Immunology and Infection
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नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन
Chapters
Summary November 27th, 2019
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यहां, हम न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) और ऑपरेटिंग नेटक्वांट पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों में एनईटीएस के परिमाणीकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित सॉफ्टवेयर विकल्प है।
Transcript
यहां हम नेटक्विंट पेश करते हैं, जो जाल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित दृष्टिकोण है। यह शोधकर्ताओं को कई उपयोगकर्ताओं और शर्तों द्वारा उत्पन्न डेटा से तुलनीय छवि विश्लेषण करने में मदद करेगा । इस तकनीक के फायदे उपयोग में आसानी, एकल-कोशिका डेटा विश्लेषण, नेट गठन का मूल्यांकन करने के लिए कई मानदंड, और कई छवियों का निष्पक्ष विश्लेषण है।
विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित करें और खोलें। एक अप-टू-डेट संस्करण ज़ेनडो गिटहब आर्काइव या नॉर्डोनफेल्ट लैब वेबसाइट पर पाया जा सकता है। सेटअप टैब में, स्रोत मेनू में प्राप्त पथ विकल्प पर क्लिक करके विश्लेषण के लिए एक स्रोत फ़ोल्डर चुनें।
विश्लेषण किए जाने वाले इमेज सीक्वेंस वाले फोल्डर का चयन करें। फिर, लक्ष्य मेनू में पाथ ऑप्शन पर क्लिक करें, और इमेज एनालिसिस के बाद डेटा को सेव करने के लिए टारगेट फोल्डर चुनें । इसके बाद, अलग चैनल छवियों का उपयोग करते समय, चैनल फ़ोल्डर्स का नाम दें ताकि डीएनए चैनल परमाणु डीएनए दाग से मेल खाता है, और नेट चैनल छवियों में न्यूट्रोफिल इलास्टेज दाग को दर्शाता है।
इसके अलावा, नियंत्रण छवि फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर को नियंत्रण के रूप में नाम दें। इसके बाद, लोड इमेज इंफॉर्मेशन बटन पर क्लिक करें और इमेज मेटाडेटा को सॉफ्टवेयर में लोड करें। फिर चैनल ऑर्डर सब-मेनू में, छवियों में निहित सही चैनल ऑर्डर का चयन करें।
यह आकस्मिक बेमेल को रोकने में मदद करता है। अब कच्चे डेटा से प्राथमिक छवि गुण प्राप्त करने और छवियों को परिवर्तित करने के लिए तैयार डेटा बटन पर क्लिक करें। परिवर्तित छवियां फिर नमूना प्रकार उप-मेनू में दिखाई देंगी।
नमूना प्रकार मेनू पर क्लिक करें, उप-मेनू से एक छवि का चयन करें और क्रमशः डीएनए और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप, या नेट चैनल में विभाजित छवियों को प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा पर क्लिक करें। कोशिकाओं को अपने संबंधित चैनलों में विभाजित करने के लिए, विभाजन विधि टैब का चयन करें, और डीएनए और नेट चैनलों दोनों के लिए विधि उप-मेनू में एक विधि का चयन करें। विभाजन की डिफ़ॉल्ट विधि अनुकूली के लिए सेट है और अनुशंसित सेटिंग है।
ग्लोबल एज और चांवित सहित अन्य विकल्प सॉफ्टवेयर में उपलब्ध हैं। बारीकी से रखी गई कोशिकाओं या एनईटी के बीच अंतर करने में मदद करने के लिए एक वाटरशेड विकल्प भी शामिल किया गया है । इसके अलावा सेगमेंटेशन टैब में सेगमेंट कंट्रोल सैंपल्स ऑप्शन पर क्लिक करें।
फिर नमूना प्रकार उप-मेनू से पीएमए का चयन करें और डेटा सेट में शामिल सभी छवियों के विभाजन को शुरू करने के लिए बैच विकल्प पर क्लिक करें। इसके बाद, नमूना प्रकार मेनू में छवियों का चयन करें और पोस्ट-सेगमेंटेशन उत्पन्न डीएनए और नेट मास्क दोनों के लिए बाइनरी इमेज मास्क की कल्पना और सत्यापन करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें। अब, विश्लेषण टैब में, नियंत्रण नमूनों का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित सीमा बटन पर क्लिक करें।
फिर, दाहिने हाथ की ओर, नमूना प्रकार को पीएमए में बदलें और उत्तेजित नमूनों के विश्लेषण को पूरा करने के लिए गेट सेल गुण बटन पर क्लिक करें। इसके बाद, नमूना प्रकार उप-मेनू से एक छवि का चयन करें और छवि में ओवरले और कोशिकाओं और नेट बनाने वाली कोशिकाओं की संख्या प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें। नमूना प्रकार उप मेनू से नमूना का चयन करके शुरू करो।
विश्लेषण के लिए नमूना प्रकार उप-मेनू से अलग-अलग छवियों का चयन किया जा सकता है या बैच विकल्प का चयन करके छवियों के पूरे बैच का विश्लेषण किया जा सकता है। एक बार चयनित होने के बाद, विश्लेषण पूरा करने के लिए विश्लेषण NETs बटन पर क्लिक करें। किसी दिए गए नमूने के लिए इष्टतम परिणाम देने के लिए नेट मापदंड को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
पहचान की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मूल छवियों के साथ पहचाने गए NETs की तुलना करें। एक बार जब यह चरण पूरा हो जाता है, तो डेटासेट में सभी छवियों में नेट मानदंड लागू किए जा सकते हैं। नेट मानदंडों में किए गए किसी भी परिवर्तन को भी एक साथ सभी नियंत्रण नमूनों पर लागू किया जाता है।
सेल डेटा उप-मेनू में डेटा सारांश का निरीक्षण करें, जहां छवियों की संख्या, प्रति छवि सेल गिनती, और प्रति छवि NETs का प्रतिशत प्रदर्शित किया जाता है। रिजल्ट आउटपुट को चुनने और देखने के लिए आउटपुट टैब डालें। आउटपुट के रूप का चयन करके और आउटपुट परिणाम बटन पर क्लिक करके नियंत्रण और पीएमए-उपचारित नमूनों के विश्लेषण से उत्पन्न विभिन्न डेटा आउटपुट का अन्वेषण और तुलना करें।
इसके बाद, एकल-सेल डेटा का पता लगाने के लिए परिणाम डेटा टेबल सीएसवी फाइल लॉन्च करें और नमूनों में नेट क्षेत्र वितरण और डीएनए से नेट अनुपात की कल्पना करने के लिए पीडीएफ फाइलों के परिणामों पर क्लिक करें। लाल रेखा रेखांकन में सीमा मूल्य को इंगित करती है। अंत में, डीएनए के आकार बनाम नेट क्षेत्र निर्धारित करने के लिए परिणाम द्विविध वितरण फ़ाइल पर क्लिक करें ।
यहां, नियंत्रण न्यूट्रोफिल की 15 छवियों और पीएमए द्वारा उत्तेजित न्यूट्रोफिल की 15 छवियों का दस मिनट के तहत विश्लेषण किया गया । कोशिकाओं की कुल संख्या गिना गया और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत इस लेख में वर्णित स्वचालित मात्राकरण विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल में एक बड़ा क्षेत्र है, परमाणु विरूपण में वृद्धि हुई है, और नियंत्रण नमूनों की तुलना में शुद्ध अनुपात के लिए एक उच्च डीएनए है ।
जब एक 3 डी ग्राफ में संयुक्त, PMA उत्तेजित नमूनों को नियंत्रण नमूनों की तुलना में समूहों को कसने के क्षेत्रों को दिखाने के लिए करते हैं । प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि हालांकि कई दानदाताओं का उपयोग करके कार्यप्रवाह का परीक्षण किया गया था, यह सिफारिश की जाती है कि उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत डेटा सेट के आधार पर सॉफ्टवेयर मापदंडों पर उचित रूप से निर्णय लेना चाहिए।
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