Fremstilling af et bioaktivt, PCL-baserede "Self-montering" formhukommelse polymerskelet

1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Material Science and Engineering, Texas A&M University, 3Institute of Advanced Materials and Technology, University of Science & Technology Beijing
Published 10/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Nail, L. N., Zhang, D., Reinhard, J. L., Grunlan, M. A. Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold. J. Vis. Exp. (104), e52981, doi:10.3791/52981 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I øjeblikket betragtes som den gyldne standard for kranio-maxillofacial (CMF) knogle defekt behandlinger, er transplantation af høstede autologe podninger hindres af komplekse podning procedurer donor websted sygelighed og begrænset tilgængelighed 1. Et særligt problem er at forme og af stive autograft stramt i defekten for at opnå osseointegration og for at forhindre graft resorption. Tissue engineering er blevet undersøgt som en alternativ strategi til at selvpodning og syntetiske knogle substitutter (f.eks bone cement) 2,3. Afgørende for succes af et væv engineering tilgang er et stillads med et bestemt sæt af egenskaber. Først, med henblik på at opnå osseointegration, skal stilladset danne tæt kontakt med tilstødende knoglevæv 4. Stilladset skal også være osteokonduktiv, tillader celle migration, næringsstof diffusion og neotissue deposition 4,5. Denne adfærd er generelt opnås med biologisk nedbrydelig scaffolds udviser en høj grad indbyrdes forbundne pore morfologi. Endelig bør skafottet være bioaktive for at fremme integration og limning med omgivende knoglevæv 5.

Her præsenterer vi en protokol til at forberede en vævsteknologi stillads med disse egenskaber. Det er vigtigt, dette stillads udviser evnen til at "self-fit" i uregelmæssige CMF fejl på grund af dens formhukommelse adfærd 6. Termoresponsiv polymerer med formhukommelse (SMPS) vides at undergå formændring ved udsættelse for varme 7,8. SMP'er består af "NETPoints" (dvs. kemiske eller fysiske tværbindinger), som bestemmer den permanente form og "Skift segmenter", som opretholder den midlertidige form og inddrive den permanente form. Kontaktelementerne segmenter udviser en termisk overgangstemperatur (T trans) svarende til enten glasovergangen (Tg) eller smelte overgangen (T m) af polymeren. Somet resultat, kan SMP'er sekventielt deformeres til en midlertidig form ved T> T trans, der er fastsat i den midlertidige form ved T <T trans, og udvindes til den permanente form ved T> T trans. Således kunne en SMP stillads opnå "self-fitting" inden for en CMF defekt som følger 6. Efter udsættelse for varme saltvand (T> T trans), ville en SMP stillads blive plastisk, tillader en generisk forberedt cylindrisk stillads til at være hånd-presses ind en uregelmæssig defekt, med formen genvinding fremme udbygning af stilladset til defekten grænse. Efter afkøling (T <T trans), ville stilladset vende tilbage til sin relativt mere stiv tilstand med hensyn til form uforanderlighed bevare sin nye midlertidige form i defekten. I denne protokol, er en SMP stillads fremstillet af polycaprolacton (PCL), en biologisk nedbrydelig polymer studeret grundigt i vævsregeneration og andre biomedicinske anvendelser 9-11. For formhukommelse, the Tm af PCL fungerer som T trans og varierer mellem 43 og 60 ° C, afhængigt af molekylvægten af PCL 12. I denne protokol, T trans (dvs. T m) af stilladset er 56,6 ± 0,3 ºC 6.

For at opnå osteokonduktivitet blev en protokol udviklet til at PCL-baserede scaffolds SMP med tæt forbundne porer baseret på et opløsningsmiddel-casting partikelformet-udvaskning (SCPL) metode 6,13,14. Polycaprolacton diacrylat (PCL-DA) (M n = ~ 10.000 g / mol) blev anvendt til at tillade hurtig, fotokemisk tværbinding og blev opløst i dichlormethan (DCM) for at tillade opløsningsmiddel-støbning over salt skabelon. Efter fotokemisk hærdning og fordampning af opløsningsmidlet blev saltet skabelon fjernes ved udvaskning i vand. Den gennemsnitlige størrelse salt regulerer stillads porestørrelse. Vigtigt er det, blev saltet skabelon fusioneret med vand før opløsningsmiddel-casting for at opnå pore interconnectivity.

Bioaktivitet blev bibragt SMP stilladset ved in situ dannelse af en belægning på polydopamine porevæggene 6. Bioaktivitet ofte indføres i stilladser ved inklusion af glas eller glaskeramiske fyldstoffer 15. Imidlertid kan disse give anledning til uønskede sprøde mekaniske egenskaber. Dopamin er blevet vist at danne en klæbende, tyndt polydopamine lag på en række substrater 16-19. I denne protokol, blev SMP stillads udsættes for en svagt basisk opløsning (pH = 8,5) af dopamin til at danne en nanothick belægning af polydopamine på alle pore vægflader 6. Ud over at øge overfladehydrofilicitet for forbedret celleadhæsion og spredning, er polydopamine vist sig at være bioaktiv med hensyn til dannelsen af hydroxyapatit (HAP) ved udsættelse for simuleret kropsvæske (SBF) 18,20,21. I et sidste trin, er det overtrukne stillads udsættes for varmebehandling ved 85 ° C (T> T trans) WHich fører til stillads fortætning. Varmebehandling blev tidligere bemærket at være afgørende for stillads formhukommelse adfærd, måske på grund af PCL krystallinske domæner omorganisere til tættere 14.

Vi har desuden beskrive de metoder til at karakterisere selv-montering adfærd inden en uregelmæssig model defekt, forme hukommelse adfærd i form stamme-kontrollerede cyklisk-termiske mekanisk kompression test (dvs. form opsving og forme fasthed), pore morfologi, og in vitro bioaktivitet. Strategier at skræddersy stillads egenskaber præsenteres også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sammenfatning PCL-DA makromer

  1. Kør acrylering reaktion.
    1. 20 g PCL-diol (M n = ~ 10.000 g / mol) afvejes i en 250 ml rundbundet kolbe udstyret med en Teflon-dækket magnetisk omrører.
    2. Opløs PCL-diol i DCM.
      1. Tilføj 120 mLlof DCM til kolben (koncentration = 0,17 g / ml).
      2. Placer en gummimembran løst i kolbens hals, så man undgår trykopbygning samtidig forhindrer fordampning af DCM.
      3. Stir løsning for ~ 30 min ved ~ 250 rpm for at opløse polymeren.
    3. Tilføj ~ 6,6 mg 4-dimethylaminopyridin (DMAP) til opløsningen og opløs under omrøring.
    4. Placer en gummimembran fast i halsen på kolben. Lad opløsningen fortsat omrøring.
    5. Gennem gummimembranen, forsigtigt rense kolben med N2 i ~ 3 min ved anvendelse af en N2-overtryk nål indløb og en åben nålsom en stikkontakt.
    6. Fjern N2-indløb og udløb.
    7. Tilføj 0,56 ml (4,0 mmol) triethylamin (Et3N) dråbevis via en sprøjte glas udstyret med en nål indsættes gennem gummimembranen.
    8. Tilføj 0,65 ml (8,0 mmol) dråbevis acryloylchlorid via en glassprøjte forsynet med en nål indsættes gennem gummimembranen.
    9. Returnere N2-indløb til kolben og tillader, at indholdet omrørt under N2-overtryk for ~ 30 min.
    10. Forvarmet et oliebad til 55 ° C.
    11. Efter den tildelte ~ 30 min, fjerne N2-indløb og erstatte skillevæggen med en kondensator.
    12. Sænk kolben i den forvarmede oliebad.
    13. Tillader, at indholdet af kolben at omrøre i 20 timer.
    14. Efter den tildelte 20 timer, fjernes kolben fra oliebadet og tillade indholdet at afkøle til stuetemperatur.
    15. Anvendelse af en rotationsfordamper, fjerne DCM opløsningsmiddel fra kolben.
  2. Purify det rå PCL-DA produkt.
    1. Til kolben tilsættes ~ 135 ml ethylacetat og opløses det rå PCL-DA.
    2. Gravity filtrere opløsningen gennem filtrerpapir over i en ren 250 ml rundbundet kolbe. (Bemærk: Opløsning kan fortykkes på filtrerpapiret, ikke let passerer gennem bekræftende fald nøje anvendelse mild varme med varmekanon.).
    3. Anvendelse af en rotationsfordamper, fjern Ethylacetatopløsningsmidlet fra kolben.
    4. Til kolben tilsættes ~ 140 ml DCM og opløse det rå PCL-DA.
    5. Overfør indholdet til en 500 ml skilletragt.
    6. Til tragten tilsættes 13,5 ml 2 M kaliumcarbonat (K 2 CO 3).
    7. Cap tragten. Bland forsigtigt de to lag ved at vende tragten og hvirvlende forsigtigt en gang eller to gange, idet man frigive trykket via stophane. Gentag 3 gange.
    8. Sæt hætten med et lag parafilm og lad blandingen separere O / N (~ 12 timer).
    9. Saml bunden, ellerganiske lag i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe.
    10. Tilføj ~ 5 g vandfrit magnesiumsulfat (MgSO4) til kolben, og omrystes forsigtigt.
    11. Gravity filtrere blandingen gennem groft filtrerpapir og ind i en ren 250 ml rundbundet kolbe.
    12. Anvendelse af en rotationsfordamper, fjerne DCM opløsningsmiddel fra kolben.
    13. Tør under højvakuum til fjernelse af resterende DCM. (Bemærk: PCL-DA bør opbevares væk fra lys.)
    14. Bekræft acrylering med 1H NMR 22,23.

2. Forberedelse af SMP Stillads (figur 1)

  1. Forbered smeltet salt skabelon.
    1. Brug en 425 um sigte til opnåelse af natriumchlorid (NaCl) partikler ~ 460 ± 70 um i diameter. (Bemærk: Gennemsnitlig partikelstørrelse kan bekræftes fra scanningselektronmikroskopi [SEM] billeder med ImageJ software.) 14
    2. Til en 3 ml hætteglas (ID = 12,9 mm), der tilsættes 1,8 g af den tidligere sigtet NaCI.
    3. Tilsæt langsomt, i fire portioner, 7,5 vægt-% (baseret på salt vægt) DI vand (0,146 g) til hætteglasset. Bland med en metalspatel efter tilsætningen af ​​hver portion vand.
    4. Luk hætteglasset, wrap i væv og placere lodret i et centrifugerør. Centrifuge i 15 min ved 3220 x g.
    5. Fjern hætten og lad lufttørre O / N (~ 12 timer).
  2. I et nyt hætteglas, udarbejde en "makromeropløsning" ved at kombinere 0,15 g PCL-DA per ml DCM. (Bemærk:. For én stillads, ~ 1 ml opløsning skal forberedes) Cap og blande opløsningen ved høj hastighed på en vortex mixer til ~ 1 min.
  3. I en ny 3 ml hætteglas, udarbejde en "fotoinitiator løsning" baseret på 10 vægt-% 2,2-dimethoxy-2-phenyl-acetophenon (DMP) i 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP). Kombiner 0,115 g DMP i 1 ml NVP. (Bemærk: For en stillads, ~ kræves 180 pi.) Cap, wrap i aluminiumsfolie (for at blokere lys) og blande opløsningen ved høj hastighed på en vortex mixerfor ~ 1 min. (Bemærk: Hvis udarbejdet i avanceret, skal opløsningen i køleskab og beskyttet mod lys.)
  4. Wrap hætteglasset med makromeropløsningen (eksklusive cap) med aluminiumsfolie (for at blokere lys) og tilsæt via pipette 15 vol% (baseret på den totale volumen af ​​makromeropløsningen) af fotoinitiatoren opløsning. Cap og bland opløsningen ved høj hastighed på en vortex-blander i ~ 1 min.
  5. Wrap hætteglasset indeholdende smeltet salt skabelonen (eksklusive cap) med aluminiumsfolie (for at blokere lys) og tilsæt via pipette den tidligere fremstillede makromer / fotoinitiator opløsning (~ 0,6 ml eller indtil skabelonen er helt dækket).
  6. Luk hætteglasset, wrap i væv og placere lodret i et centrifugerør. Centrifuger i 10 minutter ved 1.260 xg til at distribuere makromeropløsningen hele skabelonen.
  7. Fjern aluminiumsfolie, Tag hætten af ​​hætteglasset og udsættes for UV-lys (365 nm, 25 W) i 3 minutter. Air-tør O / N.
  8. Fjern "saltholdig scaffold "fra hætteglasset med en pincet efter scoring og brud på toppen af ​​hætteglasset.
  9. I et 400 ml bægerglas, forberede ~ 200 ml af en vand / ethanol opløsningsmiddel (1: 1 vol: vol).
  10. Opretholde stilladset nedsænket i vand / ethanol opløsningsmiddel i 4 dage med daglige ændringer opløsningsmidler.
  11. Fjern stilladset fra opløsningsmidlet og lufttørre O / N.

3. Anvendelse Polydopamine Coating til SMP Scaffold (figur 1)

  1. I 400 ml bægerglas udstyret med en Teflon-dækket omrører, forberede ~ 200 ml af en dopamin-hydrochlorid-opløsning (2 mg / ml i 10 mM Tris-buffer, pH = 8,5, 25 ° C). Der omrøres ved ~ 150 rpm.
  2. Placer en engangskanyle (længde = 40 mm; gauge = 20) i stilladset, ~ halvdelen af ​​afstanden gennem stilladset. Wrap en ledning omkring nålen hub.
  3. Nedsænk stilladset (med nålkappen ovenfor opløsningen overflade) til den omrørte opløsning dopamin ved at forankre tråden til randen af ​​bægerglasset.
  4. Afgasses stilladset ved at placere en sprøjte i nålenavet og bruge det til at trække luft ud af stilladset. (Bemærk: Afgasning er færdig, når der ikke mere luft kan fjernes, og opløsningen er fuldstændig infiltreret stilladset.)
  5. Opretholde stilladset nedsænket i omrøring dopamin opløsning i 16 timer.
  6. Fjern stilladset fra opløsningen og fjern nålen. Skyl med deioniseret vand og tørres i en vakuumovn ved stuetemperatur i 24 timer.
  7. Placer stilladset i en 85 ºC ovn i 1 time.
  8. Tillad stilladset at afkøle til stuetemperatur. Den endelige cylindriske stillads vil være ~ diameter på 6 mm x ~ 5 mm højde.

4. Evaluering "Self-montering" Behavior

  1. Udarbejde en "irregulær CMF defekt model" ved hjælp af et stykke stift plast, hvis tykkelse er ~ 5 mm. Brug en boremaskine til at skabe et tomrum i plastfolie med en gennemsnitlig diameter lidt mindre end ~ 6 mm, som vist i figur 2A.
  2. I abEaker, varme DI vand (svarende til den kliniske anvendelse af saltvand) til en temperatur på ~ 60 ° C.
  3. Placer stilladset i bægeret på ~ 60 ° C vand. Brug en pincet til at skubbe stilladset under vandoverfladen, udsætter alle områder til vandet. Fortsæt til ~ 2 min, eller indtil stilladset er mærkbart blødgjort (figur 2B).
  4. Fjern stillads fra bægeret, og straks trykke (med hånden) i modellen defekten.
  5. Afkøles til stuetemperatur (~ 5-10 min) (figur 2C).
  6. Fjern fra defekten til at observere den nye, faste midlertidige form og afkastet af den relativt mere stiv tilstand (figur 2D).

5. Test formhukommelse Opførsel

  1. Ved hjælp af en dynamisk mekanisk analysator (DMA, fx en TA Instruments Q800 som anvendt heri), køre en stamme-styret cyklisk termisk mekanisk kompression test på et stillads i to cyklusser (N) for at bestemme formen uforanderlighed (Rf) ogformgenvinding (Rr) (figur 3).
    1. Ækvilibrere til 60 ° C (T høj) i 5 minutter.
    2. Komprimere til en maksimal belastning m = 50%) ved 50% / min.
    3. Hold på ε m (5 min).
    4. Der afkøles til 25 ° C (T lav) og opretholde i 10 minutter for at løse midlertidige form.
    5. Fjern belastningen.
    6. Mål brudtøjningen i stress-fri tilstand u).
    7. Genopvarmning til 60 ° C (T høj) og vedligeholde i 10 min for at genvinde den permanente form.
    8. Mål det udvundne stamme p).
    9. Mens stadig ved 60 ° C (T høj), starte 2. cyklus (N = 2) ved at komprimere stilladset til 50% af højden udvundet efter den 1. cyklus (N = 1).
    10. Gentag 5.1.3-5.1.8 For N = 2.
    11. Beregn Rf og R r for N = 1 og 2 under anvendelse af følgende ligninger:
      Rf (N) = u (N) / ε m] Rr (N) = m - ε p (N)] / m - ε p (N -1)]

6. Visualisering porestørrelsen og Pore Sammenkobling

  1. Brug af scanning elektronmikroskopi (SEM, f.eks FEI Quanta SEM som anvendt heri), observere porestørrelsen og pore sammenkobling.
    1. Brug en pincet til at holde SMP stillads, nedsænkes i flydende N2 i 1 min.
    2. Fjern fra flydende N2 og brud langs midten af stilladset med en ren barberblad.
    3. Ved hjælp af kulstof tape, anbringe en af ​​SMP stillads halvdele på prøvenscenen med den brækkede opad.
    4. Sprutte frakke med Au-Pt (~ 4 nm).
    5. Fang SEM billedet ved en anbefalet accelererende spænding på 10-15 kV (figur 4A).

7. Test af in vitro-Bioaktivitet

  1. I et 50 ml centrifugerør, tilsættes ~ 30 ml 1X SBF 24.
  2. Anskaf et stillads i sin oprindelige, cylindrisk-formet permanent form. Skær stilladset i halvdelen (på tværs af cirkulære kant) under anvendelse af en ren kniv.
  3. Placer en individuel stillads halvdelen i den forberedte centrifugerør og hætte.
  4. Opretholde røret ved 37 ° C i et vandbad under statiske betingelser uden SBF ændringer.
  5. Efter 14 dage, skal du fjerne stilladset fra SBF og lufttørre i 24 timer.
  6. Ved hjælp af kulstof tape anbringe stilladset ind på prøven scenen med den brækkede opad.
  7. Sprutte frakke med Au-Pt (~ 4 nm).
  8. Fang SEM billedet ved en reroses accelerationsspænding på 10-15 kV (figur 4B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den resulterende PCL-baserede SMP stillads er i stand til selv-montering i en model CMF defekt (figur 2). Efter kortvarig at varme saltvand (~ 60 ° C), den cylindriske stillads blødgør tillader stilladset manuelt presses ind og ekspandere inden for modellen defekten. Efter afkøling til stuetemperatur, er stilladset fast i sit nye midlertidige form, som tilbageholdes efter fjernelse fra defekten.

Formhukommelse adfærd fra en SMP stillads kvantificeres ved strain-kontrollerede cykliske-termisk mekanisk kompression tests med hensyn til form uforanderlighed (Rf) og nyttiggørelse form (Rr) (figur 3). For PCL-baserede SMP stillads, værdier (%) for cykler n = 1 og 2 er: Rf (1) = 102,5 0,7, Rf (2) = 101,8 0,3, Rr (1) 95,3 0,9, og R r (2) = 99,8 0,2 6.

SMP stillads viser en meget sammenhængende pore morfologi som observeretved SEM imaging (figur 4A). Dette blev opnået ved anvendelse af en kondenseret salt skabelon, der dannes ved tilsætning af en lille mængde vand til den sigtede salt (figur 1).

Efter udsættelse for simuleret kropsvæske (SBF, 1X) i 14 dage, SEM imaging bekræfter dannelsen af HAp (figur 4B) og derved indikerer stillads bioaktivitet.

Figur 1
Figur 1. Skematisk til forberedelse af SMP stillads belagt med polydopamine. ASMP stillads er fremstillet via det beskrevne protokol baseret på fotokemisk helbredelse af polycaprolacton diacrylat (PCL-DA) ved hjælp af et opløsningsmiddel-casting partikulært-udvaskning (SCPL) metode Anvender smeltet salt skabelon og anvendelsen af ​​et bioaktivt polydopamine belægning. Den afsluttende varmebehandling ved 85 ° C (T> T trans) inducerer stillads denklassifikation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Observation af selv-montering adfærd. En cylindrisk SMP stillads (~ mm diameter x ~ 5 mm højde 6) er monteret i en "irregulær defektmodel" (A) som følger. Ved opvarmning i vand ved ~ 60 ° C (T> T trans), stilladset blødgøres og bliver plastisk (B), og dermed kan presses mekanisk ("monteret") i defekten model (C). Efter afkøling til RT SMP stilladset fjernet, og bevarer sin nye, faste midlertidige form (D). Ved efterfølgende opvarmning ved ~ 60 ° C, stilladset gennemgår formgenvinding til den oprindelige, generiske cylindrisk form.

Figur 3
Figur 3. Måling af formhukommelse adfærd. Formhukommelse opførsel af en SMP stillads kvantificeres gennem en stamme-styret cyklisk termisk mekanisk kompression test på et stillads til at bestemme formen uforanderlighed (Rf) og nyttiggørelse form (Rr) baseret på målinger af ε m, ε u, og ε s. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Observation af pore sammenkobling og dannelsen af hydroxyapatit (HAP). repræsentant SEM billeder af en belagt, varmebehandlet SMP stillads (Målestokken = 200 um) (A) og overtrukket, varmebehandlet stillads efter udsættelse for SBF (1X) i 14 dage (Målestokken = 50 um) (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver fremstilling af en polydopamine-coated, PCL-baserede stillads, hvis selv-montering adfærd, samt osteoinductivity og bioaktivitet, gør det af interesse i behandlingen af ​​uregelmæssige CMF knogledefekter. Aspekter af protokollen kan ændres for at ændre forskellige stillads funktioner.

Protokollen begynder med acrylering af en PCL-diol at tillade UV hærdning. I den rapporterede eksempel PCL-diol Mn er ~ 10.000 g / mol. Men ved passende justering af mængden af acryloylchlorid og Et3N anvendes under syntesen af PCL-DA, en PCL diol med en højere eller lavere Mn kan anvendes til at mindske eller øge henholdsvis tværbindingsdensiteten.

Den fusionerede salt skabelon er en vigtig komponent til protokollen (figur 1). Den gennemsnitlige salt størrelse bestemmer den resulterende stillads porestørrelse. I det beskrevne eksempel, var den gennemsnitlige salt størrelse ~ 460 ± 70 &# 181; m. Mens en mindre salt størrelse kan anvendes, bør det holdes for øje, at stilladset undergår krympning under trin afsluttende varmebehandling, som vil reducere porestørrelse. Sigtning af saltet anvendes til at formindske salt størrelsesfordeling og derfor porestørrelsesfordelingen. For at producere et stillads med tæt forbundne porer, blev salt fusion induceret ved tilsætning af en lille mængde vand (7,5 vægt-% baseret på salt vægt). Dette er kendt for delvist at opløse isolerede NaCl partikler i en kontinuerlig poragen skabelon 25,26. Afhængigt af den gennemsnitlige salt størrelse, skal mængden tilsat vand justeres 14. Desuden blev der i salt fusion, skal vandet tilsættes gradvist, mekanisk blandet og til sidst centrifugeret for at sikre en jævn fordeling samt pakningen af ​​saltpartikler.

Efter at have dannede smeltet salt skabelonen, er PCL-DA opløst i DCM i opløsningsmiddel-støbning. I den beskrevne protokol, en concentration på 0,15 g PCL-DA per 1 ml DCM blev anvendt. Denne koncentration kan øges eller mindskes. Men mens stigende koncentrationer forventes at stige stillads modul, det kan også producere stilladser med lavere pore sammenkobling 14.

Når forstadiet opløsningen er blevet tilføjet på salt formen, centrifugering er nyttigt at aide i sin diffusion ind i skabelonen. Efter hurtig UV hærdning, lufttørring tillader afdampning af DCM opløsningsmiddel. Efter fjernelse fra formen, er stilladset gennemvædet i vand / ethanol (1: 1 vol: vol) i 4 dage for at fjerne saltet skabelon. SEM imaging bekræfter dannelsen af en stærkt forbundet pore morfologi (figur 4A).

En polydopamine påføres på porevæggene af stilladset for at bibringe bioaktivitet. På grund af den resulterende stillads krympning, er det bedst at anvende belægningen før behandling trin sidste heat 6. Derudover afgasningstilladset nedsænket i den vandige opløsning dopamin hjælper infiltration. Den afgassede stillads forbliver nedsænket i opløsningen for at lette ensartet polydopamine dækning. Når coatede og skylles grundigt, den tidligere hvide stillads udviser en brun farve karakteristisk for polydopamine 21. Således kan dækning i hele stilladset vurderes ved visuel inspektion ved at halvere et stillads for at bekræfte polydopamine diffusion.

Efter påføring af polydopamine belægning, er en afsluttende varmebehandling udføres (85 ºC, 1 time). Som bemærket, denne proces resulterer i stilladset krympning. Men varmebehandling er afgørende for at opnå form hukommelse adfærd 14, måske på grund af reorganisering af PCL krystallinske domæner (dvs. skifte segmenter) i tættere.

Som vist i figur 2, SMP stillads opnået selvstændig montering i en model defekt på grund af sin termoresponsiv forme migMory natur. Udsættelse for varme saltvand (~ 60 ° C) induceret smeltning af PCL krystallinske domæner, således at det blødgjorte stilladset kunne presses ind i modellen defekten. Når manuelt tryk blev frigivet, formen nyttiggørelse fremmes udvidelse af stilladset for at fylde de uregelmæssige grænser. Efter afkøling til stuetemperatur PCL krystallinske domæner reformeret, fastsættelse stilladset i sin nye midlertidige form, der blev tilbageholdt efter fjernelse fra defekten. Vi har tidligere bekræftet, at porerne langs kanterne af stilladset fjernet forblev helt åbne trods kontakt med formen 6.

Målt ved strain-kontrollerede cyklisk-termiske mekaniske kompression tests (figur 3), ideelt formhukommelse adfærd er kendetegnet ved Rf og R r-værdier på 100%. For den beskrevne SMP stillads, Rf-værdier til cykler 1 og 2 var lidt> 100% 6. Rf er tidligere blevet observeret at være lidt greater end 100% 14,27 på grund af en mindre stigning i trykpåvirkning under formen fiksering fra omkrystallisation af PCL segmenter i mere kompakte strukturer 27 eller kompressionstænding induceret omkrystallisation af PCL. Desuden R R steget fra cyklus 1 til cyklus 2 6. En stigning i R r værdier har tidligere været kendt for solidt 28,29,22 og porøst SMP'er 13,14,23. Det menes, at i løbet af den første cyklus, er resterende belastning stammer fra forarbejdning fjernet således, at formen recovery stigninger i den næste cyklus 7.

Den beskrevne vævsopbygning stillads opnår den specifikke sæt egenskaber kritiske for en vellykket behandling af CMF knogledefekter. Forventes stilladset for at lette osseointegration gennem dens evne til at "self-fit" i en uregelmæssig CMF knogledefekt. Osteokonduktivitet forudsiges baseret på den opnåede pore sammenkobling samtstillads bionedbrydelighed. Endelig, på grund af polydopamine belægning, stilladset er bioaktive som indikeret ved dannelse af HA under in vitro-tests (figur 4B). Denne bioaktivitet forventes at lette integrationen og limning med omgivende knoglevæv. Således er denne stillads repræsenterer et alternativ til selvpodning og konventionelle knogle substitutter for CMF knogledefekt reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Forfatterne takker Texas A & M University Engineering og Experiment Station (TEES) om økonomisk støtte af denne forskning. Lindsay Nail taknemmeligt anerkender støtte fra Texas A & M University Louis Stokes Alliance for Minority Deltagelse (LSAMP) og National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP). Dawei Zhang takker Texas A & M University afhandling fællesskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) Sigma-Aldrich 440752
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich D65100 Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma-Aldrich D5640
Triethylamine (Et3N) Sigma-Aldrich T0886
Acryloyl chloride Sigma-Aldrich A24109
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
Potassium carbonate (K2CO3) Sigma-Aldrich 209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) Fisher M65
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) Sigma-Aldrich 196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409
Ethanol Sigma-Aldrich 459844
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502
Tris buffer (2mol/L) Fisher BP1759 Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve VWR 47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) UVP 95-0426-02
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
High Resolution Sputter Coater Cressington 208HR
Scanning Electron Microscope (SEM) FEI Quanta 600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neovius, E., Engstrand, T. Craniofacial reconstruction with bone and biomaterials: review over the last 11 years. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63, 1615-1623 (2010).
  2. Elsalanty, M. E., Genecov, D. G. Bone grafts in craniofacial surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2, 125-134 (2009).
  3. Hollister, S. J., et al. Engineering craniofacial scaffolds. Orthod Craniofacial Res. 8, 162-173 (2005).
  4. Albrektsson, T., Johansson, C. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. 10, S96-S101 (2001).
  5. Blokhuis, T. J., Arts, J. J. C. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths. Injury. 42, S26-S29 (1016).
  6. Zhang, D., et al. A bioactive “self-fitting” shape memory polymer scaffold with potential to treat cranio-maxillo facial bone defects. Acta Biomater. 10, 4597-4605 (2014).
  7. Lendlein, A., Kelch, S. Shape-memory polymers. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2034-2057 (2002).
  8. Hu, J., Zhu, Y., Huang, H., Lu, J. Recent advances in shape-memory polymers: Structure, mechanism, functionality, modeling and applications. Prog Polym Sci. 37, 1720-1763 (2012).
  9. Middleton, J. C., Tipton, A. J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. Biomaterials. 21, 2335-2346 (2000).
  10. Sun, H., Mei, L., Song, C., Cui, X., Wang, P. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implant. Biomaterials. 27, 1735-1740 (2006).
  11. Woodruff, M. A., Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer-Polycaprolactone in the 21st century. Prog Polym Sci. 35, 1217-1256 (2010).
  12. Wang, S., Lu, L., Gruetzmacher, J. A., Currier, B. L., Yaszemski, M. J. Synthesis and characterizations of biodegradable and crosslinkable poly(ε-caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and their amphiphilic copolymer. Biomaterials. 27, 832-841 (2006).
  13. Zhang, D., Petersen, K. M., Grunlan, M. A. Inorganic-organic shape memory polymer (SMP) foams with highly tunable properties. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 186-191 (2012).
  14. Zhang, D., Burkes, W. L., Schoener, C. A., Grunlan, M. A. Porous inorganic-organic shape memory polymers. Polymer. 53, 2935-2941 (2012).
  15. Van der Stok, J., Van Lieshout, E. M., El-Massoudi, Y., Van Kralingen, G. H., Patka, P. Bone substitutes in the Netherlands-a systematic literature review. Acta Biomater. 7, 739-750 (2011).
  16. Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
  17. Hong, S., et al. Non-covalent self-assembly and covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation. Adv Funct Mater. 22, 4711-4717 (2012).
  18. Ryu, J., Ku, S. H., Lee, H., Park, C. B. Mussel-inspired polydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization. Adv Funct Mater. 20, 2132-2139 (2010).
  19. Lee, Y. B., et al. Polydopamine-mediated immobilization of multiple bioactive molecules for the development of functional vascular graft materials. Biomaterials. 33, 8343-8352 (2012).
  20. Wu, C., Fan, W., Chang, J., Xiao, Y. Mussel-inspired porous SiO 2 scaffolds with improved mineralization and cytocompatibility for drug delivery and bone tissue engineering. J Mater Chem. 21, 18300-18307 (2011).
  21. Ku, S. H., Ryu, J., Hong, S. K., Lee, H., Park, C. B. General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials. 31, 2535-2541 (2010).
  22. Schoener, C. A., Weyand, C. B., Murthy, R., Grunlan, M. A. Shape memory polymers with silicon-containing segments. J Mater Chem. 20, 1787-1793 (2010).
  23. Zhang, D., Giese, M. L., Prukop, S. L., Grunlan, M. A. Poly(ε-caprolactone)-based shape memory polymers with variable polydimethylsiloxane soft segment lengths. J Polym Sci Pol Chem. 49, 754-761 (2011).
  24. Kokubo, T., Takadama, H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity. Biomaterials. 27, 2907-2915 (2006).
  25. Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
  26. Yang, Q., Chen, L., Shen, X., Tan, Z. Preparation of polycaprolactone tissue engineering scaffolds by improved solvent casting/particulate leaching method. J Macromol Sci Phys. 45, 1171-1181 (2006).
  27. Madbouly, S. A., Kratz, K., Klein, F., Lüzow, K., Lendlein, A. Thermomechanical behaviour of biodegradable shape-memory polymer foams. 2009 MRS Spring Meeting, 1190, Mater Res Soc Symp Proc. (2009).
  28. Luo, X., Mather, P. T. Preparation and characterization of shape memory elastomeric composites. Macromolecules. 42, 7251-7253 (2009).
  29. Lendlein, A., Schmidt, A. M., Langer, R. AB-polymer networks based on oligo(ɛ-caprolactone) segments showing shape-memory properties. Proc Natl Acad Sci. 98, 842-847 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats