Doğrudan Fare Travma / Heterotopik Kemikleşme Model Yanık

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peterson, J. R., Agarwal, S., Brownley, R. C., Loder, S. J., Ranganathan, K., Cederna, P. S., Mishina, Y., Wang, S. C., Levi, B. Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification. J. Vis. Exp. (102), e52880, doi:10.3791/52880 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Etik bildirimi: Laboratuar Hayvan Araştırmaları Enstitüsü'nden Sekizinci Edition (Ilar, 2011) ve kişi: Bütün hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kılavuzda verilen kılavuzda tanımlanan iyi hayvan uygulamaları ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir Michigan Üniversitesi'nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (PRO0001553) tarafından onaylanmıştır.

1. Fare Cerrahi İşlemleri

NOT: 8-10 haftalık C57BL / 6 fareler. Diğer yaş, arka planlar ve farelerin suşları farklı koşullar veya genetik makyaj test etmek için kullanılır. Prosedürün tenotomi kısmı için, yüz maskesi, saç kaputu ve steril önlük, eldiven ve enstrümanları kullanarak steril koşullar korumak. Cerrahi siteler steril povidon-iyot ve steril draping ile hazırlanmalıdır. 37 ° C resüsitasyon çözümleri bir veteriner ısıtma yastığı kullanılarak ve ısıtarak hipotermi önlemek yönetilmekteydi önceyon.

  1. % 2.5 solunan izofluran kullanarak fare anestezisi. Kolay erişilebilir dorsum ve arka-bacaklarda bırakmak için bir burun konisi kullanın. Mukoza zarının uygun solunum hızı ve renklerini korumak için izofluran yönetiminin hızını ayarlayın ve kas tonusu, ayak tutam ve kornea refleksi kontrol ederek anestezi sağlamak. İşlem sırasında kuru göz yaralanmasını önlemek için farenin gözlerine mülayim oftalmik merhem sürün. Cerrahi alanının altında bir veteriner ısıtma yastığı veya sıcak su sirkülatör kullanılarak yeterli vücut ısısını korumak.
  2. Analjezi için cerrahi subkutan hemen önce, buprenorfin, 0.1 mg / kg yönetme.
  3. Yakından diz topuktan makası kullanarak sol arka pençe cerrahi siteyi tıraş.
  4. Yakından omurga üzerinde başlayan ve dorsal orta hattın solunda traş alanını genişleten yanık karşılamak için bir alan en az 2 cm x 3 cm temizleyerek, fare dorsumuna tıraş.
  5. 3 alternatif povidon-iyot scrubs kullanarak diz arka pençesine dahil, cerrahi siteyi hazırlayın.
  6. Sol Aşil tendonu medial boyunca uzunlamasına bir kesi yapın. Aşil tendonu kolayca görülebilmesi böylece kesi uzatmak; Yaklaşık 0.5 cm.
  7. Keskin doku makas ile orta noktasında tendonun keskin diseksiyon ile Aşil tenotomisi gerçekleştirin. Tendon altındaki doku düzleminde doku makas biri bıçak yerleştirin ve bıçak tendon orta noktasında olduğu kadar düzlem boyunca teşrih. Keskin tendon koparmaya makas bıçakları kapatın.
    NOT: Gastrocnemius, Soleus ve Plantaris tendonlar da dahil olmak üzere tüm arka tendonların dahil olun.
  8. Steril gazlı bez ile basınç uygulayarak hemostaz (orada en az kanama olmalıdır) ve 5-0 vikril dikiş ile cilt kesisi kapatın.
  9. Yaklaşık ölçümü ile 35 g ağırlığında bir alüminyum bloğu ile dorsal kısmi kalınlıkta yanık gerçekleştirints 2 cm x 2 cm x 3 cm 17 sn için fare traş sırtına tatbik edilen bir su banyosu içinde 60 ° C'ye kadar ısıtıldı.
    Not: Bununla birlikte, yani blok için ek basınç uygulamak bilmek bloğun bütün yüzey alanı fare ile temas halinde olması sağlanır anestezi fare üstünde blok dinlenme uygun yanık derinliği elde için yerçekimi izin yerinde bloğu tutan tek güç. Bloğun bir tarafına bağlı bir ince plastik kolu sıcak su banyosundan manipülasyonu, stabilizasyon ve alınması için uygundur. Bu yaklaşık% 30 toplam vücut yüzey alanı 8-10 haftalık C57BL / 6 fare yanık oluşturur. Bu iletişim yanık nedeniyle yara üzerinde yanık derinliği bütünlüğü ve hayvanlar arasındaki tekrarlanabilirlik diğer yöntemlerle (alev veya haşlanma yanığı) üzerinden seçildi.
  10. Gazlı bez ile yanık sitesini kurulayın ve bir TEGADERM pansuman uygulanır.
  11. Isıtılmış canlandırma sıvıları yönetme: Laktatlı Ringer çözeltisi 1 mlintraperitoneal enjeksiyon ve 0.5 ml deri altı enjeksiyonu. Resüsitasyon Bu tek seferlik idare yanık ve tenotomi kurtarma için yeterli.
    NOT: fareler tamamen iyileşti kadar gözetim altında temiz kafeslerde tek tek diğer fareler konut kafesleri evin anestezi fareler iade etmeyin. Tipik geri kazanım 1-6 saat içinde gerçekleşir. Yanık siteleri genellikle 2-4 hafta içinde iyileşir ve temiz konut ortamlarında muhafaza edilmesi durumunda nadiren yara enfeksiyonu ile komplike olur.
  12. Buprenorfin 0.1 mg / kg deri altı enjeksiyonu prosedüre göre, 3 gün süre ile, her 12 saat uygulayın. Uygun aralıklarla seri uCT taramaları ile HO büyüme izleyin. Ektopik kemik büyümesi ilk uCT tarafından belirgin yaklaşık 3 hafta post-op olduğunu.
    NOT: HO geliştirme çoğunluğu post-op 9 hafta tamamlandı. Biz 15 haftada tarama uCT tek uç noktaya göre 15 hafta süreyle iki haftalık HO hacim veya tekrarlanan uCT ile yerde fark tarar gözlenen değil.Deneylerin sonunda, kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon sahip tüm fareleri euthanize ve 10 dakika sonra servikal dislokasyon ile ölüm doğrulayın.

2. uCT Toplama ve Analizi

  1. Yüzüstü pozisyonda tarayıcı yatağına anestezi fare sabitleyin. Hareket objeyi nefes önlemek için yatağa sıkıca arka bacaklarda bantlayın. Görüntü kalibrasyonu için fare altındaki hayalet içeren hava, su ve hidroksiapatit ekleyin.
  2. Kemik Analizi yazılımı açın ve proksimal distale arka pençe ucuna kalça eklemi hem arka bacaklarda kapsar faiz (ROI) bir bölgeyi tanımlamak. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir görüntü elde. 80 kV, 500 uA ve 1.300 msn maruz kalma, 48 mikron voksel boyutu 14,15
  3. Uygun alanlara ortalama yoğunluğu üç hayalet odalarının her birinde bir yatırım getirisi çizerek ve girilerek Hounsfield üniteleri (HU) görüntü kalibreyazılımı.
  4. Sol arka bacak tibia paralel ortotopik kortikal kemik yapıları ve HO belirlenmesi için net anatomik görünüm sağlamak için Z ekseni boyunca yani yazılımdaki "kapmak" aracını kullanarak, görüntüyü yeniden yönlendirin.
  5. HO karşılaştı kadar diz başlayarak, görüntü dilimleri boyunca distale ilerleyin. Manuel spline aracını kullanarak, pençe üzerinden veya HO aştı kadar distale devam her 5 inci dilim ektopik kemik etrafında bir ROI yapmak. Genişletmek ve tüm HO içeren tek bir ROI bir araya İB'leri dikiş tahmin etmek aracını kullanın.
  6. 3D yatırım getirisi yapın ve analiz menüsünü seçin. En iyi kemik penceresini göstermek alt ve üst eşik değerlerini ayarlayarak kemik hacmini hesaplayın. Tüm taramalar için aynı sabit eşik değerlerini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmamızda, protokol travma önce yayınlanan fare modeli tarif edilmiştir / HO. 14-17 Bu yanık kısmi kalınlıkta bir Aşil tenotomisinin ve küresel inflamatuar hakaret ile eş zamanlı lokalize kas-iskelet yaralanması oluşturulmasını içerir kaynaklı yanık. Bu seri görüntüleme ile takip edilebilir tenotominin sahasında reaktif kemik güvenilir oluşumu ile sonuçlanır. Bugüne kadar, hem Aşil tenotomisi sürekli ve yanık var (50'den fazla) tüm fareler tenotomi yerinde HO ölçülebilir miktarda geliştirdik. Ektopik kemik oluşumunu ölçmek için, kalibre edilmiş bir görüntü uCT Protokol, arzu edilen bir zaman noktasında kullanılır. Aşil tenotomisinin ile kombinasyon halinde bir yanık eklenmesi önemli HO indüklenmesinde önemli olduğu kanıtlanmıştır. Her iki yaralanmalar eş zamanlı oluyor ile Ac karşılaştırıldığında tenotomi yerinde oluşturulan ektopik kemik miktarında önemli bir artış varHilles tenotominin Yalnız (Şekil 1). 17

Figür 1
Veya eş zamanlı yanık olmadan Aşil tenotomisi aşağıdaki Şekil 1. HO gelişimi. Tüm fareler, sol arka bacak bir Aşil tenotomi aldı farelerin yarısı da% 30 TBSA kısmi kalınlıkta sırtlarında yanık aldı. uCT taramalar 5 gün ve 3, 5, 7, 9, tamamlanmış ve 15 hafta hasardan. (A). Temsili 3D rekonstrüksiyonlar ortotopik kemik beyaz ve HO mavi renkli gösterilir. Kırmızı çevreler HO niduses göstermektedir. Ektopik kemik tenotomisi alanı yanı sıra alt ekstremite yaralanması sitesine uzak ve yakın yerlerde gelişir. HO clnically görülen benzer şekilde, bu reaktif kemik iskelet kemik ile bitişik olabilir ya da yumuşak dokuda uzaktan gelişebilir. (B). HO miktarının oldu comBir kalibre edilmiş görüntü protokolü ile tamamlamış ve grafikte gösterilmiştir. HO, 15 hafta ötesinde, tipik 5-9 hafta arasında görülen en büyük büyüme hızı ile 9-15 hafta arasında ancak gelişme yaylaları devam etmiştir. Veriler * p <0.05, n = grup başına 4, Student t-testi, ortalama +/- SD vardır (Bu daha önce 17'den değiştirilmiş verileri yayınlandı olduğunu unutmayın). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Laboratory 664 8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso VET one, Boise, ID V1 501017
Buprenorphine – Buprenex Reckitt Benckiser Healthcare NDC 12496-0757-1 0.3 mg/ml solution
Betadine Owens and Minor, Mechanicsville, VA 2047PVP202
5-0 Vicryl sutures Ethicon, Summerville, NJ J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm 3M 1624W Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26, (6), 1166-1177 (2011).
  2. Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26, (6), 1163-1165 (2011).
  3. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27, (5), 1004-1017 (2012).
  4. Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
  5. Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37, (3), 129-136 (2005).
  6. Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27, (8), 1746-1756 (2012).
  7. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
  8. Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32, (5), 1289-1300 (2014).
  9. Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25, (6), 1208-1215 (1359).
  10. Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259, (5), 993-998 (2014).
  11. Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21, (5), 655-667 (2012).
  12. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25, (8), 506-510 (2011).
  13. Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471, (5), 1584-1592 (2013).
  14. Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6, (255), 255ra132 (2014).
  15. Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54, (1), 28-34 (2013).
  16. Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32, (11), 1416-1423 (2014).
  17. Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. (2014).
  18. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1, (8), 174-179 (2012).
  19. Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27, (4), 535-540 (2006).
  20. Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
  21. Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57, (2), 335-342 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics