reversibel hjärtsammandragnings dysfunktion trots adekvat blodflöde (hjärtinfarkt bedövning), acidos, cardiomyocyte skador och kärleffekter inklusive minskad koronar perfusion och vasospasm.

Detta protokoll skiljer sigfrån vanliga isolerade hjärtischemimodeller utvärderar hjärtinfarkt och svår ischemi genom att den utvärderar mildare ischemiska förolämpningar som kan leda till nedsatt hjärtfunktion efter kort ischemi eller ischemiska förolämpningar i samband med kardioplegisk stillestånd. (För granskning på Langendorff perfusion tekniker och I / R studier se 6 - 8). För allmänna riktlinjer och en grundlig analys av experimentella parametrar i samband med mus isolerade perfunderade hjärtan se Sutherland e t al. 2003 9 Tekniken presenteras här detaljer nödvändig utrustning, reagenser, steg, strategier och tips för att på ett tillförlitligt sätt framkalla bedövning i mus hjärtan. Mindre modifieringar är nödvändiga för att tillämpa tekniken till råttor.

I korthet isolerade mus hjärtan är Langendorff perfunderades under ca 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit-buffert (KHB), följt av kall skyddade hjärtstillestånd genom tillförsel av en hyperkalemisk hypothermic kardioplegilösning. Efter gripandet, är hjärt funktionell återhämtning övervakas under återuppvärmning och reperfusion av hjärtat med KHB. Förändringar i graden av återvinning av hjärtsammandragningsfunktionen kan utvärderas för att bedöma hjärtskyddande medel och olika hjärtskyddande strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla förfaranden godkändes av livslängden Institutional Animal Care och användning kommittén och alla djur och förfaranden i enlighet med National Research Council Guide för skötsel och användning av försöksdjur 10.

1. Ballong Fabrication och vänsterkammartryckövervakning Circuit

  1. Konstrukt LV ballonger enligt Miller et al., 11 I en bägare med en omrörarstav, blanda 9,5 ml destillerat vatten, 14,2 ml ljus majssirap och 33,8 g sackaros, och värme på en varm platta, blanda tills sockret upplöses . Fortsätt värmelösning tills den når ungefär 150 ºC.
    OBS: Många metoder finns för att konstruera LV ballonger inklusive ändring av kondom tips och plastfolie konstruktion 9,12. Vi finner ovanstående metod att vara relativt lätt att konstruera läckagefria ballonger, men en fördel med plastfolie ballonger inkluderar tidigare karakterisering för lämplig frequency-responssamband 9.
  2. Bryt torra spaghetti strängar i bitar ca 5 cm i längd och doppa ena sidan av varje del ca 1 cm djupt in i sockerlösningen och sakta ut.
  3. Placera den torra änden av pastasträngen till ett polystyrenskum block och suspendera så mixen socker droppar ner och bildar en droppform mögel. Lämna O / N i en torkanordning så formen hårdnar.
  4. Följande dag, doppa formarna i silikon spridning gel. Placera pasta trådar tillbaka till polystyrenskum block och plats i aa 37 ºC ugn under 2 timmar eller tills den är torr. Upprepa det här steget en gång till så att två skikt av silikon tillämpas.
  5. När torr, till plats i vatten i flera timmar underlätta avlägsnandet av ballongen från formen. Förvara ballonger i 0,02% natriumazidlösning.
  6. Använd en 23 G blodinsamling inställd på att producera en skräddarsydd ballong kanyl genom att skära en nål för att skapa en trubbig spets och placera hack i nålen.
  7. Anslut slangen till ett tryck tränsproducent och spola med vatten samtidigt som slangar och kanylen helt nedsänkt för att förhindra att luft kommer in i systemet. Placera en ballong som har fyllts med vatten på kanylen och använda 2-0 silkessuturer att binda på kanylen. Test ballong med förmåga att upprätthålla trycket (~ 100 mmHg i minst 1 timme)

2. Beredning av isolerade hjärta Perfusion System

  1. Initialt, tvätta och värma systemet. Sätt på en 37 ° C varmt vattenbad cirkulator som har anslutits till Langendorff apparat, och fylla buffertreservoaren med destillerat vatten. Anslut en ny glasfiberfilter för slangar som strömmar in i anordningen och slår på pumpen för att spola ut systemet. Under prep tid övervaka temperaturen på vattnet ut från Langendorff blocket med hjälp av en temperaturgivare, för att säkerställa att vattenbadet är inställd korrekt. Dessutom, slå på en kyld cirkulationspump och inställd på 20 ºC som kommer att användas under kardioplegisk gripandet av hjärtat.
  2. Jagn under tiden förbereda följande lösningar. Bered en liter kardioplegilösning (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM NaHCOs 3) och filtrera. Också förbereda 2 liter KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,7 mM MgSO 4, 2 mM Na-pyruvat, 6 mM dextros, 24,9 mM NaHCOs 3 (pre-luftas med CO 2) , 1,4 mM CaCl2 (tillsatt sist). När löst, ta bort fällningar genom filtrering i en kolv med hjälp av en 5 um glas sintertratten. Placera några i en liten skål på is som ska användas under operation och isolering.
  3. Syre perfusatet (KHB) med 95% O2 / 5% CO2 under åtminstone 30 min före användning. BEGJUTA Langendorff systemet med KHB för att avlägsna eventuellt kvarvarande vatten ur systemet och buffertbehållaren. För möss, ställa in första pumphastigheten till ~ 2,0 ml / min. Placera 2-0 och 4-0 silkessuturer nära perfusion kanylen. Kör pumpen tills slangen och anordningen fylls intelligensh perfusat och se till att bubblan strup fylls med perfusat.
    OBS: Under långa perioder av perfusion och stabil funktion är det starkt rekommenderat att installera en in-line glasfiberfilter (~ 1 pm) i perfusionskretsen att samla in några fällningar som kan bilda blodproppar i hjärtat

3. Mus Kirurgi

3.1) Mus Anestesi och hantering

  1. Förbered sprutan med anestesi dos på 80 mg / kg ketamin och 5 mg / ml xylazin blandningen, och tillsätt steril 0,9% koksaltlösning för att få upp volymen till 0,2 ml. Injicera Heparin IP (50 | il av 1000 U / ml lösning).
  2. Placera musen tillbaka till containertransporter (~ 10-20 min) och vänta på att förlora medvetandet som heparin träder i kraft. Periodvis göra en tå nypa att övervaka smärta reflex.

3.2) Ta bort hjärtat

  1. När musen är helt medvetslös och svarar inte på tå nypa, säkra den till en lämplig operationsbordet med hjälp av stift eller 25 G sprut tips genom extremiteterna. Utför en torakotomi att exponera hjärtat. Skär ett litet hål strax under bröstbenet och utvidga snittet till sidorna av musen undvika membranet.
  2. Snabbt skära membranet och därefter snabbt skära upp sidorna av bröstkorgen. Vänd tillbaka bröstkorgen som en mussla för att exponera brösthålan. Försiktigt ta tag i hjärtat, placera sax under och ta bort hjärtat.
    OBS: Det är viktigt att snabbt ta bort hjärtat när den exponeras i brösthålan och lungorna är icke-funktionella.

3.3) Rengör Heart

  1. Placera hjärtat i skålen som innehåller iskall KHB och trimma bort alla stora bitar av lungvävnad bifogas. Använd pincett för att plocka upp hjärtat och lokalisera aorta. Tryck försiktigt hjärtat och leta efter något blod som visas, eftersom detta skulle vara den öppna änden av aorta. Använd fin spets pincett för att hålla hjärtat genom den öppna änden av aortan.
e "> 4. Montering av Heart, starta Perfusion och placera ballongen

4.1) Montering och kanyle Heart

  1. Innan du transporterar hjärtat till Langendorff apparat, slå på pumpen säkerställer att perfusionstrycket är låg (~ 20 mmHg). Håll hjärtat genom aortan alldeles under kanylen. Genom att använda en annan uppsättning fin spets pincett, försiktigt öppna aorta och skjut hjärta upp på kanylen. Håll den på plats med en uppsättning av pincett och sedan använda en mjuk kantad klämma för att tillfälligt säkra den till kanylen.
    OBS: Snabbt montage hjärtat till perfusion kanylen är avgörande för en bra förberedelse. Med erfarenhet, bör de förfaranden från att öppna brösthålan tills montering av hjärtat tar mellan 1 och 2 min.
  2. Knyt och initiera perfusion enligt följande, med användning av 4-0 siden sutur säker aorta till kanylen direkt under klippet. Se till att slips är också runt metallaortakanylen, så aorta inte blir bundna av vid åtdragningknuten. När en slips är stadigt placerad, ta bort klippet.
  3. Använd ytterligare silkessuturer att fästa aorta ordentligt i kanylen och se till att fästa under alla fartyg grenar som kan komma från aorta. Dessa kan ofta upptäckas av perfusatet läckande eller skjuter ut från aorta.
    OBS: Under de inledande skedena av perfusion blodet ska tvätta från hjärtat och hela hjärtat ska visas en mjuk rosa färg. Mörka missfärgningar som inte tvätta ut indikerar ischemiska områden sannolikt på grund av luft emboli eller blodproppar och hjärtat får inte användas.

4.2) Upprättande Perfusion och bilproduktionen Mätning

  1. Långsamt öka perfusionstrycket och öka pumphastigheten tills perfusionstrycket når 70 mmHg.
    OBS: Standard perfusion tryck för musen perfusion kan vara 70-90 mmHg, men måste hållas konstant från djur till djur inom ett experiment.
  2. Rengör kvarvarande vävnaden (lunga, sköldkörtel etc.) Som kan fortfarande vara fäst till hjärtat. Använd sax för att klippa bort vänster förmak för att skapa en öppning i vänster kammare.
  3. Placera ballongen på hållaren och tömma. Placera ballongen kanylen nära aortakanylen, direkt över öppningen i den vänstra ventrikeln. Försiktigt in ballongen nedåt i den vänstra kammaren medan du håller hjärtat på plats så aorta inte går sönder.
  4. När det är på plats sakta börjar blåsa upp ballongen tills LVEDP når ~ 8 mmHg. Placera temperatursonden mot botten av hjärtat så att den mäter temperaturen på utflödet.

4.3) Basal Mätning

  1. Täta hjärta i en vattenmantlad perfusionskammare. Under denna tid kontinuerligt BEGJUTA hjärtat med KHB, och se till att temperaturen fortsätter att stiga. Övervaka temperaturen och justera vattenbadet i enlighet tills den når ungefär ~ 37 ° C.
    OBS: Övervakning tempure i de inledande faserna av perfusion är viktigt eftersom koronarflöden och därefter temperaturen kan variera från hjärta till hjärta. Temperaturen hos den utströmmande perfusatet övervakas för önskad myokardial temperatur via en temperatursond placerad vid spetsen av hjärtat. Dessutom, i jämförelse med andra Langendorff perfusion protokoll, hjärtat är inte nedsänkt i CP eller KHB under perfusion eller gripande, är detta främst göras för att snabbt justera temperaturen samt ge effektiv CP leverans utan diffusion.
  2. Börja registreras kontinuerligt funktionell mätning med ett datainsamlingssystem fäst vid lämpliga sensorer, inklusive perfusionstryck, vänsterkammartryck (tryckgivare ansluten till LVP ballong), temperatur, och elektrofysiologiska parametrar (EKG, MAP om sådan finns) (bilaga kommer att vara enligt tillverkarens och specifika för enskilda givare och datainsamlingssystem). När utflödet KHB når ~ 37 ° C under minst 15 min och hjärt funktionella parametrar är stabila, notera tiden för baslinjemätningar.
    OBS: integration / uteslutningskriterier tillämpas på varje hjärta. En LVDP av <60 mmHg vid baslinjen indikerar ett hjärta som bör tas bort från analysen. Dessutom, kranskärlsflöde> 4,5 ml / min, eller oförmåga att upprätthålla perfusionstryck vid baslinjen sannolikt indikerar en läckande eller trasiga aorta. Också några hjärtan som har tydliga ischemiska områden som kan bekräftas visuellt (dvs koagulera) eller uppvisar ischemi relaterade minskningar av hjärtfunktion (dvs. ökar LVEDP, extremt arytmier) tas bort från analysen.
  3. Mät koronarflödet via insamling av krans utflödet i en graderad cylinder för en minut. Stäng kammaren och tillåta temperatur och funktion för att återgå till baslinjevärden. Alternativt mäter koronarflödet kontinuerligt i perfusionsledningen via en flödessond placeras efter tryckavlastningskretsen.
"> 5. Initiera kardioplegisk Arrest

  1. Placera 100 ml kall kardioplegi buffert till en annan behållare och. överföra KHB reservoaren kanylen till kardioplegi behållaren.
  2. Lösgör vattenmantlad höljet och perfusionen uppvärmningen kretsen från det varma vattenbadet och ansluta till det kylda cirkulatorn med användning slang snabbkopplingar. Använd separata värme och kyla cirkulations att tillåta snabba förändringar i hjärtat och perfusatet temperatur.
  3. Följ luftbubblan som blir införd i slangen under omkopplaren, och när den når nära det isolerade hjärtat startar tidtagningen för kardioplegi. Leverera kardioplegi under 2 minuter. Efter den initiala dosen stoppa pumpen. Se att arrestera hjärtat i diastole och vara nära den önskade CP temperaturen.
    OBS: En tillräcklig bubbelfälla är nödvändigt för att undvika luftemboli i hjärtat. Alternativt kan ett avgivningssystem för båda reservoarer kopplade genom en avstängningskran kan lätt konstrueras, men vi finner följaing den lilla luftbubblan som införs när byta kanylen mellan reservoarer, en enkel metod för timing CP leverans ges potentiellt olika pumphastigheter mellan experiment (dvs, på grund av mus / råtta, perfusionstryck, filter motstånd, osv.)
  4. Håll hjärtat i kardioplegi under 2 timmar vid ~ 20 ° C. Varje halvtimme under CP slå på pumpen igen under 1 minut så att en annan dos administreras.
    OBS: Intermittenta doser av CP var 30 min blir funktionsnedsättning av hjärtat utan nekros av vävnaden. Längre perioder mellan doser av CP (dvs> 45 min) kan leda till nekros och ischemisk kontraktur och skulle vara mer lämplig för en modell av nekrotisk skada i samband med oskyddade ischemi.

6. Reperfusion

  1. I slutet av CP, överföra reservoaren kanylen tillbaka till syre KHB. Anslut temperaturkontroll kretsarna till värmecirkulations och vrid pumpenpå att starta reperfusion. Vid denna punkt kardioplegi tvättar ut, observera temperaturstegringen och hjärtat börjar slå igen efter 2-4 minuter av reperfusion. När hjärtat börjar hjärtrytm är långsam och ofta arytmier.
    OBS: Det är vanligtvis inte en stor ökning av diastoliskt bilproduktionen (dvs ≤10 mmHg ökning) som ofta kännetecknande i rena ischemi modeller. Arytmier kan kvarstå långt in reperfusion och ibland hjärtat måste defibrilleras. Detta kan uppnås med användning av en stimulator uppsättning till högre spänningar (~ 10-50 V) och elektroder placerade vid basen och spetsen av hjärtat.
  2. Låt hjärtat reperfundera under 30 minuter, och under denna tidsperiod ta koronara flödesmätningar vid behov. Mät kranskärlsflöde genom att samla utflödet med en graderad cylinder för 30-60 sekunder.

7. Samla Tissue

  1. Töm ballongen och ta bort den från vänster kammare. Ta hjärtat utanförkanyl och väger den. I inledande experiment, bör åtminstone en tvärgående del av hjärtat tas och TTC färgade för att utvärdera nekros att hjärtat är fri från nekrotisk skada.
  2. Samla hjärt skivor för mikroskopi studier, våt / torrvikt, etc. Resten eller hela hjärtat bör snabbt frysas genom att placera i flytande kväve. Förvara frysta hjärtan i en -80 ° C frys.
    OBS: För mätning av höga energifosfatföreningar (dvs., ATP, kreatinfosfat), hjärtan bör frysas omedelbart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar typiska resultat från ett mus-experimentet. LVP (röd linje), dP / dt (grön linje), och temperaturen (lila linje) var continusouly noterats under ~ 3 timmar. Bokstäver indikerar - baslinjemätning, b, c, d, e - leverans av kardioplegilösning, f - inledningen av reperfusion, g, h, i, j - mätning av cornary flöde under reperfusion. Obs, deprimerad LVDP och dP / dt vid reperfusion jämfört med baseline. Figur 1B innehåller data från en inspelad över ~ 2 sek. Observera minskningen i bilproduktionen och dP / dt liknar A, små minskningar av HR och en liten ökning av LVEDP. Vanligtvis efter 30 min av reperfusion finns en ~ 40% minskning av hjärtfunktionen, vilket framgår av det vänstra ventrikulära utvecklat tryck LVDP avbildas i figur 1C.

Figur 1
Figur 1. Representant resultats från en hela experimentet. (A) inspelning vänster ventrikulärt tryck (överst), första derivatan av LV-tryck och temperatur. (B) kort intervall inspelningar att se spår detalj och (C) Kvantifiering av vänsterkammar utvecklade tryck (LVDP) för flera experiment (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De föregående protokollinformation metoder för att utvärdera hjärtinfarkt fantastiska sekundärt till global ischemi i samband med kardioplegisk stillestånd. I våra händer detta protokoll ger en ungefärlig ~ 40% minskning av hjärtfunktionen (LVDP, +/- dP / dt) med minimala förändringar i hjärtfrekvens vid 30 min efter reperfusion tidpunkt. Eftersom hjärtat är reperfuseras och rewarmed alla parametrar för hjärtfunktionen reduceras vid initial tidpunkter med en kraftigt reducerad hjärtfrekvens innan stabilisering mellan 20 och 30 minuter. Kranskärls flöde är i allmänhet ökat kraftigt under tidig reperfusion på grund av hyperemia, och sedan faller till ~ 20-30% mindre än kontrollnivåer efter 30 min reperfusion.

Det är viktigt att komma ihåg att hjärtinfarkt bedövning genom definition bör lämna hjärtat utan celldöd och nekros som är karaktäristisk för ren ischemi / MI-modeller (dvs> 20 min inget flöde regional ischemi). Inledande studier bör utvärdera vävnads histolnik för att säkerställa en brist på nekrotisk skada. Även om hjärtinfarkt bedövning per definition bör leda till normal funktion efter långvarig reperfusion (h till dagar), är det troligt detta protokoll inte kommer att visa återhämtat sig helt funktion på grund av ex vivo Langendorff perfusion som är associerad med reductons i hjärtfunktion i kontroll perfunderade hjärtan över tiden. Icke desto mindre förändringar i den akuta återhämtningen av hjärtfunktion i frånvaro av celldöd / nekros kan användas som index för svårighetsgraden av bedövning Den stora skillnaden i detta protokoll kontra klassiska nr-flödesischemi protokoll är användningen av en kardioprotektion strategi, i detta fall är hyperkalemisk kardioplegi. Hyperkalemisk kardioplegi lösningar ger skydd mot nekrotisk skada och celldöd genom att orsaka diastoliskt hjärtstillestånd. Diastoliskt gripandet av hjärtat främjar bevarandet av energireserver. Dessutom har de flesta kliniskt använda hjärtskyddande protokoll använder hypotermi till ytterligare limit myokardskada genom att minska metaboliskt behov. Andra faktorer som kan moduleras under ovanstående protokoll omfattar olika formuleringar av kardioplegi lösningar (hyperpolarizing formuleringar, Mg ++, K + nivåer, etc.), strategier (varmt kontra kallt, "Hot Shot", etc.), och olika läkemedel (kinas inhibitorer, jon kanalmodulatorer, hjärtskyddande medel, etc.).

Eftersom hjärtat är i ett relativt väl skyddat tillstånd, för att få reproducerbara funktionshinder i kräver denna modell nödvändigtvis längre ischemi tider (dvs större än 2 h). Vi har funnit att gnagare hjärtan är relativt resistenta mot skada i denna modell, särskilt jämfört med större djur (grisar, människor) som tillförlitligt uppvisar stunned myokardium under mycket kortare perioder (dvs 30 min). Vi har också funnit att intermittent leverans är nödvändig för att skydda hjärtat från allvarlig ischemisk skada som en 45-60 minuters intervall follovinge CP leverans kan resultera i brutto diastolisk dysfunktion, ischemisk kontraktur och vävnadsskada vid reperfusion. Andra lätt anpassningsbara komponenter i protokollet kan inkludera utredningar i samband med CP beståndsdelar och den roll som hypo / normotermisk stillestånd samt olika gripande strategier inte är beroende av K + (Na kanalblockerare, hyperpolarizing medel) 3.

Det finns också ett antal viktiga begränsningar denna teknik när de används för att modellera bedövning i samband med klinisk hjärtkirurgi. Först brutto majoriteten av kliniska CP lösningar blandas med blod (~ 4 blod: 1 CP-förhållande). Detta är i allmänhet inte möjligt i möss på grund av perfusion kretsvolymen samt behovet av behandlade slangar och fiber oxygenatorer. Ofta för större djur (marsvin / kaniner) donatordjur skulle också krävas. Dessutom, som i alla modeller isolerade organ påverkan av perifera faktorer (dvs inflammatoriska signaler, re blodperfusion, etc.) är helt ignoreras. Det är dock en praktisk, effektiv och ekonomisk modell för förstudier för att testa farmakologiska tillsatser och olika hjärtskyddande strategier.

Protokollet är väsentligen densamma i råtthjärtan, med undantag av en större ballong och aortakanylen 13,14. Dessutom kräver råttan hjärtat förberedelse betydligt större flödeshastigheter (12-20 ml / min). På grund av sin storlek, är betydligt lättare att lära sig och reproducerbart utföra råtthjärta beredningen. För att bedöma andra typer av skador som leder till hjärtinfarkt fantastisk protokollet kan lätt ändras. För att efterlikna reversibel ischemisk skada, helt enkelt stoppa perfusion pumpen under korta perioder. Hos råttor ~ 20 min global ischemi resulterar i minskad sammandragningsfunktion utan brutto effekter på celldöd och infarkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II) Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride NaCl; 110
Potassium chloride KCl; 16
Calcium Chloride CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride NaCl; 118
Potassium Chloride KCl; 4.8
Magnesium Sulfate MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic) KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate Na pyruvate; 2
Glucose C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104, (24), 2981-2989 (2001).
  2. Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16, (3-4), 290-297 (2011).
  3. Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127, (1), 41-52 (2010).
  4. Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79, (2), 609-634 (1999).
  5. Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97, (18), 1848-1867 (1998).
  6. Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35, (5), 449-455 (2011).
  7. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50, (6), 940-950 (2011).
  8. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  9. Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, (11), 867-878 (2003).
  10. Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  11. Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1, (101), 1-4 (2011).
  12. Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39, (1), 194-215 (1998).
  13. Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300, (5), H1669-H1677 (2011).
  14. Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124, (11 Suppl), S55-S61 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics