Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Su Toplama ve Filtrasyon

  1. Çeşitli sitelerde (Şekil 1) tatlı su örnekleri toplamak. Bir filtre dizi örnekleri belirtilebilir: 1 mikron filtre, 0.2 um'lik bir filtre ve 30 kDa kesme teğetsel akış filtresi, sırasıyla sistematik olarak ayrılması ökariyotik ve bakteriyel ve viral ölçekli parçacıkları için.
    Not: sadece saflaştırma ve 0.2 um filtre (serbest yaşayan bakteriler) karşılanan malzemenin analizi, bu raporda tarif edilmektedir, ancak benzer yaklaşımlar filtreleri elde diğer partiküller için kullanılabilir.

2. Bakteriyel Konsantrasyon, DNA Ekstraksiyon ve Arıtma

  1. Su filtre sisteminden (şematik bir diyagramı, Şekil 2) 0.2 um membran filtre (ler) çıkarın. Yarısında 0,2 mikron disk filtre katlayın ve açık tarafı yukarı bir 50 ml tüp içine yerleştirin. Içine 1x Fosfat tamponlu solüsyon 5 ml (PBS) ve% 0.01 Tween, pH 7.4 eklemetüp. Birden fazla filtre işlemi sırasında kullanıldığında, filtre başına farklı bir tüp kullanır. 4 ° C'de filtreyle deposu boru (lar) kadar işlendi. Aksi takdirde, 2.2 adıma geçin.
  2. Steril forseps ile 50 ml tüp 0.2 mikron membran filtreyi çıkarın. Bir petri üzerine yerleştirin filtre (ler) (tüp PBS tampon bırakın).
    1. Steril forseps ve steril makaslar ile küçük şeritler halinde filtre (1 cm x 1 cm) kesildi. % 70 izopropanol nemlendirici bir DNA yüzey temizleyici ile silinerek farklı numuneler arasında tip 1 aşırı saf su ile durulama ile Forseps ve makas dezenfekte.
  3. Tekrar aynı 50 ml tüp içine şeritler halinde kesilmiş filtreyi yerleştirin. 50 ml tüp içinde tampon, 15 ml olmak üzere toplam yani filtreye 1x PBS, 10 ml ve% 0.01 Tween, pH 7.4 ekleyin.
  4. Her 50 ml tüp 6 temiz tungsten boncuk (3 mm çapında) ekleyin 20 dakika (50 ml tüpler vorteks adaptörü kullanın) için şiddetle Parafilm ile tüp, ve vorteks kapsayacak. Daha fazla Eğeriple filtreleri temiz bir 50 ml tüp içine bir örnek, transfer ve havuz tüm homojenattan işlenir. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3300 x g'de tüpler santrifüjleyin.
  5. 1.7 ml mikrosantrifüj tüplerine pelet ve kısım bakteriyel hücreler (~ 1 ml'lik eş payları,) yeniden süspanse edin. Numune başına 5 mikrosantrifüj tüpleri olacağını not edin.
  6. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de mikrosantrifüj tüpler aşağı Spin ve 200 ° 'ye kadar ul işareti aşağı süpernatant en çıkarmak.
  7. -80 ° C'de örnekleri saklayın, ya da üreticinin talimatlarına göre bir piyasada mevcut DNA izolasyon kiti kullanılarak bakteriyel DNA ayıklayın geçin. Bakteriyel DNA ekstraksiyon kullanımı ya PBS veya su negatif kontrol olarak ekstraksiyon ve E. sırasında Pozitif kontrol olarak ekstraksiyon coli.
  8. Birden tüpler DNA ayıklanır ediliyor Çünkü, bir 2 ml tüp içine aynı örnekten paralel alt alikotları havuz. Daha sonra 0.1 müteşekkil bir çözelti kullanılarak bir O / N çökelmesini yapmak3 M sodyum asetat,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul hacmi. İyice karıştırın ve mağaza örnekleri -80 ° C'de.
  9. 4 ° C'de 30 dakika maksimum hızda (17,000 xg) santrifüjleyin. 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 34 ul en fazla 5 dakika ve tekrar süspansiyon DNA pelet bir biyo-güvenlik kabini içinde buz-soğuğu% 70 etanol, kuru hava içinde 1 ml pelet yıkayın.
    Not: Doğrusal akrilamid O / N yağış sonrası DNA pelet görselleştirmek için yardımcı olacaktır.
  10. Üreticinin talimatlarına (Malzeme Tablo bakınız), sırasıyla, yüksek hassasiyet floresan nükleik asit kantitasyon tahlil ve microvolume spektrofotometre kullanarak aşağıdaki DNA miktarını ve kalitesini belirleyin.
    Not: birden çok numune anda hazırlanır, dsDNA ve plaka bazlı florimetre / spektrofotometre ölçülmesi için ultra-hassas bir floresan nükleik asit tahlil bunun yerine kullanılabilir.

3. DNA Kütüphanesi hazırlanması

  1. Bir transpozon-tabanlı bir yöntem (tagmentation) kullanılarak bakteriyel DNA'nın enzimatik fragmanı bir nanogram. Üreticinin talimatlarına takip parçalanmış DNA üzerine adaptör ve dizin dizileri ekleyin. Dizileme endeksler dahil edilmiştir, bu noktada, üreticinin talimatlarına, belirtildiği gibi tabi PCR 12 döngü numuneleri tagmented.

4. Otomatik Jel Boyut Seçimi

  1. Üreticinin talimatlarına açıklanan standart PCR sonrası temizleme adımı atlayın (Malzeme Tablo bakınız). Boyut seçin PCR sonrası numuneler doğrudan otomatik jel bazlı boyutu seçimi platformu kullanarak.
    1. Her bir örnek için yükleme tamponu 3.5 ul ekleyin.
    2. Imalatçının protokolü izlenerek, 300 ul özü, 500-800 bp'lik bir boyut seçim hedefi belirterek, elektroforez iş istasyonunda örnekleri yükBir ön-döküm% 1.5 agaroz kaseti kullanarak iyon hacmi,.
    3. Etanol çökeltme ile 25 ul kadar ham çıkış malzemesi (300 ul) konsantre edin.
      Not: Alternatif olarak, filtre plakası ve vakum manifoldunun yoluyla örneklerin büyük sayılar için konsantrasyonu otomatikleştirmek için elektroforez iş istasyonu kullanın.
      1. 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacminde,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul kullanarak ham elüsyon hacmi çökeltilmesi. -80 ° CO / N de, iyi bir yerde örnekleri karıştırın. Santrifüj numuneler 30 dakika için 17,000 x g'de.
      2. Süpernatantlar atın ve buz gibi soğuk% 70 etanol 1 ml DNA pelet yıkayın geçin.
      3. Santrifüj numuneleri yine 30 dakika süre ile 17,000 x g de, üst fazlar, kuru hava atmak ve son olarak 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 25 ul DNA pelletini.
  2. (İsteğe bağlı) bir beş yapmak için otomatik jel boyutu seçimi platformu ile seçilen DNA kütüphaneleri boyutu 1 ul kullanınTris-EDTA tampon çözeltisi, pH 8.0 kullanılarak kat seyreltme. Üreticinin talimatlarına göre dsDNA kalitesini analiz etmek için bir çip tabanlı kapiller elektroforez aleti kullanılarak kütüphaneleri analiz.

5. Kütüphane Normalleştirme ve Sıralama

  1. Üreticinin hazırlık kılavuzunda açıklandığı gibi (transpozon-tabanlı kütüphane hazırlık seti dahil) kütüphane normalleştirme boncuklar kullanarak örnekleri normalleştirmek için devam edin.
    1. Seçenek olarak ise, 2 nM'lik, bir nihai konsantrasyona ulaşmak için dsDNA eşit molar oranlarda bir araya getirerek ve ardından, yüksek hassasiyetli floresan nükleik asit niceleme deneyi kullanılarak dsDNA kütüphaneleri ölçer. Toplanmış kütüphaneler 10 ul ve 0.2 N NaOH, 10 ul kullanarak kütüphane denatüre etmek için devam oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. 11:05 son bir 1 ml hacmi ve konsantrasyonu (transpozon tabanlı hazırlık seti ile birlikte) melezleme tamponu kullanılarak denatüre kütüphaneleri sulandırmak.
  2. Yük örneğiüreticinin standart sıralama protokollerini takip ederek bir nesil dizileme platformu s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA Konsantrasyon ve Kalite Değerlendirmesi

Bakteriyel DNA konsantrasyonları 0.01 ila 0.11 ng ​​/ farklı havza sitelerinin su numune başına mi (Tablo 1) arasında değişmektedir. Bakteriyel fraksiyondan izole edilmiş DNA sırası ile, 1.6 A 260/280 ve 1,4-1,8 arasında bir 260/230 oranı ve 0.3 vardı. Bir 260/230 oranları bazı nispeten düşük iken, belirgin bir inhibisyon hazırlanan kütüphane ve diğer alt uygulamalarda görülmektedir. Bu uygulamalar, PCR ve qPCR 16S rRNA ve CPN 60, ve daha sonra amplikon sekanslama (veriler gösterilmemiştir), hedef test içermektedir.

Ranger Teknolojisi

Yüksek verimli otomatik platform ile seçilen bir transpozon bazlı yöntem ve jelin, boyutu ile hazırlanan DNA kütüphaneleri 500-800 bp (Şekil 3) arasındaki DNA parçalarının sıkı bir dizi elde edilmiştir. Bu alternatif protocol 0.3 ila 3.4 ng / ul (Tablo 1) arasında değişen konsantrasyonlar elde edilmiştir. DNA fragmanı büyüklüğü 650 bp büyüklüğünde bir ortalama kullanarak, bu kütüphane için ortalama konsantrasyon giriş malzemesinin 3.81 nM idi. Kütüphaneler sürekli birden fazla havza yerden hazırlanan tüm DNA kütüphanelerinin seçilen boyutu vardı.

DNA Dizi QC Parametreleri

Illumina MiSeq Bu kütüphanenin DNA dizileme 1198 K / aa 2 küme yoğunluğu oluşturdu. Küme geçen filtre yüzdesi% 84.2 9.2 Gb tahmini verimle oldu. Ayrıca, 7.4 Gb veya% 82.8 bir kalite puanı ≥30 vardı okur. Otomatik jel boyutu seçimi platformunun Kullanımı sürekli müsait verimler sonuçlandı ve 200 bp altında istenmeyen parçalarının kümelenme minimize.

Şekil 1, <br /> Şekil 1. Su numuneleri kentsel (A) ve tarımsal (B) etkisinde havzalarda toplanmıştır.

Şekil 2,
Şekil 2. tatlı su örneklerinden transpozon-tabanlı DNA kütüphaneleri oluşturmak için kullanılan yöntemlerin şematik gösterimi. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil tatlı su örneklerden elde edilen DNA kütüphanelerinin 3. elektroferogramlarda: (A), büyüklük seçimine ve (B) 'DNA kütüphaneleri boyutuna önce PCR sonrası DNA kütüphaneleri otomatik kullanılarak seçilebilirJel boyutu seçimi platformu (hedef aralığı: 500-800 bp). Tüm numuneler TE tamponu ile beş kat seyreltildi.

<td> 0.04 (0.04)
Çevre örnek Bakteriyel DNA konsantrasyonu
(Ng / ml) *
Bir 260/280 Bir 260/230 Boyut seçiminden önce DNA konsantrasyonu (ng / ml), hacim: 25 ul DNA konsantrasyonu (ng / ul) boyutu seçimi sonrasında, hacim: 25 ul
1 0.11 (0.16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0.11 (0.20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0.10 (0.37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
5 0.11 (0.13) 1.7 1.0 26.1 1.1
6 0.05 (0.03) 1.5 0.7 15.2 0,4
7 0.01 (0.01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0.03 (0.05) 1.6 0.7 17 0.9
* Değerler, yüksek hassasiyet floresan nükleik asit kantitasyon deneyi kullanılarak dsDNA konsantrasyonunu gösterir. Parantez içindeki sayı, bir microvolume spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonunu temsil eder.

Tablo 1. kalite ve çevre tatlı su örneklerinden çıkarılan DNA miktarı değerlendirme öncesi ve sonrası transpozon bazlı kütüphaneleriotomatik jel boyutu seçimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

adaptör dimerleri ve tercihen mevcut platformlarda sıralandı olan küçük ekleme boyutları kümelenme varlığı kullanılabilir verimleri ve altı-kullanımı cihazlarının kapasitesi 15 bir azalma temsil eder. kitaplıkları hazırlanması için bir transpozon bazlı yaklaşım ile birlikte damla çırpma yöntemlerin kullanılması ekstre 4,5 'diğer yöntemlere kıyasla daha fazla DNA kesme neden olabilir. Dizileme dağılımı 8,16 okur Yine, ekstraksiyon ve kütüphane hazırlık tüm yöntemler potansiyel önyargıları tanıtmak. Bir ligasyon-tabanlı yöntemle birlikte bir otomatik nükleik asit ekstraksiyon platformu kullanılarak deneysel gözlemler, av tüfeği kütüphanelerinden adaptör dimerleri fazlalığı çıkarmak değildi (veriler gösterilmemiştir). Bu çalışma, böylece adaptör dimerleri veya küçük taşınmasını en aza indirerek, çok özel bir aralıkta boyutu seçme DNA parçalarının çevre örneklerinden kütüphaneleri hazırlamak için bir modifiye protokol istihdamDNA parçalan olabilir. Otomatik bir jel boyutu seçimi platformunun kullanımı 500-800 bp (Şekil 3) arasında belirli bir aralık içinde DNA kütüphanelerinin tekrarlanabilir izleri oluşturdu. Raw daha çok sayıda okur iken (~ 1,5 milyon), diğer temizlikleri (yani, 2 0.5x oranında kez) ve modifiye protokol burada açıklanan, sadece 55% ile karşılaştırıldığında standart tedavi (0.5x oranında paramanyetik boncuk) kullanılarak elde edilmiştir Bu daha büyük 225 bp olan numune başına okur. yüzdesi 225 bp daha büyük okur değiştirilmiş protokol en az% 75 üretilen kullanarak numune başına okur. Standart tedavi olarak, okur sayıda kısa temsili üzerinde kütüphanede okur belirtti. Jel bir boy seçimine göre para-manyetik taneler (standart tedavi) seçilen Fragman boyutları 17 yaklaşır değişken olduğu bildirilmiştir. Bu modifiye protokol daha detaylı paramanyetik taneler daha okur oluşturulur. kütüphaneler oluşturmak için jel seçimi kullanımı olan birLSO ~% 5 ila% 0.02 ila 9 kimeralar sıklığında bir azalma olduğunu gösterdi.

Bu protokol kritik adımlar PCR master karışımı giriş DNA, kütüphanelerde DNA miktarı ve kimya normalleşmesi için düşünceler bulunmaktadır. Başlangıç ​​giriş DNA konsantrasyonuna bağlı olarak, zaman alıcı ölçmek ve aynı zamanda giriş DNA normalleştirmek için burada ve böylece daha hızlı automatable boncuk-tabanlı yaklaşımlar Kullanılan transpozon-tabanlı yöntemle gerekli 1 ng bir miktar aşağı DNA sulandırmak olabilir İlk numune hazırlama 18 da düşünülebilir. Indeksler tagmentation ve birleşme sonrasında, numuneler bu çalışmada açıklanan elektroforez iş istasyonu kullanılarak seçilen doğrudan boyutu vardı. Bu prosedürde bir kritik adım sistemine yüklenen DNA miktarıdır. Optik algılama için minimum numune DNA konsantrasyonu numunenin doğası (amplikonu karşı av tüfeği sıralama) bağlıdır. İçsel kurtarma verimleri olmuşturDüşük giriş örnekleri ve kurtarma verimliliği>% 75 ile tutmak için gösterilen. Burada anlatılan otomatik jel boyutu seçimi sistemi tarafından tespit edilebilen en düşük DNA miktarı toplam DNA (Nesbitt, M. ve Slodoban, J., 2014, yayınlanmamış veri) 1.5 ng. Çift boya işaretleri burada boyutu belirlemek için, belirli bir hedef seçmek için kullanılır Yine de, bir numunenin optik algılama, boyut seçimi yapmak için gerekli değildir. Çevresel örneklerden hazırlanan scFv kitaplıklarıdır platformu yüklendi önce, DNA konsantrasyonu, bir florimetre kullanılarak nicelleştirilmiştir. DNA konsantrasyonları, nispeten dar bir aralık PCR sonrası örnekleri (Tablo 1) olarak saptandı. Bu örnekler, bir tuz, dimerler, DNA polimeraz karışımı, büyütülmüş çevre DNA ve kamuya açık olmayan reaktif 19, en azından temsil bu yoğunluğuna rağmen elektroforez iş istasyonu tarafından tespit DNA rapor edilen en düşük miktarda daha yüksek 252 kat. Normalde DNA, frag boyutu seçimirından yerine PCR ana karışımı bir tampon çözeltisi içinde gerçekleştirilecektir. Bu protokolde kullanılan bilgiler konusunda PCR master karışımı üreticisinden açıklanmayan olmasına rağmen, ön testler karışımı çift boya belirteçlerinin göç izlemek için yapılmıştır (veriler gösterilmemiştir). PCR ana karışımı bir yüksek iyonik güçlü tampon numunesinin elektroforetik hareketlilik değiştirecek ve bu nedenle bu değişken için yerleştirilmiş olması gerekir. Bu çalışmada tarif edilen otomatik jel seçimi platformu, bir numune, yüksek iyonik güçte olup olmadığını belirtmek için bir seçenek sunar. Bu seçenek kullanıldığında, daha sonra değişmiş elektroforetik hareketlilik eğrileri ve gecikmiş bant izleme parametreleri kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu PCR karışımı kimya yükleme tampon maddesi ve belirteçleri üzerine bir etkisi olması mümkündür ve jel DNA fragmanlarının geçişini de etkiler.

Otomatik ya da yarı otomatik jel boyutu seçimi için ticari olarak temin edilebilen birkaç sistem vardır. Bunlararaçlar da en az 1 saat içinde ayrılmasını, kurtarma ve belgeleri temin. Bu sistemlerin işleyebilir örneklerin ve sarf 17,20 ile ilişkili maliyetler sayısına gelince Yine, sınırlamalar vardır. Bu bağlamda, burada açıklanan teknik agaroz jel boyutu seçimi ve analiz Her iki yönlerini ele alır. Kadar 192 numune yüksek çözünürlüklü elektroforezi ile karakterize edilebilir ise kadar 96 numune, bir tek vadede seçilen boyutta olabilir. Ayrıca, enstrüman, aynı zamanda kullanıcıların otomatik iş istasyonundan beklediğiniz genel sıvı taşıma görevleri tamamlayabilirsiniz.

Bu protokolün Ham elüsyon hacmi hedef aralık (25 bp 40 kb) bağlı olarak 100 ila 400 ul arasında değişir. Aletinin bu özelliği, bir sınırlama olarak kabul edilebilir olsa da, 300 ul bir hacim ile elüt DNA kütüphaneleri 301 pM ortalama yoğunluğu edebileceğine işaret edilmelidir (veriler gösterilmemiştir). Bu, ortaya çıkan değerin Reprelayan bir MiSeq platformu dizilemesi için gerekli nihai konsantrasyon (~ 23:05) daha yüksek 26-kat. Bu çalışmada, etanol ile çökeltme kütüphanesi hazırlanmasında kullanılan zaman açısından ek bir adımı temsil etmektedir. Şu anda, elüsyon hacmi daha da ticari bir filtre levhası ile güverte (yükseltme) üzerine takılan bir vakum manifoldu kullanan bir on-güverte vakumlu süzme aşaması kullanılarak azaltılabilir. Bu kurulumu kullanılarak, ham elüsyon hacmi, filtre plakasına aktarılır konsantre edildi ve daha sonra 25 ul (Slodoban, J., 2014, kişisel iletişim) içinde tekrar süspanse edilir. Bu çalışma için, bir DNA çökeltme transpozon bazlı kit de tarif edildiği gibi normalleşme örnek adım için gerekli giriş hacmi ile tutarlı olan bir iş akışı sağlamak amacı ile yapılmıştır.

Bu modifiye teknik, deniz suyu, atık su arıtma tesisi, sediment, toprak, ya da mikrobiyal paspaslar gibi diğer çevresel örneklerden hazırlanan DNA veya cDNA kütüphaneleri için geçerli olabilir. otoBurada bildirilen çiftleşmiş jel boyutu seçimi platformu Illumina sıralama platformları için değil, aynı zamanda Roche 454, Life Technologies, ve Pasifik Biosciences dahil olmak üzere diğer nesil dizileme platformlara sadece az değişiklik ile uygulanabilir. Diğer platformlar yükleme de (51 ul kadar) kapasitesi, boyutlandırma referanslar ya da kalem ve agaroz jel kaset yüzdesini (hedef fraksiyonu bağlıdır) dahil etmek Özel hususlar bu teknolojiyi adapte etmek. Bu, yüksek verimli, otomatik jel boyutu seçimi tekniği arıtılmadan bir ayırıcı formu ve düşük maliyetli bir elektro karakterizasyonu için yeterlidir. Bu teknolojiden yararlanabilir Diğer uygulamalar RNA Sıra projeler, (fonksiyonel metagenomics dahil) uzun fragmanı sıralama, gen sentezini, dostum çifti kütüphane inşaat, de novo ve karmaşık genom sıralama, kısıtlama analizi sindirmek ve genotiplendirmesi içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jared R. Slobodan ve Matthew J. Nesbitt hem Kıyı Genomics, Ranger Teknolojisi sunan bir özel sektöre ait British Columbia şirketin hisse sahibi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats