環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
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Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

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Abstract

Protocol

1。水の収集および濾過

  1. 様々なサイト( 図1)からの淡水のサンプルを収集します。一連のフィルターを通してサンプルを渡し:1μmのフィルター、0.2μmのフィルター、および30kDaのカットオフ接線流フィルタそれぞれ体系的に独立した真核生物、細菌およびウイルスサイズの粒子にする。
    注:のみ精製し、0.2μmのフィルター(自由生活細菌)に回収された物質の分析は、このレポートに記載されているが、同様のアプローチがフィルターから回収された他の粒子に使用することができます。

2.細菌濃度、DNA抽出と精製

  1. 水のろ過システム(模式図、 図2)から0.2μmのメンブレンフィルターを取り外します。半分に0.2μmのディスクフィルターを折ると開放側を上にして50ミリリットルチューブに配置します。に1×リン酸緩衝溶液5ml(PBS)および0.01%のTween、pH7.4中の追加チューブ。複数のフィルタは、処理中に使用される場合、フィルタ毎に異なるチューブを使用する。 4℃でのフィルター付きストアチューブ(単数または複数)まで処理した。それ以外の場合は、2.2に進みます。
  2. 滅菌ピンセットで50mlチューブから0.2μmのメンブレンフィルターを削除します。ペトリ皿(チューブにPBS緩衝液を残す)にフィルタ(S)を配置します。
    1. 滅菌ピンセットと無菌のハサミで、小さなストリップにフィルタ(1センチメートル×1 cm)をカット。 DNA表面除染剤で拭くと、異なるサンプル間の1型の超純水でリンスし、70%イソプロパノール中に浸漬することによって、鉗子およびハサミを消毒する。
  3. バック同じ50ミリリットルチューブにストリップに切断フィルタを置きます。 50mlチューブ中のバッファー15mlの合計が存在するので、フィルタに1×10mlのPBSおよび0.01%のTween、pHが7.4を加える。
  4. (50 mlチューブをボルテックスアダプタを使用)、各50mlチューブに6クリーンタングステンビーズ(直径3mm)を追加パラフィルムでチューブをカバーし、そして20分間、激しくボルテックス。 MULTの場合ipleフィルターはきれいな50ミリリットルチューブに1サンプル、転送、プールのすべてのホモジネートから処理されます。 4℃で15分間3300×gでチューブを遠心。
  5. 1.7ミリリットルのマイクロチューブにペレットとアリコート細菌細胞(〜1ミリリットル分量)に懸濁します。サンプルあたり5マイクロチューブがあることに注意してください。
  6. 10分間万×gでマイクロ遠心チューブをスピンダウンし、〜200μlのマークまで上清のほとんどを除去。
  7. -80℃で試料を保存するか、製造元の説明書に従って市販のDNA単離キットを使用して、細菌のDNAを抽出するために進む。細菌のDNA抽出中にPBSまたはネガティブ抽出コントロールとしての水、およびEのいずれかを使用ポジティブ抽出制御として大腸菌
  8. 複数のチューブからのDNAが抽出されているので、1 2ミリリットルチューブに同じサンプルからのパラレルサブ分量をプールする。 0.1からなる溶液を用いてO / N沈殿を行う3 M酢酸ナトリウム、100%エタノールの2ボリューム、および5μg/μlの直鎖状アクリルアミドの5μLのボリューム。 -80℃でよく混合し、店舗のサンプル。
  9. 4℃で30分間、最大速度(17000×gで)で遠心。洗浄は氷冷70%エタノール、10 mMのトリス-Cl、pHが8.5の34μlの中でせいぜい5分間再懸濁DNAペレットのためのバイオセーフティキャビネット内で風乾さ1mlのペレット。
    注意:リニアアクリルアミドは、O / Nを沈殿させた後、DNAペレットを視覚化するのに役立ちます。
  10. 製造者の指示(材料の表を参照)、以下、それぞれ高感度蛍光核酸定量アッセイおよび微量分光光度計を用いてDNAの量と質を決定します。
    注:複数のサンプルを一度に製造される場合、二本鎖DNAとプレートベースの蛍光光度計/分光光度計を定量化するための超高感度の蛍光核酸アッセイが代わりに使用することができる。

3. DNAライブラリーの準備

  1. トランスポゾンに基づく方法を用いて細菌DNAの酵素的に断片1ナノグラム(tagmentation)。製造者の指示に従って断片化したDNA上にアダプターとインデックスシーケンスを追加します。シークエンスインデックスが組み込まれている点で、製造業者の説明書に示されるように、被験体は、PCRの12サイクルにサンプルをtagmented。

4.自動ゲルサイズの選択

  1. メーカーの説明書に記載されている標準的なPCR後のクリーンアップ手順をスキップして(材料の表を参照してください)​​。サイズ選択後のPCR試料を直接に自動化されたゲルに基づくサイズ選択プラットフォームを使用。
    1. 各サンプルにローディングバッファーの3.5を添加する。
    2. 製造業者のプロトコルに続いて、電気泳動ワークステーション上にサンプルをロードし、500〜800塩基対のサイズ選択対象を指定して、300μlの抽出物中のプレキャスト1.5%アガロースカセットを用いたイオン体積。
    3. エタノール沈殿を経由して25μLまで生の出力材料(300μl)を濃縮する。
      注:または、フィルタープレートと真空マニホールドを経由してサンプル数が多いために濃度を自動化するために電気泳動ワークステーションを使用しています。
      1. 、3 M酢酸ナトリウムの0.1ボリュームを使用して生の溶出量を沈殿させ、100%エタノールおよび5μg/μlの直鎖状アクリルアミドの5μlの2倍量の。 -80℃CO / Nで、よく場所サンプルを混ぜる。 30分間17000×gで遠心分離サンプル。
      2. 上清を捨て、氷冷した70%エタノール1mlでDNAペレットを洗浄するために進む。
      3. 最終的に30分間17000×gで再び遠心サンプル、上清を廃棄し、空気乾燥し、10 mMのトリス-Cl、pHが8.5の25μlのDNAペレットを懸濁します。
  2. (オプション)5作るために自動化されたゲルサイズ選択プラットフォームを選択したDNAライブラリーのサイズの1μLを使用してくださいトリスEDTA緩衝液、pHが8.0を使用倍希釈。製造業者の説明書に従って二本鎖DNAの質を分析するために、チップベースのキャピラリー電気泳動装置を使用してライブラリーを分析する。

5.図書館正規化とシーケンシング

  1. メーカーの準備ガイドで説明したように(トランスポゾンライブラリ作製キットに含まれる)ライブラリ正規化ビーズを用いて、サンプルを正規化するために進んでください。
    1. あるいは、2 nMの最終的な二本鎖DNA濃度を達成するために、等モル比でプールし、続いて、高感度の蛍光核酸定量アッセイを使用して、二本鎖DNAライブラリーを測定する。プールされたライブラリの10μlの0.2 N NaOHを10μLを使用してライブラリを変性させるに進み、室温で5分間インキュベートする。 1ミリリットルと11.5 PMの濃度の最終容量に(トランスポゾン調製キットに付属)ハイブリダイゼーション緩衝液を使用して変性したライブラリを希釈する。
  2. ロードサンプル製造者の標準的な配列決定プロトコールに従うことによって、次世代シークエンシングプラットフォームの。

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Representative Results

DNAの濃縮、および品質評価

細菌のDNA濃度は、0.01から0.11 ng ​​の/異なる流域部位の水サンプル当たりミリリットル( 表1)の範囲であった。細菌画分から単離されたDNAは、それぞれ、1.8および0.3から1.6へ260/280および1.4の260/230比を持っていた。 A 260/230比のいくつかは、比較的低かったが、明らかな阻害が準備され、ライブラリと他の下流のアプリケーションでは観察されなかった。これらのアプリケーションは、PCRおよび定量PCRは、16SのrRNAおよびCPN 60、およびその後のアンプリコンの配列決定をした(データは示されていない)を標的テスト含まれる。

レンジャーテクノロジー

ハイスループット自動化されたプラットフォームを選択トランスポゾンに基づく方法およびゲルサイズで作製したDNAライブラリーは、500〜800塩基対( 図3)との間のDNAフラグメントの緊密な範囲が得られた。この代替PRotocolは0.3〜3.4 ngの/μlの( 表1)の範囲の濃度を得た。 DNAフラグメントサイズの650bpの平均を使用して、このライブラリの平均濃度は、投入材料の3.81 nMであった。ライブラリは、一貫して、複数の流域の場所から調製されたすべてのDNAライブラリーで選択したサイズでした。

DNAシーケンシングQCのパラメータ

イルミナMiSeqでこのライブラリのDNA配列決定は、1198 K / mm 2とのクラスタ密度を生成しました。クラスタ通過フィルタの割合は9.2 Gbの推定収率で84.2%だった。また、7.4 GB以上読み込むの82.8%は、品質スコアを≥30持っていた。自動化されたゲルのサイズ選択プラットフォームの利用は、常に適切な収率をもたらし、200 bpの下に不要なフラグメントのクラスタ化を最小化する。

図1 <BRの/> 図1水サンプルは、都市(A)および農業(B)に影響流域から採取した。

図2
図2.淡水サンプルからトランスポゾンDNAライブラリーを生成するために使用される方法の模式図。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図淡水サンプルから生成されたDNAライブラリーの3電気泳動図を、(A)サイズ選択及び(B)DNAライブラリーサイズの前にPCR後のDNAライブラリーは、自動化されたを使用して選択ゲルサイズ選択プラットフォーム(目標範囲:500〜800塩基対)。全てのサンプルをTE緩衝液で5倍に希釈した。

<TD> 0.04(0.04)
環境試料 細菌のDNA濃度
(ng / ml)を*
260/280 260/230 サイズ選択の前にDNA濃度(ng /μLで)、ボリューム:25μL DNA濃度(ng /μLで)サイズ選択後、音量:25μL
1 0.11(0.16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0.11(0.20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0.10(0.37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
5 0.11(0.13) 1.7 1.0 26.1 1.1
6 0.05(0.03) 1.5 0.7 15.2 0.4
7 0.01(0.01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0.03(0.05) 1.6 0.7 17 0.9
*値は、高感度の蛍光核酸定量アッセイを用いてdsDNAの濃度を示す。括弧内の数字は、微量分光光度計を用いて濃度を表す。

表1.品質および環境淡水サンプルから抽出したDNAの量評価、および前後のトランスポゾンベースのライブラリ自動化されたゲルサイズ選択。

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Discussion

アダプターダイマーと優先的に現在のプラットフォームで配列決定されている小型のインサートサイズのクラスタリングの存在は、使用可能な収率で、かつアンダー利用設備の容量15の減少を表している。ライブラリーを調製するためのトランスポゾンベースのアプローチと組み合わさビーズビーティング法の使用は、抽出4,5の他の方法と比較して、よりDNAの剪断を生じ得る。それにもかかわらず、抽出およびライブラリの準備のすべてのメソッドは、潜在的にシークエンシングの分布に偏りを紹介8,16を読み込みます。ライゲーションに基づく方法と組み合わせる自動核酸抽出プラットフォームを使用して、実験的な観測は、ショットガンライブラリーから、アダプターダイマーの過剰を除去するようには見えなかった(データは示さず)。この研究は、それによってアダプターダイマーまたは小のキャリーオーバーを最小化する、非常に特定の範囲内のDNAフラグメントを選択するサイズによって環境サンプルからライブラリーを調製するために修正されたプロトコルを用いDNA断片。自動化されたゲルサイズ選択プラットフォームの使用は、500〜800塩基対( 図3)の特定の範囲内でDNAライブラリーの再現可能な痕跡を生成した。生のより多くの(約150万)( すなわち 、2倍0.5倍比で)他のクリーンアップに比べ(0.5倍比で常磁性ビーズ)は、標準的な処理を用いて得られ、ここで修正されたプロトコルは、唯一の55%を説明した読み込みながらそれらは、225塩基対よりも大きかったサンプルあたり読み込みます。修正されたプロトコルを使用して、サンプル当たりの読取りの割合は、少なくとも75%が225塩基対より大きい読み取る生成。標準的な治療では、読み取り、多数のショートの表現上のライブラリを読み込むことを示した。ゲルサイズの選択と比較して、常磁性ビーズ(標準処理)を選択したフラグメントのサイズは、17近づく変数であると報告されている。この修​​正されたプロトコルは、より有益な常磁性ビーズよりも読み込みに生成。ライブラリを構築するためのゲルの選択の使用がありますLSOは、〜5%から0.02%9にキメラの発生率の減少を示した。

現在のプロトコルにおける重要なステップは、入力DNA、ライブラリ内のDNA量、およびPCRマスターミックスの化学の正常化のための考慮事項が含まれています。起動入力DNA濃度に依存し、それは時間のかかる測定と、入力DNAを正規化するために、ここで、従ってより高速に自動化ビーズベースのアプローチは、使用されるトランスポゾンに基づく方法によって必要とされる1 ngの量にまでDNAを希釈してもよい初期試料調製18で考慮される。インデックスのtagmentation及び組み込み後、試料を直接試験に記載されて電気泳動ステーションを使用して選択されたサイズであった。この手順における重要なステップは、システムにロードされたDNAの量である。光学的検出のための最小サンプルDNAの濃度は、試料(ショットガン配列対アンプリコン)の性質に依存する。組み込み回収率はされている> 75%の低入力サンプルと回復効率でホールドアップすることが示され。ここで説明する自動化されたゲルのサイズ選択システムによって検出することができる最低のDNAの量は、全DNAの1.5 ngの(ネスビット、M.およびSlodoban、J.、2014、未発表データ)である。デュアル染料マーカーがどこにサイズが特定のターゲットを選択するかを決定するために使用されるにもかかわらず、試料の光学的検出は、サイズ選択を行うことが必要とされない。環境試料から調製したライブラリは、プラットフォーム内にロードされる前に、DNA濃度を蛍光光度計を用いて定量した。 DNA濃度の比較的狭い範囲は、ポストPCRサンプル( 表1)で検出された。これらのサンプルは、塩、二量体、DNAポリメラーゼは、増幅された環境DNA、および非公開の試薬​​19の混合物を含んでいたが、これらの濃度は、少なくとも電気泳動ステーションによって検出可能なDNAの報告された最低量よりも252倍を示した。通常、DNAを殺傷するのサイズ選択メンツ代わりにPCRマスターミックスの緩衝液中で行われる。このプロトコルで使用される情報に関するPCRマスターミックスは、メーカーからの未公開であったとしても、予備試験は、混合物中の二重色素マーカーの移動を追跡するために実施された(データは示さず)。 PCRマスターミックス中の高イオン強度緩衝液は、サンプルの電気泳動移動度を変化させるであろうため、この変数のために収容される必要がある。この研究で説明する自動ゲル選択プラットフォームは、サンプルは、高イオン強度であるかどうかを示すためのオプションを公開する。このオプションを使用すると、変更後の電気泳動移動度曲線及び遅延バンド追跡パラメータが使用される。したがって、PCRミックスの化学がローディングバッファーおよびマーカーに影響を与えることが可能であり、ゲル中のDNA断片の移動に影響を与える。

自動または半自動のゲルサイズ選択のための市販のいくつかのシステムがある。これらの楽器も1時間未満で分離、回収、およびドキュメントを提供しています。それは、これらのシステムが処理できるサンプル、および消耗品17,20に関連するコストの数になると、それにもかかわらず、限界がある。この文脈において、ここに記載の技術は、アガロースゲルサイズ選択及び分析の両方の側面を扱う。最大192のサンプルは、高解像度の電気泳動で特徴付けることができるながら最大96サンプルは、単一の実行で選択されたサイズにすることができます。さらに、器具はまた、ユーザーが自動化されたワークステーションに期待する汎用的な液体処理タスクを完了することができます。

このプロトコルの生の溶出量が目標範囲(25 BPに40キロバイト)に応じて、100〜400μLの範囲である。機器のこの態様は、限定として知覚することができるが、それは、300μlの体積で溶出したDNAライブラリーを301 pMでの平均濃度(データは示さず)を有していることに留意しなければならない。この結果として得られる値はrepresents MiSeqプラットフォーム内の​​配列決定のための必要な最終濃度(〜11.5 PM)よりも高い26倍。本研究では、エタノール沈殿、ライブラリ調製において使用時間的に追加のステップを示した。現在、溶出体積は、さらに市販のフィルタープレートデッキ(アップグレード)に収まる真空マニホールドを使用して上甲板真空濾過ステップを使用することによって低減することができる。このセットアップを使用して、生の溶出量は、フィルタープレートに移し、濃縮し、次いで、25μlの(Slodoban、J.、2014、私信)に再懸濁する。この研究では、DNAの沈殿は、トランスポゾン系キットに記載されているように正規化サンプルのステップのために必要な入力容量と一致するワークフローを維持するために行われた。

この修​​正された技術は、海水、廃水処理プラント、堆積物、土壌、または微生物マットのような他の環境試料から調製されたDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーに適用可能である。オートここで報告されたゲルサイズ選択プラットフォームは、イルミナシーケンスプラットフォームにだけでなく、ロシュ454、ライフ·テクノロジーズ、パシフィック·バイオサイエンスなどの他の次世代シークエンシングプラットフォームのみならず、最小限の変更を適用することができる交配。他のプラットフォームにこの技術を適応させる特別な考慮事項は、(51μLまで)ウェル容量をロードするの参照またはマーカーをサイジングし、アガロースゲルカセットの割合(目的画分に依存)が含まれる。このハイスループット自動化されたゲルのサイズ選択技術は、精製の識別形態であり、低コストで電気特性評価に適している。この技術の恩恵を受けることができる他のアプリケーションは、RNA-配列プロジェクト、(機能メタゲノミクスを含む)の長さの断片配列決定、遺伝子合成、メイト対ライブラリーの構築、 新たに 、複雑なゲノム配列決定、制限消化分析、および遺伝子型判定が含まれる。

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Disclosures

ジャレドR.スロボダンとマシューJ·ネスビット両方が沿岸ゲノミクス、レンジャーテクノロジーを提供して個人所有のブリティッシュ·コロンビア州の法人の株式を保有。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

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References

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