Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

Neuroscience

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Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

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Abstract

Introduction

La respirazione è un complesso e vitale attività controllata dal cervello, permettendo diossigeno (O 2) e l'assorbimento di anidride carbonica (CO 2) eliminazione. Il drive respiratorio centrale è generato da una complessa rete situata nel tronco cerebrale in entrambi i mammiferi 1, 2 anfibi, rettili, uccelli 3 4 5 e pesci. Anche se lo studio di respirazione può essere elaborata in vivo, precise indagini meccanicistiche richiedono l'accesso diretto alla rete di controllo respiratorio. A tal fine, Adrian e Buytendijk sviluppato una ridotta preparazione pesci rossi, in cui elettrodi posti sulla superficie del tronco cerebrale record ritmo generato associato ventilazione gill 5. Questo approccio è stato in seguito adattato da Suzue nel 1984 6 per l'impiego nei roditori appena nati. L'avvento di questa preparazione ha portato a significativi progressi nella neurobiologia respiratoria. Poiché è relativamente semplice, la tecnica presentato here è suscettibile di una vasta gamma di ricerche di base di comportamenti motori ritmici e le loro origini nei roditori appena nati.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare il correlato neurale di attività inspiratoria, un ritmo respiratorio simile chiamato respirazione fittizia, prodotta dalla rete respiratoria. Questo metodo può essere impiegato in una vasta gamma di obiettivi di ricerca, puntando risposte inspiratori alle variazioni respiratorie o farmacologia in entrambi i selvatici tipo 7 e 8 animali transgenici. Dato che gli esperimenti vengono eseguiti a bassa temperatura, senza afferenti sensoriali, e in condizioni in cui le concentrazioni di glucosio e O 2 ai aCSF sono alti, questioni sono state sollevate per quanto riguarda la rilevanza fisiologica del segnale registrato. Mentre vi sono chiare differenze tra in vivo e in vitro condizioni (ad es., La frequenza di raffiche inspiratori) resta il fatto che la presenza digli elementi fondamentali della rete respiratoria 6 permettono di studiare un ritmo robusto associato ad una funzione omeostatica vitale 9,10.

La logica dietro lo sviluppo e l'utilizzo di questa tecnica è quello di facilitare l'accesso diretto agli elementi del tronco della rete respiratoria, che sono difficilmente accessibili in vivo, soprattutto nei neonati. Il tronco encefalico è posto in condizioni rigorosamente controllate: il ritmo registrato non è modulato da input afferenti periferici dai polmoni o gli organismi carotidei, permettendo lo studio di concentrarsi sul drive respiratorio centrale stessa 11. Così, questo accesso è utilizzato per applicare stimoli e registrare il segnale di uscita. In contrasto con pletismografia registrazioni, il ritmo respiratorio è modulata da tutti i suoi componenti in tutto il corpo (ad es., Distensione polmonare, chemosensori periferiche), rendendo difficile applicare stimoli precisi.

In unratto ewborn, il protocollo consiste nel registrare il quarto segnale ventrale root su un tronco isolato e midollo spinale troncato, mantenuto in fluido cerebrospinale artificiale (aCSF). Il ritmo generato dai preparativi del midollo spinale tronco-è composto da singole raffiche lenti che sono collegati al segnale inspiratorio 9. Isolato preparativi del midollo spinale tronco-sono facilmente registrabili in ratti da post-natale giorno 0-4 (P0 - P4) 7. Questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la risposta ipossica della rete respiratoria, e anche la risposta ai ipercapnia, acidosi o droghe. Un protocollo acuta all'ipossia è presentato qui. Questa stimolazione è ottenuto dal prelievo di O 2 nel aCSF; questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la tolleranza e la risposta agli insulti ipossici. Il protocollo induce una depressione ritmo dal primo minuto fino alla fine dell'esposizione ipossia (Figura 1) 12. Questa depressione è invertitadurante la post-ipossica 12 recupero. Per quanto riguarda il disegno sperimentale, è importante notare che il ponte, si trovano nella parte rostrale del tronco cerebrale, ha un'azione inibitoria sul generatore ritmo 8. Così, preparazioni di piena del tronco encefalico e del midollo spinale rostrale mostrano un ritmo inferiore. L'inclusione del ponte del campione isolata per la registrazione è determinato secondo il fine dell'esperimento 13; studio dell'influenza pontino sulla rete midollo allungato richiederebbe registrazioni con e senza il ponte di confrontare i risultati 14. Inoltre, uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di estendere la parte rostrale della preparazione per includere mesencefalico e / o regioni diencefaliche 15,16, che consenta di valutare l'effetto di queste regioni della rete respiratoria ponto-midollare.

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Protocol

Questo metodo richiede l'utilizzo di soggetti animali, consentite dalla Laval University comitato etico degli animali (protocollo # 2012-170).

1. Impostazione e preparazione

  1. Soluzioni
    1. Preparare soluzioni aCSF secondo le seguenti ricette 7,17. Altre ricette con variazioni di concentrazione sono disponibili in letteratura. Soluzioni memoria Stock a 4 ° C per un massimo di un mese.
      1. Soluzione salina: aggiungere 75,39 g di NaCl (129 mm finale); 2,5 g di KCl (3,35 mM finale); 0,81 g di NaH2PO4 (0,58 mM finale); 2,33 g di MgCl2 (1,15 mM finale); 1,85 g di CaCl2 (1,26 mM). Sciogliere in 800 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata.
      2. Soluzione di bicarbonato: aggiungere 17,65 g di NaHCO 3 (21 mm finale). Sciogliere in 900 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata. Variazioni della concentrazione di bicarbonato provocheranno variazioni di pH.
      3. Soluzione di glucosio: aggiungi 54.06g di glucosio (30 mM finale). Sciogliere in 400 ml di acqua distillata poi riempire a 500 ml con acqua distillata.
    2. Preparare aCSF diluendo 100 ml di soluzione salina, 100 ml di soluzione di bicarbonato, e 50 ml di soluzione di glucosio in 1 L di acqua distillata. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
    3. Preparare un elettrodo di vetro riscaldando e si estende un tubo di vetro fino a rompersi. Sand giù la punta prima dell'uso. L'elettrodo può essere riutilizzato molte volte finché rimane pulito.
  2. Setup sperimentale
    Nota: I dati di set-up sono presentati nella figura 2.
    1. Accendere l'amplificatore, averager, sistema di acquisizione dati, controllo della temperatura e della pompa in movimento. Controllare l'amplificazione del segnale (guadagno = 10.000), la filtrazione (soglia bassa, 10 Hz; soglia alta, 5 kHz), e la frequenza di campionamento della conversione da analogico a digitale del segnale grezzo (2,5 kHz).
    2. Riempire una bottiglia con aCSF e bolla con CarboGen (95% O 2 2). Inducono una bubbled- e riscaldato aCSF flusso nella camera di registrazione (volume 5 ml) a 4 ml / min. Mantenere la temperatura nella camera di registrazione a 26 (± 1) ° C. pH deve essere 7,4 in queste condizioni standard.
    3. Conservare 50 ml di RT e CarboGen-bolle aCSF in una siringa da 50 ml in prossimità della camera di dissezione.
    4. Accendere il computer e avviare il software di registrazione.

2. Dissection

  1. Pesare e determinare visivamente il sesso dell'animale (i maschi hanno un ano-genitale distanza più lunga, mentre le femmine hanno un breve tratto ano-genitale, i maschi genitali sono spesso oscuro mentre genitali femminili sono di colore rosa).
  2. Anestetizzare i roditori neonati da una delle seguenti opzioni: cryoanesthesia (immergere completamente l'animale in ghiaccio per 4 - 5 min 18), iniezione (equitensine a 4 ml / kg) 19 o inalazione di anestetici volatili (isoflurano 20 o etere 21). Confirm un piano adeguata di anestetici dall'assenza di un ritiro riflesso zampa.
  3. Posto l'animale in panchina, faccia ventrale giù. Sezione della parte rostrale della testa coronale con un bisturi a livello di bregma (visibile attraverso la pelle e il cranio). Eseguire questo passaggio subito dopo che l'animale è anestetizzato.
  4. Sezione coronale il corpo con un bisturi sotto i membri anteriori.
  5. Togliere la pelle, i muscoli, tessuti grassi e viscere con le forbici chirurgiche e sottili e pinze. Dal momento che le ossa sono morbidi a questa età, essere prudenti per non danneggiare il sistema nervoso. Eseguire questo passaggio in panchina.
  6. Posizionare la preparazione nella camera dissezione. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione. Da questo punto alla fine della registrazione, utilizzare un microscopio.
  7. Sulla faccia dorsale del preparato, tagliare il cranio e vertebre dal rostrale alla parte caudale lungo l'asse medio con forbici chirurgiche e sottili e pinze. Aprire il cranio taglioe vertebre, al fine di esporre il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF strored nella siringa per ossigenare la preparazione.
  8. Con le pinze, rimuovere la membrana aracnoidea, un sottile tessuto che ricopre la superficie del tessuto nervoso. Conservare la pia madre e vasi sanguigni contro il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione.
  9. Posizionare la preparazione con il dorso rivolto verso il basso, e con attenzione abbassare il tronco encefalico e del midollo spinale tagliando i nervi e tessuto connettivo con le forbici mentre si tiene la preparazione sul posto. Un approccio dorsale è anche possibile. Mantenere le radici e nervi più a lungo possibile. Togliere le ossa per isolare il tronco encefalico e del midollo spinale. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione.
  10. Rimuovere il cervelletto e rimanendo strutture rostrali da loro sezionamento con il bisturi. Utilizzare il aCSF memorizzato nel ago per ossigenare preparazione.
  11. Opzionalmente seconda sperimenprogettazione tal, rimuovere il ponte con il bisturi da una sezione anteriore coronale alla inferiore arteria cerebellare 22. Notare che mantenendo tutta ponte rallenterà il ritmo in ratti e completamente inibirla in topi. Preparazioni che includono solo la parte caudale del ponte mostrano una attività respiratoria simile con una frequenza stabile alla radice C4.

3. Registrazione

  1. Mettere il preparato in camera di registrazione, ventrale a faccia in su. Fissare la preparazione con perni nella parte più bassa del midollo spinale e rostrale-maggior parte del tronco cerebrale.
  2. Utilizzando una siringa collegata all'elettrodo dal suo ago, indurre una depressione nell'elettrodo (diametro punta di vetro: 150 - 225 micron) tirando il pistone della siringa, per riempire parzialmente l'elettrodo con aCSF.
  3. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare accuratamente l'elettrodo vicino ad una delle quarte radici ventrali. Altre radici ventrali potrebbero anche presentare una delle vie respiratorie come l'attività (e.g., XII nervo cranico, C1 radice ventrale).
  4. Inducono una depressione nel serbatoio dell'elettrodo tramite la siringa estraendo lo stantuffo per aspirare delicatamente il rootlet nervo. Quindi spostare accuratamente l'elettrodo di applicare contro il midollo spinale.
    Nota: Idealmente la dimensione del rootlet corrisponde alla dimensione dell'apertura elettrodo e crea una tenuta tra i compartimenti interni ed esterni dell'elettrodo così. Poiché gli amplificatori differenziali sono comunemente utilizzati per tali registrazioni, ogni apertura tra l'interno dell'elettrodo e la camera di registrazione riduce la qualità del segnale e rende difficile per eliminare il rumore di fondo.
  5. Avviare la registrazione.
  6. Registra il ritmo prodotto dalla preparazione in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con CarboGen: 95% O 2 e 5% CO 2) per almeno 20 minuti per determinare i parametri di base della preparazione.
  7. Passare la perfusione da CarboGen-bolle aCSF astimolo aCSF (cioè, con il 95% gorgogliare N 2 e 5% di CO 2 per ipossia stimolo) per 15 min. Alter durata dell'esposizione a seconda del protocollo sperimentale. Registrare la durata dell'esposizione sulla registrazione degli animali e scheda tecnica. Utilizzare tubi in acciaio inossidabile tra il flacone e la camera aCSF quando possibile per evitare la diffusione di gas verso l'esterno del tubo.
  8. Accendere la perfusione torna a aCSF CarboGen-bolle standard per almeno 15 minuti per una registrazione di recupero. Registrare questo sulla registrazione degli animali e scheda tecnica.
  9. Terminare la registrazione.

4. Analisi statistica

  1. Dal segnale integrato, calcolare la frequenza del numero di burst per minuto (espressa in burst / min), l'ampiezza come differenza tra la linea di base e il picco del burst (espressa in mV), la durata di scoppio della durata da l'inizio e la fine del burst (espresso in s), l'area di scoppio come l'area sotto la curve del burst sul segnale integrato (espressa in mV · s) (Figura 3).
  2. Calcolare la frequenza, ampiezza, durata scoppiare e zona scoppiare sotto normossia (baseline), ipossia (stimolo) e post-ipossia condizioni (post-stimolo) di recupero come la media degli ultimi 5 minuti delle registrazioni per ogni condizione. Non analizzare la prima porzione di ciascuna condizione perché c'è un ritardo tra l'accensione e perfusione aCSF omogeneizzazione nella camera di registrazione.
  3. Express poi stimolo (cioè, ipossia) e post-stimolo (cioè, dopo ipossia) valori di recupero come percentuale dei valori di base per la registrazione corrispondente. Esprimere i risultati come media ± SD

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Representative Results

Come accennato nell'introduzione, uno dei vantaggi più importanti di questa tecnica è l'accesso diretto al tronco cerebrale applicare vari stimoli. Come esempio, ipossia stato applicato qui. Figura 1. AB mostra una registrazione completa protocollo, con entrambe le condizioni normossia e ipossia. Figura 1.CE visualizza il ritmo registrata in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con 95% O 2 e 5% CO 2 a 26 ° C). Come già illustrato in questo esatto di preparazione 11, la frequenza è di circa 8 burst / min, e l'ampiezza è circa 0,800 mV. Si noti che l'ampiezza è solo indicativo per le sue importanti variazioni inter-preparazione. La traccia superiore rappresenta il segnale integrato mentre la traccia inferiore rappresenta il segnale grezzo. Figura 1.DF visualizza il ritmo registrato in condizioni di ipossia (es., ACSF gorgogliare con il 95% N 2 e 5% CO <sub> 2 a 26 ° C). Come precedentemente caratterizzato 23, la frequenza è diminuita drasticamente durante l'ipossia. Figura 1.GH mostra un'unica sequenza che mostra modelli tipici in condizioni di ipossia e normossia.

Figura 1
Figura 1. Esempi di registrazioni Ottenuto da Preparativi Cord Brainstem-spinali. Uscita respiratoria registrato dalla radice ventrale C4 di preparati da ratti P4 sotto normossia, ipossia e le condizioni di recupero post-ipossia ((A) segnale integrato e (B) segnale grezzo) . Per ogni condizione, registrazioni ingranditi ((C) integrati segnale normossiche; (D) Segnale ipossico integrato; (E) del segnale normossiche crudo; (F) Segnale ipossico prima) e un'unica sequenza ((G) scoppio normossichee (H) ipossico burst) sono mostrati. Come già detto nel testo, si ricorda che l'ampiezza deve essere interpretata con cautela. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Schema riepilogativi del Setup. Il aCSF gorgogliare è riscaldata e inviato da una pompa in camera di registrazione. aCSF eccesso nella camera di registrazione viene aspirato da una pompa e smaltiti. La camera di controllo è collegato a terra e il regolatore di temperatura. L'uscita dell'elettrodo viene direttamente trasmesso all'amplificatore, poi al averager mobile e il sistema di acquisizione dati, e infine il computer. Prego qui to visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. analizzati parametri Burst. La frequenza è calcolato come numero di burst per minuto (espressa in burst / min), l'ampiezza come differenza tra la linea di base e il picco del burst (espressa in mV), la durata di scoppio la durata dall'inizio alla fine del burst (espresso in s), l'area di scoppio come l'area sotto la curva del burst sul segnale integrato (s espressa in mV ·). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Quantificazione accurata dell'attività respiratoria può essere impegnativo. Infatti, la respirazione è una funzione che può essere sia automatica e volontaria, e che è modulata in base all'ambiente, le esigenze del corpo, lo stato emotivo ed il comportamento. Il vantaggio di questa tecnica è l'isolamento degli elementi neurali responsabili della produzione del comando respiratoria. Così, registrazioni elettrofisiologiche di preparati midollo spinale e tronco-pletismografia sono tecniche complementari per studiare l'intera rete respiratoria neuronale in vitro e in vivo, rispettivamente. Patch-clamp nella preparazione cavo tronco-spinale (ad es., Si avvicina dalla superficie ventrale) sono concepibili e permettono lo studio di un particolare neurone in una rete respiratoria conservato 24.

Questo protocollo include alcune fasi critiche, soprattutto nel dissezione. Al fine di evitare danni ai tessuti nervosi,tutte le operazioni devono essere eseguite dissezione rapidamente e con precisione. Il tessuto nervoso non deve essere danneggiato e attentamente conservata per immersione costante in aCSF. Come accennato in precedenza, la qualità del collegamento tra il rootlet nervi e l'elettrodo è un secondo passo fondamentale. L'aspirazione del rootlet può portare l'elettrodo vicino al preparato. Mentre il contatto tra l'elettrodo e il tronco cerebrale può migliorare la qualità del sigillo, si deve evitare di fare una depressione o danneggiare fisicamente la preparazione.

Il segnale integrato deve sempre essere utilizzato per l'analisi, ma segnali grezzi può essere utile per differenziare scoppia corrette dal rumore di fondo. Inoltre, un altoparlante può essere aggiunto alla configurazione di ascoltare il ritmo e determinare la qualità del segnale e rumore presente dal provino sfondo. In effetti, alcune variazioni in background linea di base potrebbero essere presenti a causa di interferenze elettriche e la causa di una linea di base instabile. Tale INTERFerenze dovrebbe essere impedito controllando i collegamenti dei cavi e la radice aspirazione dall'elettrodo. Inoltre, in quanto l'ampiezza raffica dipende sia rumore di fondo e la connessione tra la radice e l'elettrodo, frequenza è una più di un parametro affidabile. Così, l'ampiezza scoppio deve sempre essere espressa come percentuale di valori basali per evitare inter-individuali variazioni dovute alla configurazione.

Limiti della tecnica sono determinate dalla età dell'animale da cui preparazione può essere realizzato. Questo permette uno studio preciso della creazione del drive respiratorio centrale, al momento della nascita, che è molto interessante e clinicamente rilevante, ma si concentra su questi primi secoli e non può essere estesa ad epoche successive. Età più avanzata possono essere utilizzati in arteriosa perfuse di lavoro preparati cuore-tronco encefalico 25, ma con sostanziali modifiche del protocollo (vedi sotto). Un isolato tronco cerebrale-spinale preparazione spinale da cavie adulte è stato lo sviluppocato da Morin-SuRun et al. 26, in cui il tronco è perfuso attraverso l'arteria basilare e il ritmo viene registrato nel nervo craniale XII. Un'altra limitazione è la durata dell'esperimento. La preparazione non può essere mantenuto per più di 7 ore nelle condizioni descritte in precedenza 6. Pertanto, questa tecnica non è appropriato per esperimenti a lungo termine, anche se i preparativi da girini (vedi sotto) sono stati tenuti 24 ore in laboratorio.

Varie modifiche possono essere applicati a questa tecnica. Qui, sfida ipossico è stata eseguita, ma altre varianti di gas sono anche ipotizzabile (ad es., Ipercapnia 27 così come le variazioni di pH 28). Allo stesso modo, la preparazione può essere perfusi con aCSF in cui farmaci sono stati disciolti e applicato sul tronco cerebrale come pre-trattamento 29 o 30 durante la registrazione. In questo caso, il ritmo può essere accelerato o rallentato 29 Down 30 secondo il farmaco sperimentale. Inoltre, con una camera di registrazione scomparti, diverso aCSF può essere applicato sulle parti selettivi di preparati 6 e variazioni di temperatura 9 possono essere impiegati. Questa compartimentazione consente lo studio dell'implicazione delle parti tronco selezionati gli effetti di stimolo-indotta. Mentre la tecnica presentata utilizza ratti neonati, è applicabile su altri modelli animali anche. Utilizzando un protocollo simile a quello applicato per i ratti, i topi possono essere utilizzati a partire dal giorno di gestazione 16 (E16) fino a 12 P4. La differenza principale è la necessità di riscaldare e CarboGen-bolla aCSF durante la dissezione. Tartarughe, girini e rane adulte possono anche essere usati; tuttavia, queste specie richiedono diverse tecniche di dissezione e rettifiche alla composizione del aCSF.

Questa tecnica può anche essere accoppiato con patch-clamp sulla faccia rostrale della preparazione 31, consentendovisualizzazione simultanea del segnale in uscita della rete e l'attività di una particolare cella di questa rete. Tensione di imaging colorante sensibile può essere applicato anche in ratto neonato preparazioni cavo tronco-spinale per localizzare le aree attivate sulla faccia ventrale del tronco cerebrale 32. c-fos analisi nelle preparazioni può essere realizzato anche per identificare le popolazioni neurali coinvolti nelle risposte respiratori specifici. Infine, la preparazione può essere modificato per tenere altri organi quali il cuore 25, nervature 6, o fisiologico perfusione dell'arteria con altri ritmi fisiologici 33. Tuttavia, questi molto importanti modifiche richiederebbero altri protocolli di dissezione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

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References

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