직접 마우스 외상 / 이소성 골화의 모델을 굽기

1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry
Medicine

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Peterson, J. R., Agarwal, S., Brownley, R. C., Loder, S. J., Ranganathan, K., Cederna, P. S., Mishina, Y., Wang, S. C., Levi, B. Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification. J. Vis. Exp. (102), e52880, doi:10.3791/52880 (2015).

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Abstract

Protocol

윤리 문 : 실험 동물 연구를위한 연구소의 여덟 번째 판 (ILAR, 2011)과 같다 : 모든 동물의 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 가이드에 제공된 지침에 정의 된대로 좋은 동물 관행에 엄격한에 따라 수행 하였다 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (PRO0001553)에 의해 승인했다.

1. 마우스 외과 적 치료

참고 : 사용 8-10주 된 C57BL가 / 6 마​​우스. 다른 연령, 배경, 및 생쥐 균주는 또한 상이한 조건 또는 유전 적 테스트를 위해 사용될 수있다. 프로 시저의 건 절단술 부분에 대한, 얼굴 마스크, 헤어 모자, 멸균 가운, 장갑, 및 악기를 사용하여 멸균 조건을 유지한다. 외과 사이트는 무균 포비돈 - 요오드 살균 입체 재단으로 준비를해야합니다. 37 ° C의 소생 솔루션을 수의학 가열 패드를 사용하고 따뜻하게하여 체온을 피 administra 이전기.

  1. 2.5 % 흡입 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 쉽게 접근 배부 및 뒷다리 - 사지를 떠나 코 콘을 사용합니다. 점막의 적절한 호흡 속도와 착색을 유지하기 위해 이소 플루 란 관리의 속도를 조절하고 근육, 발가락 핀치, 각막 반사를 확인하여 마취을 보장합니다. 절차를 수행하는 동안 건조 눈 부상을 방지하기 위해 마우스의 눈에 개성 안과 연고를 적용합니다. 수술 필드 아래 수의학 가열 패드 또는 온수 순환 장치를 사용하여 적절한 체온을 유지한다.
  2. 무통 수술에 피하 직전에, 부 프레 노르 핀, 0.1 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
  3. 밀접하게 무릎 발 뒤꿈치에서 가위를 사용하여 왼쪽 뒷발에 수술 부위를 면도.
  4. 밀접하게 척추를 통해 시작과 등쪽 정중선의 왼쪽에 면도 영역을 확장, 화상 부상을 수용 할 수있는 영역을 적어도 2cm × 3 cm의 제거, 마우스의 배부를 면도.
  5. 3 교대 포비돈 - 요오드 스크럽을 사용하여 무릎에 뒷발을 포함하여 수술 부위를 준비합니다.
  6. 왼쪽 아킬레스 건의 안쪽면을 따라 세로 절개를 수행합니다. 아킬레스 건 쉽게 시각화 할 수 있도록 절개를 확장; 약 0.5 cm.
  7. 날카로운 조직 가위로 중간에 힘줄의 날카로운 해부와 아킬레스 건 절단술을 수행합니다. 건 아래에있는 조직면에서 조직 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 블레이드 건 중간에 때까지 평면을 따라 해부. 급격히 건을 절단하기 위해 가위 블레이드를 닫습니다.
    참고 : 비복근, 가자미근과 족저 건을 포함하여 모든 뒤쪽 힘줄의 포함을 확인합니다.
  8. 멸균 거즈로 압력을 적용하여 지혈을 달성 (이 최소한의 출혈을해야한다)와 5-0 vicryl 스티치로 피부 절개를 닫습니다.
  9. 대략 measuremen와 35g의 무게 알루미늄 블록 등의 부분 층 화상을 수행TS 2cm X 2cm X 3cm 17 초간 마우스의 등쪽에 도포 면도 수욕에서 60 ° C로 가열 하였다.
    주 : 그러나 즉, 블록에 추가적인 압력을 가하지 않도록, 블록의 전체 표면 영역은 마우스와 접촉하는 것을 보장하는, 마취 된 쥐의 상부에 블록을 놓아 적절한 화상 농도를 달성 할 중력 허용 장소에 블록을 들고있는 유일한 힘. 블록의 일 측면에 부착 된 얇은 플라스틱 핸들 온수욕에서 조작, 안정화, 및 검색을 위해 편리하다. 이는 약 30 %의 총 체 표면적이 8-10 주 된 C57BL / 6 마​​우스에 화상이 생성됩니다. 이 접촉 화상으로 인해 상처를 통해 화상 깊이의 균일과 동물 사이의 재현성에 다른 방법 (불꽃 또는 소독 번)를 통해 선정되었다.
  10. 거즈로 화상 부위를 건조하고 tegaderm 드레싱을 적용합니다.
  11. 따뜻하게 소생술 유체를 관리 : 락 테이트 링거액 1 ml에복강 내 주사하고 0.5 mL를 피하 주사. 소생이 한 시간 관리는 화상 부상과 건 절단술에서 복구에 적합합니다.
    참고 : 마우스가 완전히 회복 될 때까지 모니터링에서 깨끗한 케이지에 개별적으로, 다른 마우스와 주택 케이지에 집에 마취 된 쥐를 반환하지 않습니다. 일반적인 복구는 1-6 시간 내에 발생합니다. 굽​​기 사이트는 일반적으로 2~4주 내에 치유하고 깨끗한 주거 환경에서 보관하는 경우는 거의 창상 감염에 의해 복잡하지 않습니다.
  12. 부 프레 놀핀 0.1 ㎎ / ㎏ 피하 주사에게 절차에 따라 3 일간 매 12 시간을 관리 할 수​​ 있습니다. 적절한 간격으로 일련 μCT 검사와 HO의 성장을 모니터링합니다. 자궁외 뼈의 성장이 먼저 μCT에 의해 분명 약 삼주 수술 후입니다.
    참고 : HO 개발의 대부분은 수술 후 구주로 완료됩니다. 우리는 15 주에 검사 μCT 단일 엔드 포인트에 비해 15주에 대한 격주 호 볼륨 또는 반복 μCT와 위치의 차이를 스캔 관찰되지 않았다.실험의 끝에서, 제도적 지침에 따라 CO 2 흡입으로 모든 쥐를 안락사와 10 분 후 자궁 전위와 죽음을 확인합니다.

2. μCT 수집 및 분석

  1. 발생하기 쉬운 위치에 스캐너 침대에 마취 마우스를 고정합니다. 동 잡음 호흡 방지하기 위해 침대에 단단히 뒷다리를 테이프입니다. 이미지 보정을위한 마우스 아래에 팬텀이 포함 된 공기, 물, 및 하이드 록시 아파타이트를 포함합니다.
  2. 뼈 분석 소프트웨어를 열고 근위 말단 뒷발의 선단에 고관절에서 양쪽 뒷다리를 포함 ROI (region of interest)를 정의한다. 다음 매개 변수를 사용하여 이미지를 얻습니다. 80 kV로, 500 μA 및 1,300 밀리 초 노출, 48 μm의 복셀 크기를 14, 15를
  3. 에 해당 필드에 평균 밀도를 세 팬텀 챔버의 각 투자 수익 (ROI)을 그리기 및 입력하여 하운 스 필드 단위 (HU)에 이미지를 보정소프트웨어.
  4. 왼쪽 뒷다리의 경골 평행 동소 피질골 구조 및 HO의 묘사를위한 명확한 해부학 뷰를 허용하는 Z 축을 따라하므로 소프트웨어 "그래버"툴을 사용하여, 화상을 재 방향.
  5. HO가 발견 될 때까지 무릎에서 시작하여, 이미지 조각을 원심으로 스크롤합니다. 수동 스플라인 도구를 사용하여 발을 통해 또는 HO가 초과 될 때까지 원심 계속 매 5 번째 조각에 자궁외 뼈 주변의 투자 수익 (ROI)을합니다. 확장하고 모든 호를 포함하는 하나의 투자 수익 (ROI)에 함께 로아 스티치 추정 해 도구를 사용합니다.
  6. 3D 투자 수익 (ROI)을 확인하고 분석 메뉴를 선택합니다. 가장 뼈 윈도우 표시 하위 및 상위 임계 값을 설정하여 뼈의 양을 계산한다. 모든 검사에 대해 동일한 고정 임계 값을 사용합니다.

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Representative Results

이 본 연구에서, 프로토콜은 외상의 이전에 발행 된 마우스 모델에 대한 설명 / 호. 14 ~ 17이 부상을 구울 부분 두께의 아킬레스 건 절단술 및 글로벌 염증 모욕과 동시에 지역화 근골격계 손상의 생성을 포함 유도 구울 수 있습니다. 이 시리얼 이미징 따라 할 수있는 건 절단술 사이트에서 반응 뼈의 안정적인 형성을 초래한다. 현재까지 모두 아킬레스 건 절단술을 유지하고 부상을 구울 수있다 (50 이상) 모든 마우스는 건 절단술 사이트에서 HO의 측정 가능한 양을 개발했다. 이소성 골 형성을 정량화하기 위해, 캘리브레이션 화상 μCT 프로토콜은 각각의 원하는 시간 - 시점에서 사용된다. 아킬레스 건 절단술과 함께 화상 부상의 추가는 상당한 HO의 유도에 중요한 것으로 입증되었습니다. 부상 모두가 동시에 일어나는 AC 전압 비교 절단술 사이트에서 이소성 골 형성되어의 양의 상당한 증가가있다hilles의 건 절단술 형 (그림 1). (17)

그림 1
또는 동시 화상을 입지 않고 아킬레스 건 절단술을 다음 그림 1 호 개발. 모든 마우스 왼쪽 뒷다리의 아킬레스 건 절단술을받은 쥐의 절반은 30 % TBSA 부분 두께가 배부에 부상을 구울 받았다. μCT 스캔 오일, 3, 5, 7, 9에 완료되었고, 15 주 부상을 게시. (A). 대표적인 3D 재구성은 소성을 뼈 흰색과 HO 푸른 색으로 표시됩니다. 레드 원은 HO의 niduses을 나타냅니다. 이소성 뼈 절단술의 영역뿐만 아니라, 하체의 손상 부위에 대한 근위 위치에서 발생한다. 호는 clnically 볼 마찬가지로,이 반응 뼈 골격 뼈와 인접 또는 연부 조직에 원격으로 개발할 수 있습니다. (B). HO의 정량화했다 COM보정 화상 프로토콜 pleted 및 그래프에 도시. 호, 15주 넘어 일반적으로 5~9주 사이에 본 가장 큰 성장 속도로 9~15주 사이 그러나 개발 고원을 지속하고있다. 데이터는 * P <0.05, N = 그룹 당 4, 학생의 T는 - 테스트, 수단 ± 표준 편차입니다 (이 이전에 17에서 수정 된 데이터를 게시되어 있습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Laboratory 664 8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso VET one, Boise, ID V1 501017
Buprenorphine – Buprenex Reckitt Benckiser Healthcare NDC 12496-0757-1 0.3 mg/ml solution
Betadine Owens and Minor, Mechanicsville, VA 2047PVP202
5-0 Vicryl sutures Ethicon, Summerville, NJ J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm 3M 1624W Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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