Automatisert Gel Størrelse Selection å forbedre kvaliteten på Neste-generasjons Sekvense Biblioteker Forberedt fra miljø vannprøver

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Vann Collection og filtrering

  1. Samle ferskvannsprøver fra ulike områder (figur 1). Passerer prøvene gjennom en rekke filtre: 1 um filter, 0,2 um filter, og 30 kDa cutoff tangential strømningsfilter for systematisk separat eukaryot, bakterielle og virale store partikler, henholdsvis.
    Merk: Det er bare rensing og analyse av materialet utvinnes på 0,2 um filter (frittlevende bakterier) er beskrevet i denne rapporten, men lignende metoder kan anvendes for de andre partikler utvinnes fra filtrene.

2. Bakteriell Konsentrasjon, DNA Extraction og rensing

  1. Fjern 0,2 um membranfilter (e) fra vannfiltreringssystem (skjematisk diagram, figur 2). Brett 0,2 mikrometer skivefilter i to og legg den i en 50 ml tube med den åpne siden opp. Tilsett 5 ml 1 x fosfatbufret oppløsning (PBS) og 0,01% Tween, pH 7,4 irøret. Hvis mer enn ett filter blir brukt under prosessen benytter en annen tube per filter. Butikk rør (e) med filter ved 4 ° C inntil behandling. Ellers går du til trinn 2.2.
  2. Ta av 0,2 mikrometer membranfilter fra 50 ml tube med steril pinsett. Plasser filteret (e) på en petriskål (la PBS-buffer i røret).
    1. Med steril pinsett og steril saks, kuttet filteret i små strimler (1 cm x 1 cm). Desinfisere tenger og sakser av soaking i 70% isopropanol, tørke av med en DNA overflate dekontamineringsmiddel og skylling med ultrarent vann av type 1 mellom forskjellige prøver.
  3. Plasser filteret skåret i strimler tilbake i den samme 50 ml rør. Tilsett 10 ml av 1 x PBS og 0,01% Tween, pH 7,4 til filteret slik at det er en total av 15 ml buffer i 50 ml rør.
  4. Legg 6 rene wolframkuler (3 mm diameter) til hver 50 ml rør, dekker røret med Parafilm, og virvle kraftig i 20 min (bruke 50 ml rør vortex-adapter). Hvis multiple filtre er behandlet fra en prøve, overføring og bassenget hele homogenatet i en ren 50 ml tube. Sentrifugere rørene ved 3300 x g i 15 min ved 4 ° C.
  5. Resuspender pelleten og aliquot bakterieceller (~ 1 ml alikvoter) i 1,7 ml mikrosentrifugerør. Legg merke til at det vil være fem mikrosentrifugerør per prøve.
  6. Spinn ned mikrosentrifugerør ved 10.000 xg i 10 minutter, og fjerne det meste av supernatanten ned til ~ 200 ul merket.
  7. Lagre prøvene ved -80 ° C, eller fortsette å trekke ut bakterielt DNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA isolert sett i henhold til produsentens anvisninger. I løpet av bakteriell DNA-ekstraksjon bruk enten PBS eller vann som en negativ kontroll ekstraksjon, og E. coli som en positiv kontroll ekstraksjon.
  8. Fordi DNA fra flere rØr blir ekstrahert, basseng parallelle under alikvoter fra den samme prøven i en 2 ml-rør. Deretter gjennomfører en O / N utfelling ved anvendelse av en løsning bestående av 0.1volum av 3 M natriumacetat, to volumer av 100% etanol, og 5 ul av 5 ug / ul lineær akrylamid. Bland godt og lagre prøvene ved -80 ° C.
  9. Sentrifuge ved maksimal hastighet (17.000 x g) i 30 minutter ved 4 ° C. Vask pelleten med 1 ml iskald 70% etanol, lufttørke i en biosikkerhet skapet til ikke mer enn 5 min og resuspender DNA-pelleten i 34 pl av 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Merk: Lineær akrylamid vil bidra til å visualisere DNA-pelleten etter O / N utfelling.
  10. Fastslå DNA kvantitet og kvalitet ved hjelp av en høy følsomhet fluorescerende nukleinsyrekvantifisering analysen og en microvolume spektrofotometer, henholdsvis å følge produsentens instruksjoner (se tabell for material).
    Merk: Hvis flere prøver er forberedt på den tiden, kan en ultra fluorescerende nukleinsyre analyse for å kvantifisere dsDNA og plate-baserte fluorometer / spektrofotometer brukes i stedet.

3. DNA Bibliotek Forberedelse

  1. Enzymatisk fragment ett nanogram av bakteriell DNA ved hjelp av en transposon basert metode (tagmentation). Legg adapter og indeks sekvenser på fragmentert DNA etter produsentens anvisninger. Lagt tagmented prøvene til 12 sykluser av PCR som angitt i produsentens instruksjoner, noe som medførte at de sekvense indeksene er innarbeidet.

4. Automated Gel Størrelse Selection

  1. Hopp standard post-PCR opprydding trinn beskrevet i produsentens instruksjoner (se tabell for material). Størrelse velger post-PCR prøvene direkte ved hjelp av en automatisert gel-baserte størrelse valg plattform.
    1. Legg 3,5 mL av ladningsbuffer til hver prøve.
    2. Etter produsentens protokoll, legger prøvene på elektroforese arbeidsstasjon og oppgi en størrelse-utvalg målet på 500-800 bp, i en 300 mL ekstraktion volum, ved hjelp av en pre-cast 1,5% agarose kassett.
    3. Konsentrer den rå utgangsmaterialet (300 ul) ned til 25 ul via etanolpresipitering.
      Merk: Alternativt kan du bruke elektroforese arbeidsstasjon for å automatisere konsentrasjonen for større antall prøver via filterplaten og vakuum manifold.
      1. Utfelle rå elueringsvolumet ved hjelp av 0,1 volumer av 3 M natriumacetat, 2 volumer 100% etanol og 5 ul av 5 ug / ul lineær akrylamid. Bland godt, sted prøver ved -80 ° CO / N. Sentrifuger prøver på 17.000 xg i 30 min.
      2. Kast supernatanten og videre å vaske DNA-pellet med 1 ml iskald 70% etanol.
      3. Sentrifuger prøvene på nytt ved 17 000 xg i 30 minutter, kaste supernatanten, tørr luft, og til slutt DNA resuspender pelleten i 25 pl av 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Valgfritt) Bruk en mikroliter av DNA-biblioteker størrelse valgt med automatisert gel størrelse valg plattform for å lage en femdobbel fortynning ved bruk av Tris-EDTA-buffer, pH 8,0. Analyser bibliotekene ved hjelp av en chip-basert kapillær elektroforese instrument for å analysere dsDNA kvalitet i henhold til produsentens instruksjoner.

5. Bibliotek Normalisering og Sequencing

  1. Fortsett å normal prøver ved hjelp biblioteknormaliserings perler (inkludert i transposon-baserte bibliotek forberedelse kit) som beskrevet i produsentens forberedelse guide.
    1. Alternativt kan måle dsDNA-bibliotek ved anvendelse av en høy følsomhet fluorescerende nukleinsyrekvantifisering assay, etterfulgt av pooling ved ekvimolare forhold for å nå en endelig konsentrasjon på dsDNA 2 nM. Fortsett å denaturere bibliotek ved anvendelse av 10 ul av sammenslåtte biblioteker og 10 ul 0,2 N NaOH, inkuber i 5 minutter ved RT Fortynn denaturerte biblioteker ved hjelp hybridiseringsbuffer (inkludert med transposonet baserte preparat kit) til et sluttvolum på 1 ml og konsentrasjonen av 11:05.
  2. Last prøves i en neste-generasjons sekvense plattform ved å følge produsentens standardsekvense protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA konsentrasjon, og Quality Assessment

Bakterielle DNA-konsentrasjoner varierte 0,01 til 0,11 ng ​​/ ml per vannprøve av de forskjellige skjellsider (tabell 1). DNA isolert fra bakteriell brøkdel hadde A 260/280 og A 260/230 forholdstall på 1.4 til 1.8 og 0,3 versjon 1.6 hhv. Mens noen av de A 260/230-forhold var forholdsvis lav, ble ingen tydelig hemming observert i den fremstilte biblioteket, og andre nedstrøms applikasjoner. Disse programmene inkludert PCR og qPCR tester målretting 16S rRNA og CPN 60 og påfølgende amplicon sekvensering (data ikke vist).

Ranger Technology

DNA-biblioteker fremstilt med en transposon-basert fremgangsmåte og gel størrelse velges med en high-throughput automatisert plattform ga en tett rekke av DNA-fragmenter fra 500 til 800 bp (figur 3). Denne alternative protocol ga konsentrasjoner i området 0,3 til 3,4 ng / mL (tabell 1). Ved hjelp av et gjennomsnitt på 650 bp DNA fragment størrelse, gjennomsnittlig konsentrasjon for dette biblioteket var 3,81 nM av innsatsmateriale. Bibliotekene ble konsekvent størrelse velges i alle DNA-biblioteker utarbeidet fra flere vannskille steder.

DNA Sequencing QC Parametere

DNA-sekvensering av dette biblioteket på Illumina MiSeq generert en klynge tetthet på 1198 K / mm 2. Prosentandelen av klase bestått filtre var 84,2% med en estimert avkastning på 9,2 Gb. Videre 7.4 Gb eller 82,8% av den leser hadde en kvalitet poengsum ≥30. Utnyttelse av en automatisert gel størrelse valg plattform konsekvent resultert i egnede rentene og minimert clustering av uønskede fragmenter underkant av 200 bp.

Figur 1 <br /> Figur 1. Vannprøver ble samlet inn fra urban (A) og agriculturally (B) påvirket nedbørs.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk fremstilling av metodene som brukes til å generere transposon baserte DNA-biblioteker fra ferskvannsprøver. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 3
Figur 3. Electropherograms av DNA-biblioteker generert fra ferskvannsprøver: (A) Post-PCR DNA-biblioteker før størrelse valg og (B) DNA-biblioteker størrelsen som er valgt ved hjelp av automatisertegel størrelse valg plattform (målområdet: 500-800 bp). Alle prøver ble fortynnet fem ganger med TE-buffer.

<td> 0,04 (0,04)
Miljøprøve Bakteriell DNA-konsentrasjon
(Ng / ml) *
En 260/280 En 260/230 DNA konsentrasjon (ng / mL) før størrelse valg, volum: 25 pl DNA konsentrasjon (ng / mL) etter størrelse valg, volum: 25 pl
1 0,11 (0,16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0,11 (0,20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0,10 (0,37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
5 0,11 (0,13) 1.7 1.0 26.1 1.1
6 0,05 (0,03) 1.5 0.7 15.2 0.4
7 0,01 (0,01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0,03 (0,05) 1.6 0.7 17 0.9
* Verdiene indikerer dsDNA konsentrasjon ved hjelp av en høy følsomhet fluorescerende nukleinsyrekvantifisering analysen. Tallet i parentes representerer konsentrasjonen ved hjelp av en microvolume spektrofotometer.

Tabell 1. Kvalitet og kvantitet vurdering av DNA ekstrahert fra miljøferskvannsprøver, og transposon-baserte biblioteker før og etterautomatisert gel utvalg størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tilstedeværelsen av adapter dimerer og clustering av små innleggs størrelser fortrinnsvis blir sekvensert i dagens plattformer representerer en nedgang i brukbar avkastning og underforbruk av utstyrets kapasitet 15. Bruken av kuleoppmalingsmetoder kombinert med et transposon basert tilnærming for å fremstille bibliotekene kan resultere i mer DNA skjær i forhold til andre metoder for utvinning 4,5. Likevel, alle metoder for utvinning og bibliotek forberedelse potensielt introdusere skjevheter i fordelingen av sekvense leser 8,16. Eksperimentelle observasjoner ved bruk av en automatisert nukleinsyre-ekstraksjon plattform, kombinert med en ligeringsbasert fremgangsmåte, synes ikke å fjerne overskuddet av adapter dimerer fra hagle biblioteker (data ikke vist). Denne studien benyttet en modifisert protokoll for å forberede biblioteker fra miljøprøver etter størrelse utvelgelse DNA-fragmenter innenfor en meget bestemt område, og dermed minimere overføring av adapter dimer eller litenDNA-fragmenter. Bruken av en automatisert gel størrelse valg plattform generert reproduserbare spor av DNA-biblioteker innenfor et bestemt område av 500 til 800 bp (figur 3). Selv om et større antall rå leser (~ 1,5) ble oppnådd ved hjelp av standard behandling (paramagnetiske kuler på 0,5x-forhold) sammenlignet med andre opprydding (dvs. to ganger i 0,5x ratio) og modifisert protokoll som er beskrevet her, kun 55% av de som leser per prøve var større enn 225 bp. Prosentandelen av lyder per prøve ved hjelp av den modifiserte protokoll som genereres i det minste 75% av lyder som er større enn 225 bp. I standardbehandling, det store antall leser indikerte en overrepresentasjon av kort leser i biblioteket. Fragment størrelser valgt med paramagnetiske perler (standard behandling) har blitt rapportert å være variabel i forhold til gel størrelse valg nærmer 17. Denne modifiserte protokollen generert mer informativ leser enn paramagnetiske kuler. Bruken av gel valg å bygge biblioteker har enLSO antydet en reduksjon i forekomsten av kimærer fra ~ 5% til 0,02% 9.

Kritiske trinn i den nåværende protokollen inkluderer hensynet til normalisering av innspill DNA, mengden av DNA i bibliotekene, og kjemien i PCR Master Mix. Avhengig av utgangsinngangs DNA-konsentrasjon, kan det være tidkrevende å måle og fortynne DNA ned til en mengde på 1 ng kreves av transposon-basert metode som brukes her og dermed raskere automatiserbar kule-baserte metoder for å normalisere inngangs DNA kan også bli vurdert i den opprinnelige prøve 18 preparat. Etter tagmentation og inkorporering av indekser, prøvene var direkte størrelse velges ved hjelp av elektroforese arbeidsstasjon som er beskrevet i denne studien. Et kritisk trinn i denne fremgangsmåten er mengden av DNA som lastes inn i systemet. Den minste prøven DNA-konsentrasjon for optisk detektering avhenger av arten av prøven (amplikonet versus hagle sekvensering). Iboende utvinning renter har værtvist seg å holde tritt med lav inngangs prøver og utvinning effektivitet> 75%. Den laveste DNA beløp som kan oppdages av automatiserte gel størrelse valg system som beskrives her er 1,5 ng av total DNA (Nesbitt, M. og Slodoban, J., 2014, upubliserte data). Likevel er optisk deteksjon av prøven behøver ikke å gjennomføre størrelse valg, som dobbelt markører fargestoff brukes til å bestemme hvor i størrelse velge et bestemt mål. Før biblioteker fremstilt av miljøprøver ble lastet inn i plattformen, ble DNA konsentrasjon kvantifiseres ved hjelp av en fluorometer. Et forholdsvis smalt område av DNA-konsentrasjoner ble påvist i post-PCR-prøvene (tabell 1). Selv om disse eksempler inneholdt en blanding av salter, dimerer, DNA-polymerase, DNA amplifisert miljø, og ukjente reagenser 19, disse konsentrasjoner representert minst 252 ganger høyere enn den rapporterte laveste mengde DNA påvises ved elektroforese arbeidsstasjon. Normalt størrelse utvalg av DNA fragmenter vil bli utført i en bufferoppløsning i stedet for PCR masterblanding. Selv om informasjon vedrørende PCR masterblanding anvendt i denne protokollen var ukjent fra produsenten, ble det utført innledende forsøk for å spore migrering av to fargestoff markører i blandingen (data ikke vist). En høy ionestyrke buffer i PCR masterblanding vil forandre den elektroforetiske mobilitet av prøven, og dermed denne variabel må være tilpasset for. Den automatiserte gel valg plattform som er beskrevet i denne studien eksponerer et alternativ til å indikere om en prøve er i høy ionestyrke. Når dette alternativet er brukt, blir deretter endrede elektro mobilitet kurver og forsinkede bandet sporingsparametre ansatt. Derfor er det mulig at kjemien av PCR blandingen vil ha en innvirkning på lastebuffer og markører, og påvirker migrering av DNA-fragmentene i gelen.

Det er noen systemer kommersielt tilgjengelige for automatisert eller semi-automatisert gel størrelse valg. Disseinstrumenter også gi separasjon, utvinning, og dokumentasjon på mindre enn 1 time. Likevel, er det begrensninger når det gjelder antall prøver som disse systemene kan håndtere, og kostnadene forbundet med forbruks 17,20. I denne sammenheng er den teknikk som er beskrevet her håndterer begge sider av agarosegel størrelse valg og analyse. Opp til 96 prøver kan være størrelsen som er valgt i et enkelt løp, mens opptil 192 prøvene kan karakteriseres med høy oppløsning elektroforese. Videre kan instrumentet også fullføre generiske flytende behandlingsoppgaver brukerne forventer av en automatisert arbeidsstasjon.

Rå elueringsvolum på denne protokollen varierer 100-400 ul, avhengig av målavstanden (25 bp til 40 kb). Selv om dette aspekt av apparatet kan oppfattes som en begrensning, skal det bemerkes at DNA-biblioteker eluert med et volum på 300 ul ville ha en gjennomsnittlig konsentrasjon på 301 pM (data ikke vist). Dette resulterende verdi representerer en 26 ganger høyere enn det som kreves endelig konsentrasjon for sekvensering i en MiSeq plattform (~ 11:05). I denne studien, representert etanolutfelling et ekstra trinn i form av tid ansatt i bibliotek forberedelse. For tiden kan elueringsvolumet reduseres ytterligere ved hjelp av en på dekkvakuumfiltreringstrinn som anvender et kommersielt filterplaten og en vakuum-manifold som passer på dekket (oppgradering). Ved hjelp av dette oppsettet, er den rå elueringsvolum overført til filterplaten, konsentrert og deretter resuspendert i 25 ul (Slodoban, J., 2014, personlig kommunikasjon). For denne studien, ble DNA-utfellingen gjennomført for å holde arbeidsflyten i samsvar med inngangsvolumet er nødvendig for å normalisere prøvetrinn som beskrevet i det transposon-baserte kit.

Denne modifiserte teknikken kan være aktuelt å DNA eller cDNA bibliotek fremstilt av andre miljøprøver som sjøvann, renseanlegg, sedimenter, jord, eller mikrobielle matter. Autoparret gel størrelse valg plattform rapportert her kan påføres med minimum modifikasjoner ikke bare til Illumina sekvense plattformer, men også til andre neste generasjons sekvense plattformer, inkludert Roche 454, Life Technologies, og Pacific biovitenskap. Spesielle hensyn til å tilpasse denne teknologien til andre plattformer inkludere lasting brønnkapasitet (opp til 51 mikroliter), dimensjonering referanser eller markører, og prosentandel av agarosegel kassett (avhengig målfraksjonen). Denne high-throughput automatiserte gel størrelse valg teknikk er en diskriminerende form for rensing og er tilstrekkelig for lavpris elektro characterizations. Andre programmer som kan dra nytte av denne teknologien inkluderer RNA-Seq prosjekter, lang fragment sekvensering (inkludert funksjonelle metagenomikk), genet syntese, kompis pair bibliotek konstruksjon, de novo og komplekse genomsekvensering, begrensning fordøye analyse, og genotyping

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jared R. Slobodan og Matthew J. Nesbitt både eie aksjer fra Coastal Genomics, et privateid British Columbia selskap som tilbyr Ranger Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats