नवजात चूहे से पृथक Brainstem-रीढ़ की हड्डी की तैयारियों पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तंत्रिका श्वसन नेटवर्क उत्पादन रिकॉर्डिंग की अनुमति देता

Neuroscience

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Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

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Abstract

Introduction

श्वास dioxygen (ओ 2) तेज और कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) उन्मूलन की अनुमति के मस्तिष्क द्वारा नियंत्रित एक जटिल और महत्वपूर्ण गतिविधि है। केंद्रीय श्वसन ड्राइव दोनों स्तनधारियों 1 में मस्तिष्क में स्थित एक जटिल नेटवर्क, उभयचर 2, सरीसृप 3, पक्षियों 4 और मछलियों 5 से उत्पन्न होता है। सांस लेने के अध्ययन विवो में कार्रवाई की जा सकती है, भले ही सटीक यंत्रवत जांच श्वसन नियंत्रण नेटवर्क के लिए सीधी पहुँच की आवश्यकता है। यह अंत करने के लिए, एड्रियन और Buytendijk मस्तिष्क की सतह के रिकॉर्ड पर गिल वेंटिलेशन 5 के साथ जुड़े उत्पन्न लय रखा इलेक्ट्रोड, जिसमें एक कम सुनहरी मछली तैयारी, विकसित की है। यह दृष्टिकोण बाद में नवजात कृन्तकों में उपयोग के लिए 1984 6 में Suzue द्वारा रूपांतरित किया गया। इस तैयारी के आगमन के श्वसन तंत्रिका जीव विज्ञान में उल्लेखनीय प्रगति हुई है। यह अपेक्षाकृत सरल है, तकनीक ज प्रस्तुतअरे लयबद्ध मोटर व्यवहार और नवजात कृंतकों में अपने मूल की बुनियादी जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी है।

इस विधि के समग्र लक्ष्य श्वसन गतिविधि के तंत्रिका सहसंबंधी रिकॉर्ड करने के लिए है, एक सांस की तरह लय श्वसन नेटवर्क द्वारा उत्पादित कल्पित श्वास, कहा जाता है। इस विधि दोनों जंगली प्रकार 7 और ट्रांसजेनिक 8 पशुओं में श्वसन बदलाव या औषध विज्ञान के लिए श्वसन प्रतिक्रियाओं को निशाना, अनुसंधान उद्देश्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया जा सकता है। दर्ज संकेत के शारीरिक प्रासंगिकता के बारे में प्रयोगों संवेदी afferents के बिना, एक कम तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं, और aCSF भीतर ग्लूकोज और ओ 2 की सांद्रता उच्च रहे हैं जहां परिस्थितियों में, सवाल उठाया गया है कि यह देखते हुए। Vivo में इन विट्रो की स्थिति में बीच स्पष्ट मतभेद हैं जबकि (जैसे।, श्वसन फटने की आवृत्ति) तथ्य की उपस्थिति बनी हुई है किश्वसन नेटवर्क 6 के मूल तत्वों यह संभव है एक महत्वपूर्ण homeostatic समारोह 9,10 के लिए जुड़े एक मजबूत लय अध्ययन करने के लिए बनाते हैं।

विकास और इस तकनीक के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि विशेष रूप से नवजात शिशुओं में, विवो में शायद ही पहुंच रहे हैं जो श्वसन नेटवर्क के मस्तिष्क तत्वों, के लिए सीधी पहुँच की सुविधा के लिए है। मस्तिष्क को कड़ाई से नियंत्रित परिस्थितियों में रखा गया है: दर्ज की लय फेफड़ों या मन्या निकायों से परिधीय अभिवाही आदानों द्वारा संग्राहक नहीं है, अध्ययन केंद्रीय श्वसन खुद ड्राइव 11 पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, इस का उपयोग उत्तेजनाओं लागू करते हैं और उत्पादन में संकेत रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किया जाता है। रिकॉर्डिंग plethysmography के विपरीत, सांस की लय पूरे शरीर में उसके घटकों में से सभी के द्वारा ठीक किया जाता है (उदाहरण के लिए।, फेफड़ों बढ़ाव, परिधीय चेमोसेंसोर्स), यह मुश्किल सटीक उत्तेजनाओं लागू करने के लिए कर रही है।

एक मेंewborn चूहे, प्रोटोकॉल कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) में बनाए रखा एक अलग मस्तिष्क पर चौथे उदर जड़ संकेत और एक छोटा रीढ़ की हड्डी, रिकॉर्डिंग के होते हैं। मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी द्वारा उत्पन्न लय श्वसन संकेत 9 से जुड़े होते हैं जो अलग-अलग धीमी फटने से बना है। 7 - पृथक मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी आसानी से 4 (पी 4 P0) को प्रसवोत्तर दिन 0 से चूहों में रिकॉर्ड करने जाते हैं। यह दृष्टिकोण सामान्यतः श्वसन नेटवर्क की कमी वाली प्रतिक्रिया है, और भी hypercapnia, एसिडोसिस या दवाओं के जवाब का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक तीव्र हाइपोक्सिया प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया है। इस उत्तेजना aCSF में ओ 2 की वापसी से प्राप्त किया जाता है; इस दृष्टिकोण आमतौर पर hypoxic अपमान करने के लिए सहिष्णुता और जवाबदेही का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया जोखिम के अंत (चित्रा 1) 12 तक पहले मिनट से एक लय अवसाद लाती है। इस अवसाद उलट हैपोस्ट-hypoxic वसूली 12 के दौरान। प्रयोगात्मक डिजाइन के संबंध में, यह मस्तिष्क के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग में स्थित पोंस, लय जनरेटर 8 पर निरोधात्मक कार्रवाई की है कि सूचना के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, पूर्ण brainstem और व्याख्यान चबूतरे रीढ़ की हड्डी की तैयारी के लिए एक कम लय प्रदर्शित करते हैं। रिकॉर्डिंग के लिए पृथक नमूने में पोंस का समावेश प्रयोग 13 के लक्ष्य के अनुसार निर्धारित किया जाता है; मज्जा नेटवर्क पर pontine प्रभाव के अध्ययन के परिणामों के 14 की तुलना करने के पोंस के साथ और बिना रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इस तकनीक के लाभ में से एक है, mesencephalic और / या diencephalic क्षेत्रों 15,16 शामिल करने के लिए तैयार करने के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा विस्तार देने के लिए यह संभव Ponto-मस्तिष्क का श्वसन नेटवर्क पर इन क्षेत्रों के प्रभाव का आकलन करने के लिए बनाने की संभावना है।

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Protocol

इस विधि Laval विश्वविद्यालय पशु आचार समिति (प्रोटोकॉल # 2012-170) द्वारा अनुमति पशु विषयों, के उपयोग की आवश्यकता है।

1. सेटअप और तैयारी

  1. समाधान
    1. निम्नलिखित व्यंजनों 7,17 के अनुसार aCSF स्टॉक समाधान तैयार करें। एकाग्रता बदलाव के साथ अन्य व्यंजनों साहित्य में उपलब्ध हैं। अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान।
      1. नमक समाधान: NaCl के 75.39 ग्राम (129 मिमी अंतिम) जोड़ने; KCl की 2.5 ग्राम (3.35 मिमी अंतिम); NaH2PO4 की 0.81 ग्राम (0.58 मिमी अंतिम); MgCl2 की 2.33 ग्राम (1.15 मिमी अंतिम); CaCl2 की 1.85 ग्राम (1.26 मिमी)। तो distillated पानी के साथ 1 एल को भरने आसुत पानी की 800 मिलीलीटर में भंग।
      2. बाइकार्बोनेट समाधान: 3 NaHCO (21 मिमी अंतिम) की 17.65 ग्राम जोड़ें। तो आसुत जल से 1 एल को भरने distillated पानी की 900 मिलीलीटर में भंग। बाइकार्बोनेट एकाग्रता के बदलाव पीएच रूपों में परिणाम होगा।
      3. ग्लूकोज समाधान: 54.06 जोड़नेग्लूकोज की जी (30 मिमी अंतिम)। तो आसुत जल के साथ 500 मिलीलीटर भरने distillated पानी की 400 मिलीलीटर में भंग।
    2. नमक के घोल के 100 मिलीलीटर, बाइकार्बोनेट समाधान के 100 मिलीलीटर, और आसुत जल का 1 एल में ग्लूकोज समाधान के 50 मिलीलीटर गिराए द्वारा aCSF तैयार करें। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. वार्मिंग और यह टूट जाता है जब तक एक ग्लास ट्यूब खींच द्वारा एक गिलास इलेक्ट्रोड तैयार करें। उपयोग करने से पहले टिप नीचे रेत। इलेक्ट्रोड के रूप में लंबे समय से यह साफ रहता रूप में कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  2. प्रयोगात्मक स्थापना
    नोट: सेट-अप विवरण चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं।
    1. Averager, डाटा अधिग्रहण प्रणाली, तापमान नियंत्रक और पंप चलती है, एम्पलीफायर पर मुड़ें। और कच्चे संकेत (2.5 किलो हर्ट्ज) के डिजिटल रूपांतरण के अनुरूप का नमूना दर, संकेत प्रवर्धन (= 10,000 लाभ), निस्पंदन (उच्च सीमा, 5 किलो हर्ट्ज सीमा से कम, 10 हर्ट्ज) की जाँच करें।
    2. ACSF और carbogen (95% ओ 2 के साथ बुलबुला इसके साथ एक बोतल भरें 2)। / मिनट 4 मिलीलीटर पर रिकार्डिंग कक्ष (मात्रा 5 मिलीलीटर) में एक bubbled- और गरम-aCSF प्रवाह प्रेरित। डिग्री सेल्सियस 26 पर रिकार्डिंग कक्ष में तापमान (± 1) पकड़ो। पीएच इन मानक स्थितियों में 7.4 होना चाहिए।
    3. विच्छेदन कक्ष के पास एक 50 मिलीलीटर सिरिंज में आर टी और carbogen-bubbled ACSF की 50 मिलीलीटर रखें।
    4. कंप्यूटर पर मुड़ें और रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।

2. विच्छेदन

  1. वजन और नेत्रहीन पशु के लिंग का निर्धारण (महिलाओं के लिए एक छोटी Ano-जननांग दूरी है, जबकि पुरुषों, एक लंबे समय तक Ano-जननांग दूरी है, महिला जननांगों गुलाबी हैं, जबकि गुप्तांग अक्सर गहरे हैं पुरुषों)।
  2. निम्न विकल्पों में से एक ने नवजात कृन्तकों anesthetize: cryoanesthesia (पूरी तरह से 4 के लिए बर्फ में पशु विसर्जित - 5 मिनट 18) (4 मिलीग्राम / किलो पर equitensine), इंजेक्शन अस्थिर निश्चेतक (isoflurane 20 या ईथर 21) की 19 या साँस लेना। आत्मविश्वासआरएम एक पंजा वापसी पलटा के अभाव से संज्ञाहरण की पर्याप्त विमान।
  3. नीचे बेंच पर पशु, उदर चेहरे रखें। धारा (त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से दिखाई) शीर्षस्थान स्तर पर एक छुरी के साथ coronally सिर के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा। पशु anesthetized के तुरंत बाद इस कदम को पूरा करें।
  4. धारा शरीर coronally पूर्वकाल सदस्यों के तहत एक छुरी के साथ।
  5. शल्य चिकित्सा और पतली कैंची और सरौता के साथ त्वचा, मांसपेशियों, वसा ऊतकों और viscus निकालें। हड्डियों को इस उम्र में नरम हैं, तंत्रिका तंत्र को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहना। बेंच पर इस चरण को पूरा करें।
  6. विच्छेदन कक्ष में तैयारी रखें। तैयारी आक्सीजन के साथ सिरिंज में संग्रहीत aCSF का प्रयोग करें। रिकॉर्डिंग के अंत करने के लिए इस बिंदु से, एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  7. तैयारी के पृष्ठीय चेहरे पर, शल्य चिकित्सा और पतली कैंची और सरौता के साथ मध्यम अक्ष के साथ दुम हिस्सा करने के लिए व्याख्यान चबूतरे से खोपड़ी और vertebras काटा। कटौती खोपड़ी खोलेंऔर आदेश में vertebras तंत्रिका ऊतक को बेनकाब करने के लिए। तैयारी आक्सीजन के साथ सिरिंज में strored aCSF का प्रयोग करें।
  8. सरौता के साथ, मकड़ी झिल्ली, तंत्रिका ऊतक की सतह को कवर एक पतली ऊतक को हटा दें। तंत्रिका ऊतक के खिलाफ पिया मेटर और रक्त वाहिकाओं को बनाये रखें। तैयारी आक्सीजन के साथ सिरिंज में संग्रहीत aCSF का प्रयोग करें।
  9. पृष्ठीय के साथ तैयारी नीचे का सामना करना पड़ता है, और ध्यान से जगह में तैयारी धारण करते हुए कैंची से नसों और संयोजी ऊतक काटने से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को नीचे लाने रखें। एक पृष्ठीय दृष्टिकोण भी संभव है। जितनी लंबी जड़ों और नसों रखें। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग करने के लिए हड्डियों को निकाल दें। तैयारी आक्सीजन के साथ सिरिंज में संग्रहीत aCSF का प्रयोग करें।
  10. सेरिबैलम निकालें और छुरी के साथ उन्हें सेक्शनिंग द्वारा व्याख्यान चबूतरे संरचनाओं शेष। तैयारी आक्सीजन के साथ सुई में संग्रहीत aCSF का प्रयोग करें।
  11. वैकल्पिक रूप से experimen पर निर्भर करता हैताल डिजाइन, अवर अनुमस्तिष्क धमनी से 22 एक राज्याभिषेक अनुभाग पूर्वकाल से छुरी के साथ पोंस को हटा दें। पूरे पोंस रखने चूहों में लय को धीमा और पूरी तरह से चूहों में यह बाधित करेगा कि ध्यान दें। पोंस के ही दुम हिस्सा भी शामिल है कि तैयारियों में सी 4 रूट पर एक स्थिर आवृत्ति के साथ एक सांस की तरह गतिविधि प्रदर्शित करते हैं।

3. रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष, उदर चेहरे में तैयारी रखें। रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के व्याख्यान चबूतरे वाला सबसे अधिक भाग के निम्नतम भाग में पिन के साथ तैयारी को ठीक करें।
  2. आंशिक रूप से ACSF के साथ इलेक्ट्रोड भरने के क्रम में, सिरिंज पिस्टन बाहर खींच कर: - (225 माइक्रोन 150 कांच टिप व्यास) ने अपने सुई द्वारा इलेक्ट्रोड से जुड़ा हुआ एक सिरिंज का प्रयोग, इलेक्ट्रोड में एक अवसाद प्रेरित।
  3. एक micromanipulator का प्रयोग, ध्यान चौथे उदर जड़ों में से एक के करीब इलेक्ट्रोड जगह है। अन्य उदर जड़ों को भी एक सांस की तरह गतिविधि (ई भेंट कर सकते हैं।जी।, बारहवीं कपाल तंत्रिका, सी 1 उदर रूट)।
  4. धीरे तंत्रिका जड़ महाप्राण करने के लिए पिस्टन बाहर खींच कर सिरिंज के माध्यम से इलेक्ट्रोड टैंक में एक अवसाद प्रेरित। तो ध्यान से रीढ़ की हड्डी के खिलाफ इसे लागू करने के लिए इलेक्ट्रोड चलते हैं।
    नोट: आदर्श रूप में नीचे का भाग के आकार इलेक्ट्रोड खोलने के आकार से मेल खाता है और इस तरह इलेक्ट्रोड की आंतरिक और बाह्य डिब्बों के बीच एक मुहर बनाता है। अंतर एम्पलीफायरों आमतौर पर ऐसी रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड के अंदर और रिकॉर्डिंग कक्ष के बीच किसी भी खोलने संकेत की गुणवत्ता को कम कर देता है और यह मुश्किल पृष्ठभूमि शोर को खत्म करने के लिए बनाता है।
  5. रिकॉर्डिंग शुरू।
  6. Normoxic शर्तों के तहत तैयारी द्वारा उत्पादित लय रिकॉर्ड (यानी, aCSF carbogen साथ bubbled: 95% ओ 2 और 5% सीओ 2) में कम से कम 20 मिनट की तैयारी के आधारभूत मानकों का निर्धारण करने के लिए।
  7. करने के लिए carbogen-bubbled aCSF से छिड़काव स्विचप्रोत्साहन aCSF (यानी, 95% एन 2 और 5% हाइपोक्सिया प्रोत्साहन के लिए सीओ 2 के साथ bubbled) 15 मिनट के लिए। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर जोखिम अवधि में परिवर्तन। रिकॉर्डिंग और पशु datasheet पर जोखिम अवधि रिकॉर्ड। ACSF बोतल और ट्यूब से बाहर करने के लिए गैस प्रसार से बचने के लिए जब भी संभव कक्ष के बीच स्टेनलेस स्टील ट्यूब का प्रयोग करें।
  8. एक वसूली रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए मानक carbogen-bubbled aCSF वापस करने के लिए छिड़काव स्विच। रिकॉर्डिंग और पशु datasheet पर इस रिकॉर्ड।
  9. रिकॉर्डिंग खत्म होता है।

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एकीकृत संकेत से, (फटने / मिनट में व्यक्त) प्रति मिनट फटने की संख्या के रूप में आवृत्ति, आधारभूत और (एम वी में व्यक्त) फट के चोटी के बीच अंतर के रूप में आयाम से अवधि के रूप में फट अवधि की गणना (एस में व्यक्त) फट के अंत में शुरू, चालू तहत क्षेत्र के रूप में फट क्षेत्र(एम वी में व्यक्त · एस) एकीकृत संकेत (चित्रा 3) पर फट के ve।
  2. हर हालत के लिए रिकॉर्डिंग के अंतिम 5 मिनट के औसत के रूप आवृत्ति, आयाम, फट अवधि और फट क्षेत्र normoxic के तहत (आधारभूत), hypoxic (प्रोत्साहन) और बाद hypoxic (बाद प्रोत्साहन) वसूली की स्थिति की गणना। रिकार्डिंग कक्ष में छिड़काव और aCSF homogenization स्विचिंग के बीच एक देरी है, क्योंकि हर हालत के पहले भाग का विश्लेषण नहीं है।
  3. इसी रिकॉर्डिंग के लिए आधारभूत मूल्यों का एक प्रतिशत के रूप में तो प्रोत्साहन (यानी, हाइपोक्सिया) और बाद प्रोत्साहन (यानी, पोस्ट-hypoxic) वसूली मूल्यों व्यक्त करें। एसडी ± मतलब है के रूप में परिणाम एक्सप्रेस

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Representative Results

शुरूआत में उल्लेख किया है, इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण लाभ में से एक मस्तिष्क के लिए सीधी पहुँच विभिन्न उत्तेजनाओं लागू करने के लिए है। एक उदाहरण के रूप में, हाइपोक्सिया यहां लागू किया गया था। 1 चित्रा। एबी दोनों normoxic और hypoxic शर्तों के साथ, एक पूर्ण प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग को प्रदर्शित करता है। चित्रा 1.CE यानी normoxic शर्तों (में दर्ज की लय को प्रदर्शित करता है, aCSF 95% ओ 2 और 5% के साथ bubbled 26 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2)। पहले इस सटीक तैयारी 11 में प्रदर्शन के रूप में, आवृत्ति के बारे में 8 फटने / मिनट है, और आयाम के बारे में 0.800 एम वी है। आयाम की वजह से अपनी महत्वपूर्ण अंतर-तैयारी की विविधताओं केवल सांकेतिक है कि ध्यान दें। कम ट्रेस कच्चे संकेत का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ऊपरी ट्रेस एकीकृत संकेत प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 1.DF (hypoxic शर्तों में दर्ज अर्थात्।, aCSF 95% एन 2 और 5% सीओ के साथ bubbled लय को प्रदर्शित करता है <उप> 2) 26 डिग्री सेल्सियस पर। पहले से 23 की विशेषता के रूप में, आवृत्ति नाटकीय रूप से हाइपोक्सिया के दौरान कमी आई। चित्रा 1.GH normoxic और कमी वाली स्थिति में विशिष्ट पैटर्न दिखा एक भी फट प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
Brainstem-रीढ़ की हड्डी की तैयारी से प्राप्त रिकॉर्डिंग की चित्रा 1. उदाहरण हैं। Normoxic, hypoxic और बाद hypoxic वसूली की स्थिति ((ए) एकीकृत संकेत और (बी) के कच्चे संकेत) के तहत पी 4 चूहों से तैयारी के सी 4 उदर जड़ से दर्ज श्वसन उत्पादन । और एकल फट ((जी) normoxic फट हर हालत के लिए, बढ़े हुए रिकॉर्डिंग (; (डी) एकीकृत hypoxic संकेत; (ई) कच्चे normoxic संकेत (एफ) कच्चे hypoxic संकेत (सी) normoxic संकेत एकीकृत)और (ज) hypoxic फट) दिखाए जाते हैं। पाठ में उल्लेख किया है, कि आयाम ध्यान से व्याख्या की जानी है कृपया ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सेटअप चित्रा 2. Recapitulative स्कीमा। Bubbled aCSF गरम और रिकार्डिंग कक्ष में एक पंप द्वारा भेजा जाता है। रिकार्डिंग कक्ष में ACSF अतिरिक्त एक पंप से aspirated और का निपटारा किया जाता है। रिकॉर्डिंग कक्ष जमीन और तापमान नियंत्रक से जुड़ा हुआ है। इलेक्ट्रोड उत्पादन सीधे चलती averager और डाटा अधिग्रहण प्रणाली है, और अंत में कंप्यूटर के लिए तो, एम्पलीफायर को रिले किया जाता है। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
चित्रा 3. विश्लेषण फट पैरामीटर। आवृत्ति (फटने / मिनट में व्यक्त) प्रति मिनट फटने की संख्या, आधारभूत और (एम वी में व्यक्त) फट के चोटी के बीच अंतर के रूप में आयाम, फट अवधि के रूप में के रूप में गणना की है (एस में व्यक्त) फट के शुरू से अंत तक की अवधि, एकीकृत संकेत पर फट की वक्र के तहत क्षेत्र के रूप में फट क्षेत्र (एम वी में व्यक्त · एस)। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

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Discussion

सांस की गतिविधि की सही मात्रा का ठहराव चुनौतीपूर्ण हो सकता है। दरअसल, साँस लेने में स्वत: और स्वैच्छिक दोनों हो सकता है कि एक समारोह है, और कहा कि पर्यावरण, शरीर की जरूरत है, भावनात्मक स्थिति और व्यवहार के अनुसार ठीक किया जाता है। इस तकनीक का लाभ सांस की कमान उत्पादन के लिए जिम्मेदार तंत्रिका तत्वों का अलगाव है। इस प्रकार, मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारियाँ और plethysmography के electrophysiological रिकॉर्डिंग क्रमश: इन विट्रो और इन विवो में पूरे न्यूरोनल श्वसन नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए पूरक तकनीक हैं। मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी में पैच दबाना रिकॉर्डिंग (जैसे।, उदर की सतह से आ) भी बोधगम्य हैं और एक संरक्षित श्वसन नेटवर्क 24 में एक विशेष न्यूरॉन के अध्ययन अनुमति देते हैं।

इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से विच्छेदन में, कुछ महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है। तंत्रिका ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए,सभी विच्छेदन कदम तेजी से और ठीक निष्पादित किया जाना चाहिए। तंत्रिका ऊतक क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए और ध्यान से aCSF में निरंतर विसर्जन के द्वारा संरक्षित किया। जैसा कि पहले उल्लेख, तंत्रिका जड़ और इलेक्ट्रोड के बीच कनेक्शन की गुणवत्ता एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम है। नीचे का भाग की आकांक्षा तैयारी करने के लिए करीब इलेक्ट्रोड ला सकते हैं। इलेक्ट्रोड और मस्तिष्क के बीच संपर्क सील की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं, एक एक अवसाद बनाने या शारीरिक रूप से तैयार करने को क्षति से बचाने के लिए किया है।

एकीकृत संकेत हमेशा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन कच्चे संकेतों पृष्ठभूमि शोर से उचित फटने अंतर करने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, एक लाउडस्पीकर लय को सुनने और संकेत गुणवत्ता और ऑडिशन के द्वारा उपस्थित पृष्ठभूमि शोर निर्धारित करने के लिए सेटअप करने के लिए जोड़ा जा सकता है। दरअसल, पृष्ठभूमि आधारभूत में कुछ बदलाव की वजह से एक अस्थिर आधारभूत करने के लिए बिजली के हस्तक्षेप और कारण के लिए उपस्थित हो सकता है। इस तरह interferences इलेक्ट्रोड से केबल कनेक्शन और जड़ suctioning जाँच से रोका जाना चाहिए। फट आयाम दोनों पृष्ठभूमि शोर और जड़ और इलेक्ट्रोड के बीच संबंध पर निर्भर है, क्योंकि इसके अलावा, आवृत्ति एक विश्वसनीय पैरामीटर का ज्यादा है। इस प्रकार, फट आयाम हमेशा आधारभूत मूल्यों का प्रतिशत कारण सेटअप करने के लिए अंतर-व्यक्तिगत विविधताओं से बचने के लिए के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए।

तकनीक की सीमाओं तैयारी महसूस किया जा सकता है जिसमें से जानवर की उम्र से निर्धारित होते हैं। यह बहुत ही रोचक और चिकित्सकीय प्रासंगिक है जो जन्म के समय केंद्रीय श्वसन ड्राइव की स्थापना के लिए एक सटीक अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन यह इन शुरुआती उम्र पर केंद्रित है और बाद में उम्र के लिए बढ़ाया जा सकता है। बड़ी उम्र arterially भरकर रखा काम कर दिल-मस्तिष्क की तैयारी 25 में प्रयोग किया जाता है, लेकिन पर्याप्त प्रोटोकॉल संशोधनों के साथ (देखें नीचे) किया जा सकता है। वयस्क गिनी सूअरों से एक अलग मस्तिष्क-रीढ़ की हड्डी की तैयारी के लिए विकसित किया गया हैमोरिन-Surun एट अल। 26, मस्तिष्क आधारी धमनी के माध्यम से भरकर रखा जाता है और ताल बारहवीं कपाल तंत्रिका में दर्ज की गई है जिसमें से एड। एक और सीमा प्रयोग की अवधि है। तैयारी पहले से वर्णित शर्तों 6 में अधिक से अधिक 7 घंटे के लिए नहीं रखा जा सकता। इसलिए, इस तकनीक टैडपोल (देखें नीचे) से तैयारी प्रयोगशाला में 24 घंटा रखा गया है, भले ही लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है।

विभिन्न संशोधनों इस तकनीक को लागू किया जा सकता है। इधर, hypoxic चुनौती प्रदर्शन किया गया है, लेकिन अन्य गैस विविधताओं भी बोधगम्य हैं (उदाहरण के लिए।, Hypercapnia 27 के साथ ही पीएच विविधताओं 28)। उसी तरह, तैयारी दवाओं भंग कर दिया और एक पूर्व उपचार के रूप में 29 या 30 रिकॉर्डिंग के दौरान मस्तिष्क पर लागू किया गया है, जिसमें ACSF के साथ भरकर रखा जा सकता है। इस मामले में, ताल 29 त्वरित या डॉव धीमा किया जा सकताn 30 प्रयोगात्मक दवा के अनुसार। इसके अलावा, एक compartmented रिकार्डिंग कक्ष के साथ, अलग aCSF 9 नियोजित किया जा सकता तैयारी 6 और तापमान परिवर्तनों के चुनिंदा हिस्सों पर लागू किया जा सकता है। इस compartmentalization प्रोत्साहन प्रेरित प्रभाव में चयनित मस्तिष्क के हिस्सों के निहितार्थ के अध्ययन की अनुमति देता है। प्रस्तुत तकनीक नवजात चूहों का उपयोग करता है, यह भी अन्य जानवरों के मॉडल पर लागू होता है। चूहों के लिए आवेदन करने के लिए एक समान एक प्रोटोकॉल का उपयोग, चूहों पी 4 12 तक गर्भावधि दिन 16 (E16) से इस्तेमाल किया जा सकता है। मुख्य अंतर यह है कि विच्छेदन के दौरान aCSF गर्म और carbogen बुलबुला की जरूरत है। कछुओं, टैडपोल और वयस्क मेंढकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इन प्रजातियों ACSF की रचना करने के लिए अलग अलग विच्छेदन तकनीक के रूप में अच्छी तरह के रूप में समायोजन की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक, तैयारी और भी 31 से व्याख्यान चबूतरे चेहरे पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ युग्मित की इजाजत दी जा सकती हैएक साथ नेटवर्क उत्पादन में संकेत के दृश्य और इस नेटवर्क की एक विशेष सेल की गतिविधि। वोल्टेज संवेदनशील डाई इमेजिंग भी brainstem 32 के उदर चेहरे पर सक्रिय क्षेत्रों स्थानीयकरण करने के लिए नवजात चूहे brainstem-रीढ़ की हड्डी की तैयारी में लागू किया जा सकता है। तैयारी में ग FOS विश्लेषण भी विशिष्ट सांस की प्रतिक्रियाओं में शामिल तंत्रिका आबादी पहचान करने के क्रम में महसूस किया जा सकता है। अंत में, तैयारी इस तरह के अन्य शारीरिक लय 33 के साथ दिल 25, पसलियों 6, या शारीरिक धमनी छिड़काव के रूप में अन्य अंगों रखने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, ये बहुत महत्वपूर्ण संशोधनों अन्य विच्छेदन प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

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References

  1. Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
  2. Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
  3. Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
  4. Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
  5. Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
  6. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  7. Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
  8. Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
  9. Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
  10. Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
  11. Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
  12. Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
  13. Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. 165-201 (2007).
  14. Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
  15. Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  18. Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
  19. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
  20. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
  21. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
  22. Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
  23. Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
  24. Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
  25. Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502, (Pt 3), 623-639 (1997).
  26. Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
  27. Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
  28. Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
  29. Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
  30. Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
  31. Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
  32. Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
  33. St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).

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