सरलीकृत मानव न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) अलगाव और हैंडलिंग

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Immunology and Infection

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Summary

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए मानव पूरे रक्त से न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) को अलग करने के लिए एक बहुत ही सरल तरीके से वर्णन करते हैं। हम तो पृथक जाल कैंसर कोशिकाओं के साथ इन विट्रो आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है।

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Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. J. Vis. Exp. (98), e52687, doi:10.3791/52687 (2015).

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Abstract

न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) ने हाल ही में न्युट्रोफिल के रोगाणुरोधी साधन के हिस्से के रूप में पहचान की गई है। इसके अलावा संक्रमण से लड़ने में उनकी भूमिका से, हाल के शोध से वे कैंसर की प्रगति सहित कई अन्य रोग प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। शुद्ध जाल अलग इन कार्यों के अध्ययन की अनुमति के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है।

इस वीडियो में, हम आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए मानव पूरे रक्त से सेल नेट मुक्त अलगाव की एक सरल विधि प्रदर्शित करता है। पृथक जाल तो immunofluorescence धुंधला, सोख्ता या विभिन्न कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस न्यूट्रोफिल खुद की संभावित confounding प्रभाव के अभाव में उनके जीवविज्ञान गुण के एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है।

एक घनत्व ढाल जुदाई तकनीक स्वस्थ दाता पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल अलग करने के लिए कार्यरत है। पृथक न्यूट्रोफिल तो phorbol 12 MYR द्वारा प्रेरित कर रहे हैंistate 13-एसीटेट (पीएमए) NETosis प्रेरित करने के लिए। सक्रिय न्यूट्रोफिल तो खारिज कर रहे हैं, और एक सेल मुक्त नेट शेयर प्राप्त की है।

हम तो A549 मानव फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं के साथ एक आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे अलग-थलग जाल प्रदर्शित करता है। नेट स्टॉक कोट करने के लिए जोड़ रहे हैं एक साथ 96 सेल संस्कृति की थाली हे / एन, और कुओं के तल पर एक पर्याप्त नेट monolayer के गठन को सुनिश्चित करने के बाद, CFSE लेबल वाले A549 कोशिकाओं के कुओं प्रयोग किया जाता है। पक्षपाती कोशिकाओं एक Nikon TE300 फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। कुछ कुओं में, 1000U DNAse1 जाल नीचा करने के लिए गिनती से पहले 10 मिनट के लिए जोड़ा जाता है

Introduction

न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) नव प्रोटीन और हिस्टोन के सैकड़ों द्वारा सजाया कोशिकी डीएनए की किस्में से बना न्युट्रोफिल व्युत्पन्न तत्वों की खोज कर रहे हैं। वे विशिष्ट उत्तेजनाओं निम्नलिखित संक्रमण और सूजन के संदर्भ में न्यूट्रोफिल द्वारा स्रावित होते हैं और वे शुरू में संक्रमण के खिलाफ न्यूट्रोफिल की रक्षा तंत्र का हिस्सा बनने के लिए मान्यता प्राप्त किया गया। वे पहली बार बैक्टीरिया, वायरस और कवक 1-3 सहित विभिन्न माइक्रोबियल आक्रमणकारियों के फँसाने बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। सूक्ष्म जीव की फँसाने तो इसके विनाश के लिए दोनों सीधे नेट से जुड़े प्रोटीन 3,4 द्वारा और परोक्ष रूप से phagocytic कोशिकाओं 5,6 के स्थानीय भर्ती के माध्यम से नेतृत्व करेंगे। नेट की भूमिका हालांकि रक्षा की मेजबानी के लिए सीमित होना प्रतीत नहीं होता। हाल ही में, वे, 9 घनास्त्रता, autoimmune रोग 7,8 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए गर्भावस्था से संबंधित विकारों 10 और यहां तक कि कैंसर प्रगति दिखाया गया है11,12। तदनुसार, यह जाल विविध शारीरिक प्रक्रियाओं की एक बड़ी संख्या में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि प्रतीत होता है। हालांकि, इस तरह के अनुसंधान के उपन्यास प्रकृति को देखते हुए, बहुत जाल उनके प्रभाव डालती है जिसके द्वारा तंत्र के संबंध में elucidated जाना बना रहता है। इस के साथ साथ, हम neutrophils के अभाव में नेट के अलगाव के लिए एक सरल तरीका मौजूद है।

निम्नलिखित वीडियो में, हम मानव पूरे रक्त से नेट अलग करने के लिए एक सरल और आसान तकनीक का प्रदर्शन। सेल मुक्त जाल तो ऐसे आसंजन, प्रसार और प्रवास रूप assays के एक संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सोख्ता, धुंधला, imuunofluorescence सहित इन विट्रो प्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य प्रोटोकॉल हालांकि वे आम तौर पर, लंबा जटिल, महंगा है, और अक्सर, कम उपज 13 हैं, 13, 19 में मौजूद हैं। इस सरल प्रोटोकॉल इसलिए procedu की लंबाई कम से कम बुनियादी अभिकर्मकों का उपयोग करता है और न्यूट्रोफिल को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक कदम की संख्या कम हो जाती हैउपज है जबकि अधिकतम पुनः।

निम्न विधि न्युट्रोफिल अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों पहले से लाइव न्यूट्रोफिल की एक बहुत ही शुद्ध नमूना उपज एक साधारण प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए साहित्य में वर्णित को जोड़ती है। साहित्य में सुझाव दिया है, शिरापरक रक्त EDTA के ट्यूब में एकत्र की है और न्युट्रोफिल सक्रियण 14 से बचने के लिए 10 मिनट के भीतर प्रयोग किया जाता है। हम heparinized पूरे रक्त, शुरू में Boyum एट अल 15 द्वारा वर्णित Ficoll घनत्व centrifugation तकनीक से अनुकूलित एक विधि से granulocytes और लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया (एल एस एम) घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करें। एल एस एम सोडियम metrizoate के लिए सोडियम diatrizoate विकल्प और न्यूट्रोफिल 16-18 अलग करने के लिए कई अध्ययनों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है कि Boyum तैयार करने की एक संशोधन है।

अंतर घनत्व centrifugation, monocytes और लिम्फोसाइटों खारिज कर रहे हैं निम्नलिखित; लाल रक्त कोशिकाओं तो sedimented रहे हैंएक 6% dextran समाधान 14 का उपयोग कर और शेष लाल रक्त कोशिकाओं Trypan नीले और Methylene नीले धुंधला के साथ सत्यापित है जो शुद्ध न्यूट्रोफिल, की आबादी प्राप्त करने के लिए lysed रहे हैं।

कई एजेंटों lipopolysaccharide (LPS), और phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) और interleukins (आईएल 8) 3,5,6 सहित इन विट्रो में और vivo में दोनों NETosis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, अलग-थलग न्यूट्रोफिल apoptosis को 19,20 बढ़ावा देने के बिना सुसंगत और विश्वसनीय नेट गठन की अनुमति के लिए एक पर्याप्त एकाग्रता होना दिखाया गया है, जो चार घंटे के लिए 500 एनएम पीएमए के साथ प्रेरित कर रहे हैं।

अलगाव के बाद, हम इस प्रोटोकॉल से प्राप्त सेल मुक्त जाल एक आसंजन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। DNAse1 पचाने और पहले से वर्णित के रूप में जाल नीचा करने के लिए प्रयोग किया जाता है और इस तरह एक नियंत्रण 2,3,11 रूप में कार्य करता है। अन्य विकल्प नेट formati को बाधित करने के लिए न्युट्रोफिल इलास्टेज अवरोध करनेवाला (नै) के उपयोग में शामिललक्ष्य नेट गठन को बाधित करने के बजाय उनके गिरावट 11 लागू करने के लिए जब एक स्वीकार्य विकल्प है, जो पर। नै विभिन्न कार्यों का एक नंबर है, यह पहले से नेट बयान क्रोमेटिन decondensation, परमाणु degranulation और न्युट्रोफिल मौत 12 की रुकावट के माध्यम से नै से हिचकते जा सकता है कि दिखाया गया है

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगों स्थानीय संस्थागत नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया।

1. रक्त आकर्षित

  1. Antecubital venipucture के माध्यम से, हरी शीर्ष (heparinized) ट्यूबों में एक स्वस्थ स्वयंसेवक से रक्त के 14 ट्यूबों को इकट्ठा करने और बर्फ पर बसने से पहले प्रत्येक ट्यूब पलटना। इष्टतम न्युट्रोफिल उपज सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग की 15 मिनट - 10 के भीतर खून ले लीजिए।

पूरे रक्त से 2. न्युट्रोफिल अलगाव

  1. खून पतला करने के लिए सीए और मिलीग्राम बिना पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ रक्त की प्रत्येक हरी शीर्ष ट्यूब धो लें। 4 एक्स 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से प्रत्येक में, आरटी पर लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया (एल एस एम) के 15 मिलीलीटर जोड़ें। एक तेज एल एस एम-रक्त इंटरफ़ेस बनाने, ध्यान से एल एस एम पर पतला खून परत, एक 60 मिलीलीटर सिरिंज पर मुहिम शुरू की एक 18 जी सुई का उपयोग करना।
    नोट: जितना संभव परतों के मिश्रण से बचें।
  2. ब्रेक के बिना 21 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: अचानक टूट कर सकते हैंविभिन्न परतों के मिश्रण के कारण।
  3. तल पर एरिथ्रोसाइट्स और न्यूट्रोफिल तलछट का निरीक्षण करें। महाप्राण और केवल नीचे लाल परत छोड़, लिम्फोसाइटों और मोनोन्यूक्लियर सेल शामिल हैं जो इन परतों के बीच इंटरफेस से छुटकारा पाने के लिए सुनिश्चित शीर्ष दो परतों (प्लाज्मा और एल एस एम) बनाने त्यागें।
  4. प्रत्येक ट्यूब, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 20 मिलीलीटर 6 के% dextran समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे एरिथ्रोसाइट्स और neutrophils की परत के साथ मिश्रण है और 30 मिनट के लिए आरटी पर बैठने के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक ट्यूब पलटना।
    नोट: यह लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) तल पर तलछट के लिए अनुमति देगा।
  5. 30 मिनट के बाद, ताजा ट्यूबों में न्युट्रोफिल अमीर सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण और आरबीसी छर्रों त्यागें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर अपकेंद्रित्र supernatants। Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली ज्यादातर न्यूट्रोफिल और कुछ लाल रक्त कोशिकाओं में शामिल होंगे।
  6. बाँझ पानी की 4.5 मिलीलीटर के लिए बफर lysing के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर एक lysing समाधान तैयार है। Lyse टी के साथ आरबीसी शेषवह एक ट्यूब में सभी resuspended छर्रों के हस्तांतरण, समाधान lysing के 5 मिलीलीटर तैयार किया। 10 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी पर सेल की अनुमति दें।
  7. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और किसी भी शेष lysing समाधान से छुटकारा पाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर फिर सीए और मिलीग्राम और सेंट्रीफ्यूज के बिना 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ गोली धोने। इस बिंदु पर प्राप्त की गोली न्यूट्रोफिल शामिल हैं। ठंड 3% RPMI के 30 मिलीलीटर में गोली Resuspend और बर्फ पर डाल दिया।
    नोट: 3% RPMI के साथ RPMI मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा किया जाता है 3% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)
  8. Methylene नीले धुंधला का उपयोग नमूना की शुद्धता को सत्यापित करें। > कोशिकाओं के 95% बहु लोबार नाभिक के साथ granulocytes होना चाहिए। > सत्यापित कोशिकाओं के 95% व्यवहार्यता और अंतिम न्युट्रोफिल उपज गिनती करने के लिए Trypan नीले धुंधला का प्रयोग करें। 5 एक्स 10 6 न्यूट्रोफिल / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बर्फ का ठंडा 3% RPMI में न्यूट्रोफिल पतला।

3. जाल पीढ़ी

  1. 500 एन के साथ न्यूट्रोफिल उत्तेजितपीएमए के एम (न्युट्रोफिल समाधान के 30 मिलीलीटर प्रति) और 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में 4 घंटे के लिए 20 मिमी ग्रिड के साथ एक 150 एक्स 25mm फ्लैट टिशू कल्चर पकवान पर सेते हैं। इस NETosis अनुमति देगा।
  2. उत्तेजना के चार घंटे के बाद, धीरे तल पर पालन नेट और neutrophils की परत छोड़, महाप्राण और मीडिया त्यागें। इस परत को बाधित न करें।
  3. पकवान प्रति सीए और मिलीग्राम बिना ठंड पीबीएस के 15 मिलीलीटर की कुल का प्रयोग, नीचे से सभी अनुयायी सामग्री लिफ्ट बंद करने के क्रम में डिश के तल पर पीबीएस के 15 मिलीलीटर pipetting द्वारा प्रत्येक पकवान के नीचे धोने।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 10 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक पकवान (कदम 3.3) धोने से प्राप्त समाधान लीजिए। न्यूट्रोफिल और किसी भी शेष कोशिकाओं को एक सेल मुक्त नेट युक्त सतह पर तैरनेवाला छोड़ने के तल पर गोली जाएगा।
  5. फूट डालो 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर 10 मिनट के लिए स्पिन। यह सब डीएनए गोली के लिए अनुमति देगा।
    नोट: बड़ा टू में केन्द्रापसारणbes के अन्यथा उच्च गति सूक्ष्म सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करने के क्रम में छोटे ट्यूबों में supernatants को विभाजित करने की आवश्यकता होगी, इस तरह के उच्च गति नियमित सेंट्रीफ्यूज पर प्राप्य हैं अगर काफ़ी आसान और कम समय है।
  6. पीबीएस के 100 μl प्रति 2 10 x 7 न्यूट्रोफिल को इसी एक एकाग्रता के लिए बर्फ के ठंडे पीबीएस में एक साथ प्राप्त सभी छर्रों सतह पर तैरनेवाला त्यागें और resuspend। यह बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सेल मुक्त नेट शेयर निकलेगा।
  7. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या वैकल्पिक डीएनए मात्रा का ठहराव उपकरण का उपयोग कर प्राप्त नमूने में डीएनए एकाग्रता उपाय। 180 एनजी / μl - नमूने में एक पर्याप्त एकाग्रता 140 के बीच सीमा होनी चाहिए।

4. नेट कैंसर सेल स्टेटिक आसंजन परख

  1. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोट कुओं हे / एन करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में अच्छी तरह से प्रति पहले से प्राप्त नेट शेयर के 100 μl जोड़ें और अनुमति देते हैं।
  2. बाद में घंटा 12 और 20 के बीच, सेल के एक समान monolayer के गठन को सत्यापितमाइक्रोस्कोप के तहत कुओं के तल पर मुक्त जाल (चित्रा 1)। इस बिंदु पर, धीरे तल पर नेट monolayer को बाधित करने के लिए यकीन नहीं कर रही है, कुओं से बाहर सभी गैर-पक्षपाती सामग्री aspirate।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अवरुद्ध समाधान के 100 μl जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
  4. 0.25% trypsin समाधान के 2 मिलीलीटर का उपयोग करने का एक टी-75 कुप्पी से A549 कैंसर की कोशिकाओं को अलग करें। एक बार, अलग 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर trypsinized कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र A549 मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 100 μl मीडिया के अनुसार 2 X10 4 कैंसर की कोशिकाओं के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागें।
    नोट: A549 कोशिकाओं को अलग से बड़े हो रहे थे। संक्षेप में, कोशिकाओं सुसंस्कृत थे और 10% FBS और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में incubated युक्त DMEM F12 के मीडिया में बनाए रखा। 70 बार - 80% सेल संगम तक पहुँच गया था, वे 0.25% trypsin-EDTA का उपयोग अलग है और एक ही मीडिया में resuspended थेऊपर वर्णित है।
  5. मीडिया के प्रति मिलीलीटर CFSE की एक μl जोड़ने और 10 मिनट के लिए आरटी पर दाग छोड़ दें द्वारा CFSE का उपयोग कर दाग कैंसर की कोशिकाओं। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर धुंधला, अपकेंद्रित्र नीचे के बाद तो 100 μl मीडिया के अनुसार 2 X10 4 कैंसर की कोशिकाओं के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया की प्रारंभिक मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागने।
  6. धीरे महाप्राण अवरुद्ध समाधान और प्रति अच्छी तरह से नेट monolayer से अधिक, 100 μl के बराबर है जो मीडिया में दो X10 4 कैंसर की कोशिकाओं को जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 पर 90 मिनट के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं, अवरुद्ध नेट के 1 घंटे के बाद। धीरे कोशिकाओं महाप्राण और किसी भी गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस के 100 μl जोड़ें।
  7. कुछ कुओं में, नेट नीचा करने के लिए धोने से पहले 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति DNAse1 की 1000U जोड़ें। इस रूप में नकारात्मक नियंत्रण में काम करेंगे। अन्य कुओं में, वाहन नियंत्रण (कुलपति) के रूप में काम करेगा, जो 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति बाँझ पानी के 100 μl जोड़ें।
    नोट: 3 conditio प्रति replicatesएन आम तौर पर नमूने का आकार बढ़ाने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं।
  8. महाप्राण कुओं तल पर ही नेट और पक्षपाती कैंसर की कोशिकाओं को छोड़ने में सभी समाधान त्यागें और। (चित्रा 1) नेट के लिए पक्षपाती कैंसर की कोशिकाओं को ठीक करने और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे परख पढ़ने के लिए अच्छी तरह से प्रति 4% formaldehyde के समाधान के 100 μl जोड़ें। प्लॉट और परिणामों का विश्लेषण (चित्रा 3)।

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Representative Results

नेट के साथ एक स्थिर आसंजन परख के सफल उपलब्धि कैंसर कोशिकाओं के अलावा पहले नेट के एक monolayer (चित्रा 1) के साथ कुओं की पर्याप्त कोटिंग की आवश्यकता है। सभी बाद के चरणों कि परत को बाधित करने के लिए नहीं सावधानी से किया जाना चाहिए। नेट की एक पर्याप्त परत का गठन किया गया है, जब यह 2A चित्रा और -2 सी के रूप में देखा नेट के लिए महत्वपूर्ण कैंसर की कोशिकाओं आसंजन देखने की उम्मीद है। इस आशय आंकड़े 2B और 2 डी के रूप में देखा जाल degrades जो DNAse1 के अलावा, द्वारा निराकृत किया जाता है। इसके विपरीत, वाहन नियंत्रण (चित्रा 3) की उपस्थिति में नेट के लिए A549 आसंजन में कोई उल्लेखनीय कमी नहीं होनी चाहिए। उच्च शक्ति क्षेत्र (HPF) प्रति मतलब कैंसर कोशिका आसंजन का एक अच्छा अनुमान प्राप्त करने के लिए, यह अच्छी तरह से प्रति कम से कम 4 यादृच्छिक HPFS गिनती करने के लिए सिफारिश की है। अच्छी तरह से तकनीकी मुद्दों के कारण जाल में लेपित नहीं कर रहे हैं क्षेत्रों है कि देश के लिए ध्यान में नहीं लिया जाना चाहिएइन के रूप में ting के परिणामों को मिथ्या सिद्ध हो सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. नेट Monolayer। जाल जाल के (ए) वर्दी monolayer दिखा भर में अच्छी तरह से जाल के एक बाधित परत के साथ अच्छी तरह से (बी) अपर्याप्त कोटिंग करने के लिए विरोध के रूप में साथ लेपित 96 कुओं थाली कुओं की लाइट माइक्रोस्कोपी छवियों। स्केल सलाखों 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
इन विट्रो में नेट के लिए चित्रा 2. A549 कैंसर कोशिका आसंजन। (ए) A549 कैंसर की कोशिकाओं (तीर) इन विट्रो में नेट की monolayer का पालन करें। (बी) AdditiDNAse1 काफी कैंसर कोशिका आसंजन का स्तर घटने के पर; (सी) (सी) के पहले और DNAse1 (डी) के बाद इसके अलावा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (Nikon TE300) के तहत फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत नेट पर कैंसर कोशिका आसंजन के एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। स्केल सलाखों 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
इन विट्रो आसंजन परख। GraphPad सॉफ्टवेयर के लिए चित्रा 3. परिणाम नेट के लिए A549 कैंसर कोशिका आसंजन परख से परिणाम साजिश और विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। DNase की उपस्थिति में, आसंजन अनुपचारित नेट के लिए की तुलना में 13.90% थी। वाहन नियंत्रण (कुलपति) की उपस्थिति में, आसंजन अनुपचारित नेट के लिए की तुलना में 77.26% थी। डाटा मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है +/-सेम। महत्व ** पी <0.001 साथ Kruskall वालिस परीक्षण का उपयोग निर्धारित किया गया था।

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Discussion

इस वीडियो में प्रदर्शन न्युट्रोफिल कोशिकी जाल अलगाव प्रोटोकॉल न्युट्रोफिल अलगाव और NET गठन के लिए साहित्य में इस्तेमाल विभिन्न तकनीकों को जोड़ती है। यह एक काफी जटिल और चर प्रक्रिया को सरल और अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में कम चरणों के साथ शुद्ध सेल मुक्त जाल अलग करने के लिए एक बहुत ही विश्वसनीय और replicable तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों प्रोटोकॉल सादगी को जोड़ने में कार्यरत हैं और काफी इसकी लागत को कम करने। एक स्थिर आसंजन परख की ओर नेट के आवेदन नेट एकाग्रता आसानी से एक विशेष लक्ष्य (17) के अनुरूप करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है, के रूप में इस अलगाव तकनीक द्वारा afforded लचीलापन प्रदर्शित करने के लिए कार्य करता है। तदनुसार, का प्रदर्शन तकनीक द्वारा पृथक जाल फ्लो के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता, गतिशील आसंजन assays के, माइग्रेशन assays के प्रसार assays के इम्यूनोफ्लोरेसेंस और confocal इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित assays के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि इस प्रोटोकॉल में कदम की एक संख्या हैं। सबसे पहले, न्यूट्रोफिल गलती से apoptosis के लिए अग्रणी अलगाव की प्रक्रिया के दौरान सक्रिय किया जा सकता है। यह कदम के बीच लंबे समय से प्रतीक्षा समय, धूआं हुड के तहत बाँझ शर्तों के तहत सभी अलगाव चरणों का प्रदर्शन ट्यूबों के आक्रामक मिश्रण से बचने, आरबीसी lysis के कदम के बाद बर्फ पर सभी नमूनों रखने के लिए, और से बचने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। परख का लक्ष्य आसंजन का आकलन करने के प्रयोजन के लिए कोट वेल्स को अगर दूसरा, यह इस एक भी सुनिश्चित होगा के रूप में "शुद्ध स्टॉक" में प्रस्तावित अंतिम डीएनए एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति सुझाव नेट एकाग्रता का सम्मान करने के लिए महत्वपूर्ण है नेट की और लगातार monolayer। कम एकाग्रता अच्छी तरह से केवल बद कोटिंग और इसलिए कम विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन हो सकता है। अंत में, यह अपने विघटन को रोकने के लिए परख प्रदर्शन करते हुए बहुत सावधानी से नेट monolayer की संभाल करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। इस समायोजन करके की जा सकती हैकुओं के पक्षों पर सक्शन और pipetting की तीव्रता।

इस तकनीक की सीमाओं यह अभी भी ज्यादातर 4 घंटा पीएमए उत्तेजना कदम की वजह से नेट, निर्माण करने के लिए समय का एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है कि इस तथ्य शामिल हैं। इसके अलावा, खून का एक महत्वपूर्ण राशि एक प्रयोग के लिए आवश्यक neutrophils के लिए पर्याप्त संख्या में अलग-थलग करने की आवश्यकता है। निश्चित रूप से पहले centrifugation कदम पर नेट की एक महत्वपूर्ण राशि की कमी हो जाती है (3.4 कदम।) न्यूट्रोफिल discarding जब। संशोधन काफी अंतिम नेट उपज में वृद्धि कर सकता है इस बिंदु पर शुद्ध घाटा कम करने के लिए। सावधान प्रयोग की योजना बना और समय प्रबंधन की आवश्यकता है जो उनके अलगाव के 24 घंटा - इसके अलावा, पृथक जाल 12 के भीतर किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Wisent 311-425-CL
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent 305-010-CL
Dextran hydrochloride (powder) Spectrum DE130 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder
RPMI-1640 Medium with L-glutamine Wisent 350-000-CL 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum
BD Pharm Lyse Lysing buffer BD Biosciences 555899
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Alrdrich P8139
DNAse1 Roche 11284932001
F12 DMEM Wisent 319-075-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
CFSE Invitrogen C1157
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) Falcon 353025

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References

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  1. Hi,I have some questions.
    I am trying to get NET stock from poly-L-lysine coated 24well plate, just washing with PBS, but , NET are so strong and tough to remove off and correct.
    Are there any techniques to collect NET stock? Could you give me some adivices?
    Can I use cell scrayper?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2017 - 3:52 AM

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