Cateterismo cardíaco en ratones para medir la relación de volumen Presión: Investigar el efecto Bowditch

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Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J. Vis. Exp. (100), e52618, doi:10.3791/52618 (2015).

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Abstract

Los modelos animales que imitan trastornos cardíacos humanos han sido creados para probar estrategias terapéuticas potenciales. Un componente clave para la evaluación de estas estrategias consiste en examinar sus efectos en la función del corazón. Existen varias técnicas para medir en la mecánica in vivo cardíacos (por ejemplo, ecocardiografía, relaciones de presión / volumen, etc.). En comparación con la ecocardiografía, ventrículo en tiempo real a la izquierda (LV) Presión de análisis / volumen a través de cateterismo es más preciso y profundo en la evaluación de la función ventricular izquierda. Además, el análisis LV presión / volumen proporciona la capacidad de registrar instantáneamente los cambios durante las manipulaciones de la contractilidad (por ejemplo, la estimulación β-adrenérgico) y los insultos patológicos (por ejemplo, isquemia / reperfusión). Además de la máxima (+ dP / dt) y mínimo (-dP / dt) la tasa de cambio de presión en el VI, una evaluación precisa de la función del VI mediante varios índices de carga independiente (por ejemplo, la presión sistólica finalrelación de volumen y precarga reclutable trabajo sistólico) se pueden alcanzar. La frecuencia cardíaca tiene un efecto significativo sobre la contractilidad LV de tal manera que un aumento en la frecuencia cardíaca es el principal mecanismo para aumentar el gasto cardíaco (es decir, efecto Bowditch). Por lo tanto, al comparar la hemodinámica entre los grupos experimentales, es necesario tener ritmos cardiacos similares. Además, una característica de muchos modelos de cardiomiopatía es una disminución de la reserva contráctil (es decir, disminución del efecto Bowditch). En consecuencia, la información vital puede obtenerse mediante la determinación de los efectos del aumento de la frecuencia cardíaca en la contractilidad. Nuestros y otros datos han demostrado que el óxido nítrico sintasa neuronal (NOS1) ratón knockout ha disminuido la contractilidad. A continuación se describe el procedimiento de medición de LV presión / volumen con el aumento de la frecuencia cardíaca utilizando el modelo de ratón knockout NOS1.

Introduction

El propósito del corazón es bombear sangre por todo el cuerpo para satisfacer las demandas metabólicas del organismo. Dado que estas demandas están en constante fluctuación (por ejemplo, durante el ejercicio), el corazón tiene que adaptarse (es decir, aumentar el gasto cardíaco). El corazón ha ideado numerosas vías para lograr esta hazaña. La manera cebar el corazón logra esto es a través de un aumento en la frecuencia cardiaca (es decir, efecto Bowditch) 1. Es decir, como uno de los aumentos de la frecuencia cardíaca, esto resulta en un aumento de la contractilidad y un aumento en el gasto cardíaco. Por lo tanto, la función del corazón depende en extremo sobre la frecuencia cardíaca. Desafortunadamente, las enfermedades del corazón (por ejemplo, infarto de miocardio, hipertrofia, etc.) los resultados en función del corazón pobre en la que el corazón por consiguiente no será capaz de satisfacer las demandas metabólicas del cuerpo. La enfermedad cardíaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en la sociedad occidental. Los modelos animales que recapitular muchos cardiomy humanaopathies se utilizan para investigar los mecanismos moleculares y probar terapias potenciales. Para discernir estos mecanismos y determinar si una terapia puede ser viable, los investigadores deben evaluar la función cardíaca en vivo.

Hay varias formas de evaluar la función del corazón in vivo (por ejemplo, ecocardiografía, resonancia magnética, etc.), que miden de forma rutinaria la fracción de eyección, fracción de acortamiento, el gasto cardíaco, etc. Sin embargo, estos parámetros son altamente dependientes de la poscarga, precarga, y la frecuencia cardíaca Además de la contractilidad 2. La medición de la contractilidad es indispensable para comprender las propiedades intrínsecas del corazón en su ambiente nativo. El (dP / dt max) tasa máxima de desarrollo de la presión nos lleva un paso más cerca de comprender la contractilidad. Desafortunadamente, dP / dt también depende de la frecuencia cardíaca y las condiciones de carga 3. Por lo tanto, se han desarrollado técnicas para medir la carga (y la frecuencia cardíaca, consulte below) índices independientes de la contractilidad miocárdica (es decir, de fin de sístole relación volumen de presión (ESPVR) y precargar reclutable trabajo sistólico (PRSW)) 4-6. ESPVR describe la presión máxima que puede ser desarrollada por el ventrículo a cualquier volumen LV dado. La pendiente de ESPVR representa la elastancia telesistólico (Ees). PRSW es ​​la regresión lineal de trabajo sistólico (área encerrada por el bucle de PV) con el volumen diastólico final. Estos procedimientos son una medición más exacta y precisa de la contractilidad en comparación con los parámetros hemodinámicos tales como la fracción de eyección, el gasto cardíaco y el volumen sistólico. ESPVR y PRSW se pueden obtener a través del bloqueo temporal de la vena cava inferior (VCI). El bloqueo de la IVC se puede realizar con un cofre cerrado para evitar el efecto de cambiar la presión intrapleural en la función del corazón.

El aumento de la frecuencia cardíaca también aumenta la contracción y relajación 1. Por lo tanto, al comparar la función del corazón entre ExperimentaLos grupos L (por ejemplo, ± dP / dt), las tasas de corazón necesitan ser similar. Sin embargo, las tasas de corazón similares por lo general no se producen en cada animal debido a diversas condiciones (enfermedad, intervención de investigación, etc.). Cabe señalar que la anestesia (inyectable y inhalado) disminuye la frecuencia cardíaca. Como la frecuencia cardíaca es un determinante importante de la contractilidad, la anestesia afectará considerablemente la contractilidad. Por esta razón, estamos describiendo nuestro procedimiento. Además, una característica de muchos cardiomiopatías es una reserva contráctil disminuida (es decir, un efecto Bowditch disminuido). Por lo tanto, la función del corazón se debe medir en un rango de frecuencias cardíacas. Aquí se describe cómo utilizar un estimulador (con un cofre cerrado) para lograr estos efectos.

Además de la frecuencia cardíaca, el óxido nítrico (NO) es también un importante modulador de la contractilidad 7. NO se produce a través de enzimas denominado NO sintasa (NOS). Nosotros y otros han demostrado que los ratones con nocaut de NOS neuronal (NOS1 en vivo hemodinámica cardíaca 8,9. Este ratón se usará para demostrar la medición de la contractilidad ventricular izquierda mediante el procedimiento de análisis de la presión LV / volumen realizado en varias frecuencias cardíacas.

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Protocol

NOTA: Este protocolo animal fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio. Este procedimiento puede ser utilizado en cualquier ratón en el que el diámetro interior de la arteria carótida es lo suficientemente grande para insertar el catéter. Utilice los ratones que están por encima de 16 g (mayores de ~ 2 meses).

1. Preparación de ratón para el cateterismo

  1. Selle todos los instrumentos y suministros quirúrgicos en una bolsa de esterilización. Esterilizar la bolsa en una máquina autoclave. Mantener un campo estéril durante todo el procedimiento y usar guantes estériles.
  2. Anestesiar ratones con ketamina (55 mg / kg), además de xilazina (15 mg / kg) por inyección intraperitoneal.
    NOTA: Todo el procedimiento de medición tanto de la presión / volumen en diferentes frecuencias cardíacas y ESPRV toma menos de 20 minutos. Si se requiere un tiempo adicional (es decir, más de 30 min), dar una dosis adicional de ¼ de la anestesia cada 30 minutos.
  3. Quite el pelo en el r anterioregion del cuello y el pecho usando eliminación de vello loción (por ejemplo, Nair) y la cinta de las extremidades del ratón sobre la plataforma de espuma. Confirmar un estado de anestesia profunda por una pizca dedo del pie.
  4. Inserte una sonda rectal para controlar la temperatura corporal (37 ± 1 ° C), y mantener el uso de una almohadilla de calefacción termo-regulada (que se encuentra entre la sábana quirúrgica y de la plataforma).
  5. Preparar una longitud de 4-0 sutura (~ 10 cm). Sutura de lazo alrededor de los incisivos superiores y la cinta a la plataforma. Esto evitará que el cuello recto.
  6. Esterilizar el área quirúrgica limpiando el área con Betadine y el 75% de alcohol tres veces.

2. Cateterismo

  1. Preparar el catéter por remojo previo de la punta en solución salina o agua destilada (37 ° C) durante al menos 30 min antes de su uso (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para aclimatar el diafragma sensor de presión para el medio ambiente biológico en húmedo y para evitar que deriva de la señal de presión y negativo registros de presión.
  2. Haga una longitudinal 0,8 cm incisión entre el maxilar inferior y el esternón en la región anterior del cuello. Con las tijeras finas, separar el tejido conectivo de la piel muscular para exponer la tráquea se encuentra debajo del músculo stemohyoideus.
  3. Separar la grasa y el tejido muscular de en el lado derecho de la tráquea con pinzas curvas para exponer la arteria carótida derecha.
    NOTA: La arteria carótida es la arteria más grande en la región anterior del cuello, contiene la sangre de color rojo brillante, y es pulsátil. No debe confundirse con la vena yugular que corre paralela a la arteria carótida. La vena yugular es de color rojo oscuro y no pulsátil. Además, durante el aislamiento de la arteria carótida, el usuario debe ser consciente de no dañar el nervio pneumogástrico.
  4. Quite la grasa de la arteria carótida derecha con las pinzas curvas. Si existe ramificación del vaso lo que impedirá esta técnica operativa, ellos cortar con un cauterio Bovie para disociar la arteria carótida.Separar la mayor cantidad de tejido como sea posible en virtud de la arteria carótida utilizando pinzas curvas.
  5. Corte dos 5 cm 6-0 hilos de seda. Pase cada hilo de seda debajo de la arteria carótida derecha.
  6. Posición un hilo cerca de la parte proximal y el otro cerca de la parte distal de la arteria. Hacer un nudo en el hilo en la parte distal, y hacer un nudo flojo en el hilo en la parte proximal.
  7. Bloquear el flujo de sangre por la sujeción de la parte proximal de la arteria mediante una abrazadera vascular pequeña pinza hemostática (colocar la abrazadera debajo de la rosca proximal). La región de sellado de la arteria se llena de sangre haciendo que sea fácil para llevar a cabo el paso 2.8.
  8. Perforar un pequeño agujero en la arteria carótida derecha entre los dos hilos (pero más cerca de la rosca distal) con una aguja de 26 G. Insertar el catéter en la arteria carótida. Ligeramente apretar el nudo flojo en la parte proximal de la arteria carótida en el catéter para mantener en su lugar.
    NOTA: El uso de la punción de la aguja se prefiere comparacióna las tijeras incisión. Al hacer un nudo apretado en la parte distal de la arteria primero, y luego la sujeción de la parte proximal, la arteria será completamente llena de sangre. Esto hace que sea muy fácil de meter a través del vaso sanguíneo. Además, el tamaño de la aguja (26 G) perfora la arteria con un agujero que encaja muy bien el tamaño del catéter. Cuando se utiliza el método de tijeras incisión, era más difícil controlar el tamaño de la incisión. Sin embargo, el método elegido debe depender de cual el cirujano se siente más cómodo.
  9. Comience a grabar señales de presión como en el paso 3.
  10. Afloje la pinza hemostática y continuar la inserción del catéter hacia adelante en el ventrículo izquierdo. Si se experimenta una cierta resistencia al avanzar el catéter, tire suavemente hacia atrás y tratar de avanzar de nuevo. Para un ratón de pesaje ~ 18-25 g, la duración estimada del catéter que se inserta es de 18 mm.
    NOTA: La señal de presión arterial fluctúa desde 70 hasta 120 mm Hg. Una vez tél catéter está en el ventrículo izquierdo la forma de los cambios de la señal de presión y la presión fluctuará 0-120 mm Hg (que se muestra en la Figura 1). La función cardíaca se estabilizará dentro de 2-3 min después de la inserción del catéter.
  11. Continuamente controlar la temperatura corporal, el nivel de la anestesia, y la frecuencia respiratoria.

3. Adquisición de Datos

  1. Utilice el software LabChartPro 7 (o software similar). Use la opción de flujo de trabajo del Módulo LabChart PV Loop. El uso de este módulo, seleccione la configuración por defecto de presión y Loops Volumen.
  2. Puesta en marcha de tres canales: un canal para la presión, un canal para el volumen, y un canal de frecuencia cardíaca. Rangos de escala conjunto de parámetros anteriores como 0-150 mm Hg, 0-100 ly 0-800 lat / min, respectivamente.
  3. Pulse la tecla de inicio para grabar.

4. Efecto Bowditch

  1. Hacer una incisión de 1 cm en la zona precordial paralelo al manubrio. Cortar la capa de músculo y expose espacio intercostal con unas tijeras.
  2. El uso de un estimulador pulso cuadrado, establecer los siguientes parámetros: Voltaje de 2 V, la duración de 2 ms, y activar el modo de repetición.
  3. Mantenga el electrodo negativo con una pinza y la inserta a través del cuarto espacio intercostal a la región apical del corazón. Mantenga el electrodo positivo con fórceps y la inserta a través de la segundo espacio intercostal a la región del atrio derecho del corazón.
  4. Encienda el estimulador y cambiar la frecuencia a pasearse por el corazón de 4 Hz (240 latidos / min) hasta 10 Hz (600 latidos / min). En cada nueva frecuencia cardíaca, estimular el corazón durante 1 min antes de la recolección de datos.

5. Generar el ESPVR y PRSW

  1. Cortar el tejido de la piel y el músculo perpendicular al manubrio en la zona abdominal con tijeras. Abra la enterocoelia y exponer el hígado.
  2. Arrastre el costarum arcus hacia la cabeza con tracción metálico.
  3. Empuje suavemente el hígado hacia abajo conun hisopo de algodón. Tenga cuidado de no presionar demasiado a afectar a la cavidad torácica. Esto va a cambiar la función del corazón.
  4. Cortar el ligamento falciforme del hígado con tijeras para exponer la vena cava inferior suprahepática (IVC).
  5. Utilice pinzas curvas para exprimir rápidamente el IVC durante 5 segundos para bloquear el retorno de la sangre a la aurícula derecha. La presión ventricular izquierda y el volumen caerán debido a la afluencia reducida para el corazón. En la generación de estos valores, no utilice bucles por debajo de 60 mm Hg. El 60 mm Hg es en referencia a la presión sistólica.
    NOTA: Este valor se fija en 60 mm Hg, ya que esto causará una caída significativa de la presión de perfusión para disminuir considerablemente la perfusión coronaria y afectar la contractilidad.

Calibración 6. Volumen

  1. Heparinizar el ratón con 0,1 ml de 1: 5.000 solución de heparina (diluido con solución salina normal) mediante inyección intraperitoneal.
  2. Retire el catéter de la arteria carótida. Cuando el catéter se saca from la arteria carótida, la sangre heparinizada se filtran desde el agujero donde se insertó el catéter.
  3. Reunir esta sangre para la calibración de volumen utilizando una jeringa de 1 ml. Llene cada bien en cubeta de calibración.
  4. Quite el corazón a la eutanasia del ratón a través de desangramiento.
  5. Coloque el catéter en cada pocillo y obtener un valor constante unidad de volumen relativo (RVU). Generar una curva estándar utilizando los diversos volúmenes estándar y los valores RVU de cada pocillo.
  6. Convertir el RVU registrado para l.

7. Tratamiento de datos

  1. Para examinar el efecto Bowditch, seleccione el estado de equilibrio huellas de presión / volumen de cada frecuencia cardíaca. Haga clic en el análisis de referencia para obtener los datos.
  2. Para los datos ESPVR y PRSW, seleccione los primeros rastros ~ 15 de presión / volumen, haga clic en el análisis de la oclusión en el software para generar el ESPVR (pendiente de la presión desarrollada por el LV al final diastólica volumen) y PRSW (la regresión lineal de trabajo sistólico con la diastólica finalvolumen) pendientes.
  3. Prestar atención a la forma de los bucles. Asegúrese de que el bucle se cierra sin puntos angulares o giros. Este es un signo de la colocación del catéter indebido o el exceso de ruido. Revise periódicamente bucles durante el experimento para asegurar los datos de presión y volumen adecuados se están generando.

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Representative Results

La inserción correcta del catéter en el ventrículo izquierdo es un paso importante para alcanzar los valores de presión y volumen adecuados. Se muestra en la Figura 1, utilizando LabChart Pro 7, es el cambio de la forma de onda de presión (forma y valores) como el catéter va desde la arteria hacia el ventrículo.

Después de la inserción adecuada del catéter en el ventrículo izquierdo, la presión (P) y el volumen (V) valores obtenidos luego se utilizado para generar los bucles PV (mostrados en la Figura 2).

El uso de estos valores de presión, los mecanismos que alteran la contractilidad pueden ser investigados. En la Figura 3 es un ejemplo de cómo los cambios de volumen a medida que aumenta la frecuencia cardíaca y la presión. En este ejemplo, el aumento de la frecuencia cardiaca de 300 a 600 latidos / min, la presión LV aumentó de 80 a 100 mm Hg, mientras que los volúmenes diastólica y sistólica LV disminuyeron. Se muestra en la Figura 4 es el ritmo cardíaco la dependencia de las tasas máximas y mínimas de desarrollo de la presión (dP / dt). A medida que aumenta la frecuencia cardíaca, lo mismo ocurre con las tasas máximas y mínimas de desarrollo de la presión. Este tipo de análisis de datos también se puede utilizar para investigar los reguladores de la contractilidad. Nuestros datos demuestran que NOS1 - / - ratones han disminuido las tasas máximas y mínimas de desarrollo de la presión en comparación con el tipo salvaje (WT) ratones (Figura 4). Por lo tanto, octavos de final de NOS1 resulta en un efecto Bowditch disminuido.

Utilizando los valores de presión y volumen obtenidos durante IVC oclusión, también podemos obtener una medida de la contractilidad independiente de la carga. Se muestra en la Figura 5, se calculan Ees y valores PRSW (medido a 420 latidos / min) para WT y NOS1 - / - ratones. Estos datos sugieren que NOS1 - / - ratones han disminución de la contractilidad en comparación con los ratones WT.

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Figura 1:. Las señales de presión y volumen que detecta utilizando el Módulo LabChart PV Loop Los cambios en la señal de presión cuando el catéter se coloca en el VI. La señal de presión arterial (parte superior) fluctuó de 80 a 120 mm Hg. Una vez que el catéter se coloca en el ventrículo izquierdo, la forma de los cambios de la señal de presión y la presión fluctuaron desde 0 hasta 120 mm Hg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Generación de PV bucles utilizando el Módulo LabChart PV Loop. IZQUIERDA) Los datos representativos de la presión (arriba), el volumen (en el centro) y la frecuencia cardíaca (abajo). Estos valores de presión LV / volumen se utilizan para GENERATe el bucle de PV por el trazado de presión (P) contra el volumen (V). (Derecho) Ilustración de bucles generados por los datos de la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3:.. Efecto de la frecuencia cardíaca en la presión del VI y el volumen de datos representativos que demuestren los cambios de presión y volumen del VI con el aumento de la frecuencia cardíaca utilizando el Módulo LabChart bucle PV Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: nocaut NOS1 (NOS1 - / -.) Ratones han disminuido vivo la función del corazón y contráctil de reserva en comparación con tipo salvaje (WT) ratones, NOS1 - / - ratones tienen máxima significativamente menor (dP / dt max) y mínimo (dP / dt min) la tasa de presión desarrollo con el aumento de la frecuencia cardíaca. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. * P <0,05 vs WT a través de ANOVA, n = 5 ratones / grupo.

Figura 5
Figura 5: nocaut NOS1 (NOS1 - / -) ratones han disminuido la contractilidad. IZQUIERDA) Presión representante / bucles de volumen obtenidos durante la oclusión de la vena cava inferior. Nótese la forma correcta de cada bucle. Las líneas gruesas son los de fin de sístole relación volumen de presión (ESPVR). DERECHA) En comparación con los de tipo salvaje ratones (WT), NOS1 - / - ratones tienen una elastancia sistólica final disminuido (Ees) y precargar trabajo sistólico reclutable (PRSW). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. * P <0,05 vs WT mediante unpaired t-test, n = 5 ratones / grupo.

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Discussion

Un paso crítico para esta técnica para obtener una medida fiable de la contractilidad es adecuada colocación del catéter en el LV. Si el catéter no está colocado correctamente, cuando se contrae la LV las paredes pueden ponerse en contacto con el catéter que resulta en valores muy altos, y no fisiológica, causando presión irregulares bucles PV conformados. Si es necesario, el catéter se puede girar para lograr la correcta colocación. Otro paso clave para esta técnica es hacer que el ratón recibió anestesia adecuada. Si el ratón está sobre anestesiado, esto va a disminuir considerablemente la función del corazón. Un ratón con una frecuencia cardíaca inferior a ~ 250 latidos / min se puede considerar sobre anestesiado. Además, el volumen de sangre que el corazón bombea ratón es pequeño por lo que es difícil de conseguir volúmenes precisos. Es importante para calibrar el volumen de cada ratón. Para la calibración de volumen, describimos la técnica de calibración cubeta. Existen métodos adicionales que se utilizan también para calibrar los volúmenes (es decir,Cálculo del volumen del accidente cerebrovascular usando una sonda de flujo en la aorta torácica descendente) 10.

Hay muchas limitaciones del uso de este método en el ratón; todo debido a su pequeño tamaño corporal. Por ejemplo, esta técnica requiere habilidad microquirúrgico precisa. Además, esta técnica resulta en alguna pérdida de sangre, lo que podría cambiar la función del corazón. Pérdida masiva de sangre se puede evitar haciendo avanzar el catéter a través de la vasculatura en comparación con otros métodos (por ejemplo, pinchando el ventrículo izquierdo). A continuación, describimos todo el procedimiento en detalle con detalles críticos para evitar estos problemas.

Análisis de presión / volumen es un enfoque importante para investigar en la contractilidad vivo. La realización de esta técnica en ratones es significativo, ya que hay muchas ventajas sobre otras especies (costo, manipulación genética, etc.). Desde la frecuencia cardíaca es un determinante importante de la función del corazón 1 y afectada por anesthesia, hemos presentado medidas adicionales para asegurarse de que las tasas de corazón comparables se logran para permitir una comparación válida entre los grupos. Por otra parte, el uso de esta técnica bucle PV modificado, un investigador es capaz de probar directamente el efecto Bowditch. Por estas razones, se describe cómo realizar esta técnica en el ratón para obtener mediciones precisas de la contractilidad in vivo a diferentes ritmos cardíacos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xlyzine 100 mg/ml Ana Sed 4821
Katamin 50 mg/ml Ketalar 310006
Heparin APP Pharmaceuticals 6003922
4-0 silk thread Surgical specialties SP102
6-0 silk thread Surgical specialties MBKF270
Forceps Fine Science Tools 11251-10
Curve forceps Fine Science Tools 11274-20
Scissors Fine Science Tools 14090-09
Vascular clamp Fine Science Tools 18555-03
Microscope World precision instruments PZM-3
Pressure catheter Millar instruments SPR-839
Pressure and volume system Millar instruments MPVS-300
PowerLab4/35 AD instruments N12128
LabchartPro 7 AD instruments
Temperature controller CWE TC-1000
Stimulator Grass SD-5
Sterile glove Micro-Touch 1305018821
Hair remover lotion Nair
Betadine surgical scrub Veterinary NDC 6761815401
Alcohol Decon Laboratories 2801
Bovie cautery Bovie AA29
1 ml Syringe (26 G needle) BD 8017299

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References

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